우울증에서 히스톤 탈아세틸화효소(HDACs)에 대한 연구는 광범위하게 수행되었으나 HDAC1에 대한 연구는 상대적으로 부족했습니다. 이에 본 연구는 우울증에서 HDAC1/마이크로RNA(miR)-124-5p/신경펩타이드 Y(NPY) 축의 메커니즘을 규명하고자 수행되었습니다. Sprague Dawley 쥐에 만성 예측 불가능한 경도 스트레스(CUMS)를 가하여 우울증 모델을 수립했습니다. 우울증 쥐에 HDAC1 억제 또는 miR-124-5p 억제 렌티바이러스를 주입하여 체중, 학습 및 기억 능력, 혈청 내 산화 스트레스와 염증, 해마 조직 내 신경전달물질 발현에서의 역할을 탐구했습니다. 해마에서 miR-124-5p, HDAC1, NPY 발현을 측정하고 이들 간의 상호작용을 확인했습니다. 우울증 쥐의 해마에서 miR-124-5p와 HDAC1 발현은 높았고 NPY 발현은 낮았습니다. miR-124-5p 억제 또는 HDAC1 억제는 우울증 쥐의 학습 및 기억 능력을 개선하고 체중을 증가시켰습니다. miR-124-5p 녹다운 또는 HDAC1 억제는 산화 스트레스와 염증을 억제하고 우울증 쥐의 신경전달물질 발현을 촉진했습니다. HDAC1은 miR-124-5p를 매개하여 NPY를 조절했습니다. NPY 녹다운은 억제된 miR-124-5p가 우울증 쥐에 미치는 보호 효과를 소멸시켰습니다. 본 연구는 miR-124-5p 또는 HDAC1 억제가 NPY를 상향 조절하여 우울증 쥐의 기억과 학습 능력을 개선함을 보여주며, 이는 우울증에 대한 기존 지식을 업데이트하고 우울증 치료에 대한 새로운 참고자료를 제공할 수 있습니다.
우울증은 전 세계적으로 심각한 경제적 부담과 사회적 결과를 초래하는 심각한 장애 정신병입니다. 우울증은 환자의 전반적인 건강을 위협하는 생리적, 인지적, 행동적 변화를 특징으로 합니다. 케타민의 속효성 항우울제로서의 적용과 신경 세포 아형 집단의 활성을 선택적으로 조절할 수 있는 장비의 개선으로 우울증 치료법이 발전해 왔습니다. 또한 탄소 나노입자 같은 다재다능한 나노구조물이 신경학적 장애에 적용 가능합니다. 그러나 부적절한 우울증 치료는 수행 능력 저하, 행동 기능 장애, 신체 질환, 약물 남용, 심지어 자살로 이어질 수 있습니다. 따라서 우울증 치료를 위한 혁신적인 약제 발굴이 절실합니다.
이전에 우울증과 항우울제에서 혈장 내 miR-124 수치가 상승함이 보고되었습니다. CUMS 유도 우울증에서 해마의 miR-124 발현은 동적 변화를 보이며 우울증의 각 단계에서 다양한 병리적 변화를 나타냅니다. 또한 miR-124는 주요 우울 장애에서 우울 유사 행동을 개선할 후보 물질입니다. miR-124 억제는 전전두엽 피질에서 항우울제 역할을 하며 쥐의 우울 유사 행동을 완화시킵니다. 히스톤 탈아세틸화효소 1(HDAC1)은 miR-124의 매개체로 전사 조절과 후성유전적 수정을 위한 다중 단백질 복합체를 형성합니다. HDAC1 활성 손상이 주요 우울 장애에서 회복력을 증진시킨다는 것이 알려져 있습니다. 또한 뇌에서 HDAC1 억제는 기분 장애와 기타 신경가소성 변화 뇌 질환을 개선할 수 있습니다. HDAC 억제제는 불안 유사 행동과 알코올 음주 행동을 완화하고 NPY 발현을 증가시킬 수 있습니다. 또한 HDAC 활성 손상은 편도체 중심핵과 내측핵에서 NPY 발현을 증가시킬 수 있습니다. NPY는 불안, 사회 장애, 우울 증상을 예방하는 데 충분한 시상하부 식욕 촉진 신경펩타이드입니다. 게다가 NPY와 그 수용체는 지질다당류 유도 우울증 쥐 모델에서 항염증 및 항우울 효과가 있음이 입증되었습니다. 종합하면 HDAC1/miR-124-5p/NPY 축의 우울증에서의 복합적 상호작용은 불분명합니다. 따라서 본 연구는 이 축의 메커니즘을 발굴하여 우울증 치료 후보를 탐색하고자 합니다.
본 연구에 포함된 동물 실험은 하얼빈 의과대학 제1부속병원 실험동물 윤리 요건을 준수했습니다. 실험은 실험동물 사육 조건을 개선하고 사용 동물 수를 줄이며 동물 고통을 경감하도록 최적화되었습니다.
특정 병원체 무감염(SPF) 등급의 Sprague-Dawley(SD) 수컷 쥐(체중 200~220g)를 하얼빈 의과대학 제1부속병원 동물연구센터에서 공급받았습니다. 쥐는 SPF 등급 환경(22~24°C, 습도 60~64%, 12시간 주야 교체)에서 사육되었습니다. 모델링 기간과 기타 특정 시점을 제외하고 쥐는 자유롭게 물과 먹이를 섭취했습니다.
모델링된 쥐를 8그룹(n=10)으로 무작위 배정했습니다: 정상군(처리 없음), CUMS군(CUMS 유도 우울증 쥐), sh-NC군(CUMS 유도 우울증 쥐에 sh-HDAC1 렌티바이러스 NC 주입), sh-HDAC1군(CUMS 유도 우울증 쥐에 sh-HDAC1 렌티바이러스 주입), anti-miR-NC군(CUMS 유도 우울증 쥐에 anti-miR-124-5p 렌티바이러스 NC 주입), anti-miR-124-5p군(CUMS 유도 우울증 쥐에 anti-miR-124-5p 렌티바이러스 주입), anti-miR-124-5p + sh-NC군(CUMS 유도 우울증 쥐에 anti-miR-124-5p 렌티바이러스와 sh-NPY 렌티바이러스 NC 주입), anti-miR-124-5p + sh-NPY군(CUMS 유도 우울증 쥐에 anti-miR-124-5p 렌티바이러스와 sh-NPY 렌티바이러스 주입).
CUMS 유도 우울증 쥐 모델은 Willner 방법으로 수립했습니다. 정상군의 쥐는 자극 없이 먹이와 물을 섭취했고, 나머지 7개 그룹의 쥐는 독립된 케이지에서 35일간 CUMS를 받았습니다. 이 쥐들은 4°C 얼음물 수영 5분(수심 30cm), 주야 반전(낮 12시간 암실, 밤 12시간 백열등 조명), 삼키기 꼬리 집게로 30초 꼬리 압박, 1분 흔들기, 24시간 금식 및 수분 박탈, 30분 초음파 자극(50Hz), 젖은 깔개, 17°C 에어컨 등 자극을 매일 무작위로 하나씩 받았으며, 같은 자극은 총 5회를 초과하지 않게 했습니다.
쥐를 2% 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg)으로 마취하고 양측 해마(전후 직경 4.8mm, 좌우 거리 ±2.5mm, 후두와 전두간 거리 -3.5mm)에 해밀턴 미세주사기와 26G 바늘로 1μL/min 속도로 렌티바이러스를 주입했습니다. 바늘을 주입 부위에 5분간 유지하여 역류를 방지했습니다. 두개골을 뼈 왁스로 밀봉하고 절개부를 봉합한 후 7일간 회복시켰습니다. sh-HDAC1 렌티바이러스와 그 NC, anti-miR-124-5p 렌티바이러스와 그 NC, sh-NPY와 그 NC(역가: 10⁸ TU/mL)는 중국 GenePharma Co. Ltd.(상하이)에서 구입했습니다.
CUMS 모델링 전날(0일), 모델링 후(36일), 렌티바이러스 간섭 후(52일)에 쥐 체중을 측정했습니다.
개장 검사(OFT)는 새로운 환경에서 쥐의 자율 및 탐색 행동을 감지하여 우울 행동을 평가하는 데 널리 사용됩니다. 이 검사는 비디오 추적 시스템이 설치된 검은 나무 개장 상자(100cm × 100cm × 50cm)에서 수행했습니다. 상자 바닥을 흰 선으로 25개 격자(20cm × 20cm)로 나누었습니다. 쥐를 미리 정해진 무작위 순서로 중앙 격자에 놓고 격자 횡단 횟수(사지 또는 양쪽 앞다리와 한 쪽 뒷다리로 격자 진입)와 일어서기 횟수(앞다리를 들고 한 쪽 뒷다리로 직립)를 비디오 추적 시스템으로 기록했습니다. 조용하고 어두운 실내 환경에서 수행했으며, 매 검사 후 75% 알코올로 상자를 세척하여 냄새를 제거했습니다.
쾌감 상실은 우울증의 핵심 증상 중 하나입니다. 자당 선호도 검사(SPT)는 쥐의 우울 유사 행동을 평가할 수 있습니다. SPT 전 각 쥐에게 2병의 설탕물(1% 자당, w/w)을 24시간 제공하고, 다시 1병의 멸균수와 1병의 설탕물을 24시간 제공했습니다. 이후 23시간 금식 및 수분 박탈 후 1병의 멸균수와 1병의 설탕물(1% 자당)을 30분간 자유롭게 마시게 했습니다. 1시간 후 두 병 위치를 바꿔 다시 30분간 자유롭게 마시게 했습니다. 이 1시간 동안 멸균수와 설탕물 소비량(mL)을 측정하여 자당 선호도 백분율(SPP)을 계산했습니다. SPP = 설탕물 소비량/(설탕물 소비량 + 멸균수 소비량) × 100%.
모리스 물미로 검사(MWM)는 쥐의 공간 학습 및 기억 능력을 평가하는 데 널리 사용됩니다. MWM 검사는 직경 150cm, 높이 60cm의 원형 수조(수심 40cm)에서 수행했습니다. 수온을 22±1°C로 유지하고 무독성 세척 용이 염료로 물을 검게 염색했습니다. 수조와 수면을 밝은 색상과 특수 모양의 아이콘으로 장식된 4사분면(SE, SW, NW, NE)으로 나누었습니다. 목표 플랫폼은 직경 11cm의 투명한 원형 플랫폼으로 NE 사분면 중앙에 위치하며 수면 아래 1.5cm에 잠겨 있습니다. 수조 중심 위에 비디오 추적 시스템을 설치하여 수영 속도, 경로, 목표 플랫폼 도달 시간과 사분면 내 체류 시간을 기록했습니다. 쥐를 4개 사분면에서 무작위 순서로 물에 넣고 60초 내에 목표 플랫폼을 탐색하여 올라오게 했습니다. 플랫폼 도달 시간을 탈출 잠복기로 기록했습니다. 60초 내 플랫폼에 오르지 못하면 유도하고 탈출 잠복기를 60초로 기록했습니다. 각 검사 후 쥐를 목표 플랫폼에 15초간 머물게 하고 하루 4회, 5일간 훈련했습니다. 최종 탈출 잠복기는 3~5일차 평균값으로 했습니다. MWM 검사 6일째 공간 탐색 검사를 수행했습니다. 목표 플랫폼을 수조에서 제거하고 쥐를 SW 사분면에서 물에 넣었습니다. 60초 내 NE 사분면에서 수영한 시간을 공간 탐색 시간으로 기록했습니다.
본 실험의 타임라인은 Fig. 1에 나타냈습니다.
본 연구의 연대기
마지막 MWM 검사 다음 날, 쥐를 안락사시키고 복강 내 2% 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg)을 주입했습니다. 흉강을 열어 주사기로 심장 혈액을 채취하고 3500r/min에서 15분간 3회 원심분리하여 상청액을 -20°C에 보관했습니다. 혈액 채취 후 좌심실에서 대동맥으로 카테터를 삽입하고 500mL 생리식염수로 전신 혈액을 세척했습니다. 해마 조직을 분리하여 1.5mL 원심분리관에 넣고 무게를 측정한 후 -80°C에 보관했습니다. 해마 일부를 4% 파라포름알데히드로 2시간 고정하고 농도별 자당으로 탈수 후 파라핀에 포매했습니다.
혈청을 재가온하여 초산화물 디스무타아제(SOD), 말론디알데히드(MDA), 글루타치온(GSH), 인터루킨(IL)-β, 종양괴사인자-α(TNF-α), 일산화질소(NO) 농도를 측정했습니다. SOD, MDA, GSH 검출 키트는 중국 베이징 Beyotime Institute of Biotechnology에서, IL-β, TNF-α, NO 검출용 ELISA 키트는 중국 난징 NanJing JianCheng Bioengineering Institute에서 구입했습니다.
파라핀 절편을 탈랍, 에탄올로 수화, 증류수로 세척 후 헤마톡실린 염색액으로 20분 염색했습니다. 수돗물로 절편이 파랗게 변할 때까지 세척했습니다. 1% 에탄올 염산 용액에 10초 담근 후 수돗물로 세척하고 에탄올로 탈수했습니다. 에오신으로 2분 염색, 고농도 알코올로 탈수, 자일렌으로 투명화했습니다. 마지막으로 봉입하고 생물현미경으로 관찰했습니다.
해마 조직을 칭량하고 생리식염수(100μL/10mg)에서 초음파로 균질화했습니다. 균질액을 4°C에서 30분 방치 후 12,000rpm(4°C)에서 3분 원심분리하여 상청액을 수집했습니다. 상청액 단백질 농도는 BCA 단백질 검출 키트(CWBIO, 베이징)로 측정하고 노르에피네프린(NE), 세로토닌(5-HT), 도파민(DA) 발현 수준을 ELISA 키트로 측정했습니다. NE, 5-HT, DA ELISA 키트는 중국 베이징 Liweiping Biotechnology Co., Ltd.에서 제공받았습니다.
해마 조직에서 RNA 추출 키트(Promega, Madison, WI, USA)로 RNA를 추출하고 자외선 분광광도계로 농도와 순도를 측정했습니다. 역전사 키트 지침(DRR047S, Takara, Dalian, China)에 따라 RNA를 상보적 DNA(cDNA)로 역전사했습니다. mRNA는 GoldScript one-step RT-PCR Kit(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)로, miRNA는 Hairpin-it™ miRNA 정량 검출 키트(GenePharma)로 cDNA로 역전사했습니다. RT-qPCR 검출 키트(Promega)로 조직 내 HDAC1, miR-124-5p, NPY 발현을 측정했습니다. miR-124-5p의 내부 대조군은 U6, HDAC1과 NPY는 β-actin을 사용했습니다. PCR 프라이머는 중국 상하이 Sangon Biotech Co., Ltd.에서 구입했습니다(Table 1). 표적 유전자의 상대적 발현은 2^(-ΔΔCt) 법으로 계산했습니다.
해마 조직을 얼음 위에서 절단하고 RIPA lysis buffer(Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd., 베이징)로 용해하여 단백질을 추출했습니다. 단백질 농도는 BCA 법으로 측정했습니다. 총 단백질 50μg에 5× SDS 로딩 버퍼를 1:4로 첨가하고 끓는 물에서 5분 가열했습니다. SDS-PAGE 전기영동 후 막으로 전이하고 5% 탈지분유로 1시간 차단했습니다. 1차 항체(HDAC1 1:1000, Cell Signaling Technology; NPY 1:800, NeoMakers; β-actin 1:1000, Abcam)로 오버나이트 반응시키고 과산화효소 표지 2차 항체로 재탐침했습니다. 향상된 화학발광으로 현상하고 Quantity One 회색 분석 소프트웨어로 광학 밀도를 계산했습니다. 표적 유전자 단백질 발현은 β-actin 회색 값에 대한 회색 값 비율로 나타냈습니다.
ChIP 분석은 EZ-ChIP 키트(Millipore, Bedford, MA, USA) 지침에 따라 수행했습니다. HEK293T 세포를 1% 포름알데히드로 10분 처리하고 글리신으로 중단했습니다. 2000rpm에서 5분 원심분리 후 SDS Lysis Buffer로 초음파 처리했습니다. 4°C에서 10,000g으로 10분 원심분리 후 세포(100μL)에 900μL ChIP Dilution Buffer, 20μL 50× PIC, 60μL ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA를 첨가하여 4°C에서 1시간 반응시키고 10분 방치했습니다. 침전물을 700rpm에서 1분 원심분리하고 20μL를 input으로 사용했습니다. 한 튜브에는 HDAC1 항체(1μL)와 면역글로불린 G 항체를, 다른 튜브에는 항체 없이 첨가했습니다. 두 튜브 시료를 오버나이트 배양 후 용출 및 탈교차결합했습니다. DNA 회수 후 RT-qPCR로 검사했습니다.
생물정보학 웹사이트(https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/)로 miR-124-5p와 NPY의 결합 부위를 분석했습니다. NPY-wild type(WT)과 NPY-mutant(MUT) 플라스미드를 중국 베이징 Huayueyang Biotechnology Co., Ltd.에서 제작했습니다. mimic NC 또는 miR-124-5p mimic와 플라스미드를 HEK293T 세포에 공동 형질주입했습니다. 세포 루시페라제 활성을 루시페라제 검출 키트(BioVision)와 Glomax20/20 luminometer(Promega)로 측정했습니다.
SPSS 21.0(IBM Corp. Armonk, NY, USA)으로 데이터 분석을 수행했습니다. 결과는 평균 ± 표준편차로 나타냈습니다. 두 그룹 간 비교는 t-검정, 다중 그룹 비교는 일원분산분석(ANOVA) 후 Tukey 사후 검정으로 쌍별 비교했습니다. P는 양측 검정을 나타내며 P<0.05를 통계적 유의성 기준으로 삼았습니다.
CUMS 모델링 전날(0일), 모델링 종료 다음 날(36일), 렌티바이러스 간섭 7일 후(52일)에 쥐 체중을 측정했습니다. 모델링 전 각 그룹 쥐 체중엔 차이가 없었습니다(모든 P>0.05). 모델링 후 CUMS군, sh-NC군, sh-HDAC1군, anti-miR-NC군, anti-miR-124-5p군이 정상군 대비 체중 감소(모든 P<0.05). CUMS군, sh-NC군, sh-HDAC1군, anti-miR-NC군, anti-miR-124-5p군 간 체중 차이는 없었습니다(모든 P>0.05). 간섭 후 CUMS군이 정상군 대비 체중 감소(모든 P<0.05). CUMS군, sh-NC군, anti-miR-NC군 간 체중 차이 없었습니다(모든 P>0.05). sh-HDAC1군과 anti-miR-124-5p군이 각 NC군 대비 체중 증가(모두 P<0.05), 즉 HDAC1 또는 miR-124-5p 억제가 우울증 쥐 체중을 증가시킴을 나타냅니다(Fig. 2a).
HDAC1 또는 miR-124-5p 억제가 우울증 쥐의 체중을 증가시키고 학습 및 기억 능력을 개선한다. a HDAC1 또는 miR-124-5p 억제가 우울증 쥐 체중에 미치는 영향; b HDAC1 또는 miR-124-5p 억제 전후 SPP; c HDAC1 또는 miR-124-5p 억제 전후 OFT 격자 횡단 빈도; d HDAC1 또는 miR-124-5p 억제 전후 OFT 일어서기 횟수; e HDAC1 또는 miR-124-5p 억제 전후 MWM 탈출 잠복기; f HDAC1 또는 miR-124-5p 억제 전후 MWM 공간 탐색 시간; n=10; a P<0.05 vs 정상군; b P<0.05 vs sh-NC군; c P<0.05 vs anti-miR-NC군. 다중 그룹 비교는 일원 ANOVA, 쌍별 비교는 Tukey 사후 검정
SPT, OFT, MWM 검사로 SPP, 격자 횡단 빈도, 일어서기 횟수, 탈출 잠복기, 공간 탐색 시간을 측정했습니다. 간섭 전 정상군 대비 CUMS군, sh-NC군, sh-HDAC1군, anti-miR-NC군, anti-miR-124-5p군에서 SPP, 격자 횡단 빈도, 일어서기 횟수, 공간 탐색 시간 감소, 탈출 잠복기 연장(모든 P<0.05), 쥐에서 우울 유사 행동 발현을 시사합니다. CUMS군, sh-NC군, sh-HDAC1군, anti-miR-NC군, anti-miR-124-5p군 간 SPP, 격자 횡단 빈도, 일어서기 횟수, 공간 탐색 시간, 탈출 잠복기 차이 없었습니다(모든 P>0.05). 간섭 후 sh-NC군과 anti-miR-NC군 대비 sh-HDAC1군과 anti-miR-124-5p군에서 SPP, 격자 횡단 빈도, 일어서기 횟수, 공간 탐색 시간 증가, 탈출 잠복기 단축(모든 P<0.05). CUMS군, sh-NC군, anti-miR-NC군 간 SPP, 격자 횡단 빈도, 일어서기 횟수, 공간 탐색 시간, 탈출 잠복기 차이 없었습니다(모든 P>0.05), HDAC1 침묵 또는 miR-124-5p 억제가 쥐의 우울 유사 행동을 완화하고 학습 및 기억 능력을 개선함을 시사합니다.
HE 염색으로 해마 병변 관찰(Fig. 3a) 결과, 정상군 쥐 해마 뉴런은 정돈되어 배열되고 형태가 명확하며 구조가 정상이고 층이 조밀하며 세포핵이 명확하고 핵소가 뚜렷했습니다. CUMS군 쥐 뉴런은 위축되고 수가 감소했으며 느슨하게 배열되고 크로마틴 분포가 불균일하며 층이 얇아졌습니다. sh-NC군과 anti-miR-NC군 쥐도 CUMS군과 같은 상황이었습니다. sh-HDAC1군과 anti-miR-124-5p군 쥐는 각 NC군 대비 뉴런이 정돈되어 증가하고 손상이 완화되었습니다. HDAC1 녹다운 또는 miR-124-5p 억제가 우울증 쥐의 해마 병변을 완화함을 나타냅니다.
HDAC1 또는 miR-124-5p 억제가 우울증 쥐의 병리적 해마 손상을 완화하고 신경전달물질 발현을 상향 조절한다. a 우울증 쥐 해마 병변 HE 염색; b 해마 조직 NE 발현 ELISA; c 해마 조직 5-HT 발현 ELISA; d 해마 조직 DA 발현 ELISA; n=6; a P<0.05 vs 정상군; b P<0.05 vs sh-NC군; c P<0.05 vs anti-miR-NC군. 다중 그룹 비교는 일원 ANOVA, 쌍별 비교는 Tukey 사후 검정
우울증은 뇌 신경전달물질 장애와 관련됩니다. 따라서 쥐 해마의 DA, NE, 5-HT 신경전달물질 수준을 ELISA로 측정했습니다. 결과(Fig. 3b-d)에 따르면 정상군 대비 CUMS군, sh-NC군, sh-HDAC1군, anti-miR-NC군, anti-miR-124-5p군에서 DA, NE, 5-HT 수준 감소(모든 P<0.05). CUMS군, sh-NC군, anti-miR-NC군 간 신경전달물질 발현 차이 없었습니다(모든 P>0.05). sh-NC군과 anti-miR-NC군 대비 sh-HDAC1군과 anti-miR-124-5p군 쥐에서 DA, NE, 5-HT 수준 증가(모든 P<0.05), HDAC1 하향 조절 또는 miR-124-5p 감소가 우울증 쥐 해마의 DA, NE, 5-HT 수준을 상향 조절할 수 있음을 시사합니다.
혈청 내 산화 스트레스 관련 및 염증 인자 발현을 측정했습니다. 정상군 대비 다른 우울증 모델 그룹에서 SOD와 GSH 활성 저하, MDA, IL-1β, TNF-α, NO 수준 증가(모든 P<0.05). CUMS군, sh-NC군, anti-miR-NC군 간 SOD, GSH 활성, MDA, IL-1β, TNF-α, NO 수준 차이 없었습니다(모든 P>0.05). sh-NC군과 anti-miR-NC군 대비 sh-HDAC1군과 anti-miR-124-5p군에서 SOD, GSH 활성 증가, MDA, IL-1β, TNF-α, NO 수준 감소(모든 P<0.05)(Fig. 4a-f), HDAC1 고갈 또는 miR-124-5p 하향 조절이 우울증 쥐의 산화 스트레스와 염증을 완화할 수 있음을 나타냅니다.
HDAC1 또는 miR-124-5p 억제가 우울증 쥐의 산화 스트레스와 염증을 억제한다. a-c HDAC1 또는 miR-124-5p 억제가 우울증 쥐 혈청 SOD, MDA, GSH 농도에 미치는 영향; d-f HDAC1 또는 miR-124-5p 억제가 우울증 쥐 혈청 IL-1β, TNF-α, NO 농도에 미치는 영향; n=10; a P<0.05 vs 정상군; b P<0.05 vs sh-NC군; c P<0.05 vs anti-miR-NC군. 다중 그룹 비교는 일원 ANOVA, 쌍별 비교는 Tukey 사후 검정
RT-qPCR과 웨스턴 블롯 분석으로 해마에서 HDAC1, miR-124-5p, NPY를 측정했습니다. 결과(Fig. 5a, b)에 따르면 정상군 대비 CUMS군에서 HDAC1과 miR-124-5p 증가, NPY 감소(모든 P<0.05). CUMS군과 sh-NC군 간 HDAC1, miR-124-5p, NPY 발현 차이 없었습니다(모든 P>0.05). sh-NC군 대비 sh-HDAC1군에서 HDAC1과 miR-124-5p 감소, NPY 발현 증가(모든 P<0.05). 이는 렌티바이러스 간섭 성공과 miR-124-5p 및 HDAC1 발현 간 양의 상관관계를 시사합니다.
HDAC1이 miR-124-5p를 매개하여 NPY를 조절한다. a HDAC1 억제 후 해마 조직 HDAC1, miR-124-5p, NPY mRNA 발현 RT-qPCR (n=6); b HDAC1 억제 후 해마 조직 HDAC1, NPY 단백질 발현 웨스턴 블롯 (n=6); c miR-124-5p 억제 후 해마 조직 miR-124-5p, NPY mRNA 발현 RT-qPCR (n=6); d miR-124-5p 억제 후 해마 조직 NPY 단백질 발현 웨스턴 블롯 (n=6); a P<0.05 vs 정상군; c P<0.05 vs sh-NC군. 다중 그룹 비교는 일원 ANOVA, 쌍별 비교는 Tukey 사후 검정
또한 miR-124-5p 억제 후 miR-124-5p와 NPY 발현을 측정했습니다(Fig. 5c, d). 정상군 대비 CUMS군에서 miR-124-5p 증가, NPY 감소(모두 P<0.05). 반대로 anti-miR-124-5p군이 anti-miR-NC군 대비 miR-124-5p 감소, NPY 증가(모두 P<0.05). CUMS군과 anti-miR-NC군 간 miR-124-5p와 NPY 발현 차이 없었습니다(모두 P>0.05). 이는 렌티바이러스 간섭 성공과 NPY와 miR-124-5p 간 음의 상관관계를 시사합니다.
ChIP 분석으로 HDAC1이 miR-124-5p 프로모터에 결합하는지 검사했습니다. 결과(Fig. 6a, b)에 따르면 HDAC1만 miR-124-5p 프로모터 영역과 관련됨(P<0.001), HDAC1이 miR-124-5p를 직접 조절할 수 있음을 나타냅니다.
HDAC1이 miR-124-5p 프로모터에 결합한다. a HEK293T 세포에서 ChIP 분석으로 HDAC1과 miR-124-5p 프로모터 영역 결합 풍부도 (n=3); b HEK293T 세포에서 ChIP 분석으로 HDAC1과 무관한 유전자 간 영역 결합 풍부도 (n=3); c 생물정보학 소프트웨어로 예측한 miR-124-5p와 NPY 결합 부위; d 이중 루시페라제 보고자 유전자 분석으로 확인한 miR-124-5p와 NPY 표적 관계 (n=3); 두 그룹 비교는 t-검정
RNA22 도구와 이중 루시페라제 보고자 유전자 분석으로 miR-124-5p와 NPY의 표적 관계를 예측 및 검증했습니다(Fig. 6c, d). NPY-3'UTR-WT와 mimic NC 공동 형질주입 세포 대비 NPY-3'UTR-WT와 miR-124-5p mimic 공동 형질주입 세포에서 루시페라제 활성 저하(P<0.05). NPY-3'UTR-MUT와 mimic NC 공동 형질주입 세포와 NPY-3'UTR-MUT와 miR-124-5p mimic 공동 형질주입 세포 간 루시페라제 활성 차이 없었습니다(P>0.05).
NPY와 miR-124-5p의 자발적 고갈을 프로그래밍하여 우울증 쥐에서의 상호작용을 탐구했습니다. 결과(Fig. 7a, b)에 따르면 anti-miR-124-5p + sh-NPY군이 anti-miR-124-5p + sh-NC군 대비 NPY 발현 수준 저하(P<0.05). 체중과 행동 기능 검사 결과(Fig. 7c-f), anti-miR-124-5p + sh-NC군 대비 anti-miR-124-5p + sh-NPY군 쥐에서 체중 감소, SPP 감소, 격자 횡단 빈도 감소, 일어서기 횟수 감소, 공간 탐색 시간 감소, 탈출 잠복기 증가(모든 P<0.05). 해마 병변 HE 염색(Fig. 8a) 결과, anti-miR-124-5p + sh-NC군 대비 anti-miR-124-5p + sh-NPY군에서 해마 뉴런 수 감소, 뉴런 염색 진해짐, 희소하고 무질서하게 배열, 불규칙한 형태, 세포층 감소. 또한 anti-miR-124-5p + sh-NC군 대비 anti-miR-124-5p + sh-NPY군에서 DA, NE, 5-HT 감소(모든 P<0.05)(Fig. 8b). 게다가 anti-miR-124-5p + sh-NC군 대비 anti-miR-124-5p + sh-NPY군 쥐에서 SOD, GSH 활성 저하, MDA, IL-1β, TNF-α, NO 수준 증가(모든 P<0.05)(Fig. 8c, d). 종합적으로 NPY 녹다운이 억제된 miR-124-5p의 우울증 쥐 보호 효과를 소멸시킴을 확인했습니다.
NPY 녹다운이 억제된 miR-124-5p의 우울증 쥐 체중 및 행동 기능에 미치는 영향을 소멸시킨다. a miR-124-5p와 NPY 동시 억제 후 해마 조직 miR-124-5p, NPY mRNA 발현 RT-qPCR (n=6); b miR-124-5p와 NPY 동시 억제 후 해마 조직 NPY 단백질 발현 웨스턴 블롯 (n=6); c miR-124-5p와 NPY 동시 억제 후 우울증 쥐 체중 (n=10); d miR-124-5p와 NPY 동시 억제 후 우울증 쥐 SPP (n=10); e miR-124-5p와 NPY 동시 억제 후 격자 횡단 빈도와 일어서기 횟수 (n=10); f miR-124-5p와 NPY 동시 억제 후 탈출 잠복기와 공간 탐색 시간 (n=10); 두 그룹 비교는 t-검정
NPY 녹다운이 억제된 miR-124-5p의 우울증 쥐 해마 손상에 미치는 영향을 소멸시킨다. a miR-124-5p와 NPY 동시 억제 후 쥐 해마 병변 HE 염색 (n=6); b miR-124-5p와 NPY 동시 억제 후 쥐 해마 조직 NE, 5-HT, DA 발현 ELISA (n=6); c miR-124-5p와 NPY 동시 억제 후 혈청 SOD, MDA, GSH 농도에 미치는 영향 (n=10); d miR-124-5p와 NPY 동시 억제 후 혈청 IL-1β, TNF-α, NO 농도에 미치는 영향 (n=10). 두 그룹 비교는 t-검정
우울증은 다양한 증상을 가진 여러 조건을 포함하는 정신질환 유형입니다. 새로운 연구들이 miRNA의 우울증에서의 역할을 시사하지만, miR-124-5p의 정확한 작용은 드물게 연구되었습니다. 따라서 본 연구는 우울증에서 miR-124-5p/HDAC1/NPY 축의 메커니즘을 더 잘 이해하고자 수행되었으며, 주요 결과는 HDAC1 또는 miR-124-5p 침묵이 NPY를 상향 조절하여 우울증 쥐의 기억과 학습 능력을 개선함을 보여줍니다.
우선, 본 연구는 해마 조직에서 HDAC1 발현을 발견했으며 HDAC1 발현 상승을 시사했습니다. 이후 우울증 쥐에서 HDAC1의 기능적 역할을 해명하기 위해 기능 상실 실험을 수행했고, HDAC1 녹다운이 우울증 쥐에서 체중 증가, 학습 및 기억 능력 개선, 병리적 손상 완화, 신경전달물질 발현 상향 조절, 산화 스트레스와 염증 억제를 유도함을 발견했습니다. 현재 연구에 따르면 스트레스 자손에서 유도된 우울 유사 및 불안 유사 표현형에서 HDAC1 발현 증가가 보고되었습니다. 또한 광혈전성 뇌졸중에서 반신부위 HDAC1 발현 상향 조절이 보고되었습니다. 측두엽 간질에서 과립세포와 피라미드 세포에서 HDAC1 mRNA 발현 증가가 발견되었습니다. HDAC1의 기능적 역할에 대해, 바이러스 매개 신경 HDAC1 과발현이 쥐 해마에서 문맥 공포 기억 상실에 특이적 영향을 미침이 보고되었습니다. 기전적으로 HDAC 억제제는 신경퇴행성 질환과 연령 관련 기억 상실의 인지 결핍을 역전시킵니다. 실제로 티아네프탈린에 의한 HDAC1 억제가 신경가소성을 증진하고 기억을 강화함이 인정됩니다. 이전 연구에 따르면 HDAC1 억제가 미토콘드리아 질환에서 운동 뉴런 변성을 유도하는 병원성 과정을 억제함이 결론지어졌습니다. 실험적으로 5-티에닐 치환 2-아미노벤즈아마이드 유형에 의한 HDAC1 침묵이 파킨슨병 모델에서 신경세포 사멸 예방에 부분적으로 관여함이 입증되었습니다. 이러한 연구들에 의해 HDAC1 침묵의 보호 효과가 우울증을 포함한 뇌 질환에서 목격되었습니다.
그 다음, 본 연구는 HDAC1과 miR-124-5p 간 표적 관계를 발견했으며, 이는 EVI1이 HDAC1 탈아세틸화효소와 결합하여 miR-124 전사를 조절한다는 선행 연구에 의해 뒷받침됩니다. miR-124-5p는 우울증 쥐에서 과발현된 유전자였고, miR-124-5p 녹다운은 우울증 쥐에서 HDAC1 침묵과 유사한 기능을 보였습니다. 실제로 해마 miR-124 발현이 우울 유사 행동 표현형에서 5~6주에 상향 조절됨 연구가 있습니다. 또 다른 연구는 코카인 사용 장애 여성에서 miR-124 발현 증가를 확인했습니다. 또한 주요 우울 장애에서 스트레스 받은 설치류에서 miR-124-3p 고발현이 기술되었습니다. 효과 측면에서 전전두엽 피질에서 miR-124 녹다운이 쥐의 우울 유사 행동을 완화함이 보고되었습니다. 게다가 만성 코르티코스테론 유도 쥐에서 miR-124 녹다운이 항우울제 역할을 함이 믿어집니다. 선행 연구에 따르면 miR-124 녹다운이 더 약한 스트레스 패러다임에 대한 행동 감수성 개선을 초래할 수 있습니다. 렌티바이러스 형질주입으로 해마에서 miR-124 억제가 케타민 유도 신경변성을 in vivo와 in vitro에서 보호함이 보고되었습니다. 어쨌든 miR-124-5p 억제는 우울증 완화에 적극적 역할을 합니다.
더 나아가, NPY 발현이 HDAC1과 miR-124-5p에 의해 조절됨이 검증되었습니다. HDAC2 관련 히스톤 아세틸화 악화 결핍이 NPY 발현 감소와 관련되어 불안 유사 및 음주 행동을 제어하는 데 사용될 수 있습니다. NPY는 우울증 쥐에서 하향 조절되었으며 NPY 상향 조절은 우울증 쥐의 학습 및 기억 능력 회복을 촉진했습니다. 우울 유사 행동 발달에서 쥐 모델은 NPY 발현 감소로 나타납니다. 학문적으로 NPY 발현이 우울증 쥐에서 감소함이 입증되었습니다. 일관되게 위에서 언급한 연구 결과는 선행 문헌과 어느 정도 일치합니다.
본 연구의 새로운 발견은 억제된 miR-124-5p 또는 억제된 HDAC1이 우울증 쥐의 학습 및 기억 능력을 완화하고 체중을 증가시켰음을 시사합니다. 또한 miR-124-5p 녹다운 또는 HDAC1 억제가 우울증 쥐의 산화 스트레스와 염증을 억제하고 신경전달물질 발현을 촉진했습니다. 게다가 HDAC1이 miR-124-5p를 매개하여 NPY를 조절했습니다. 구조 실험에서 NPY 녹다운이 억제된 miR-124-5p의 우울증 쥐 보호 효과를 소멸시켰습니다.
요약하자면, 본 연구는 우울증에서 HDAC1/miR-124-5p/NPY 축의 효과를 강조했으며, 주요 발견은 억제된 miR-124-5p 또는 억제된 HDAC1이 우울증 쥐의 학습 및 기억 능력을 완화하고 체중을 증가시키며, 산화 스트레스와 염증을 억제하고 신경전달물질 발현을 촉진함을 시사합니다. HDAC1/miR-124-5p/NPY 축은 신경학적 장애 치료에 참고가 될 수 있으며, 우울증에 대한 기존 지식을 업데이트할 수도 있습니다. 그러나 HDAC1/miR-124-5p/NPY 축의 복잡한 메커니즘을 철저히 이해하기 위해서는 추가 연구가 여전히 필요합니다.
나노물질
요약 고품질 Sn(IV) 도핑 CdS 나노와이어가 열증착법으로 합성되었습니다. XRD와 라만 산란 스펙트럼 모두 도핑 효과를 확인했습니다. 상온 광발광(PL)은 근밴드갭 방출과 이산 트랩 상태 방출이 동시에 유의미하게 나타남을 보여주었으며, 이는 빛 수송 중 불순물에 의한 강한 엑시톤 트래핑과 전자-포논 결합에 기인합니다. 근밴드갭 방출과 트랩 상태 방출의 PL 강도 비는 CdS 나노와이어 내 도핑된 Sn(IV) 농도로 조절 가능합니다. 흥미롭게도 트랩 상태 방출은 1LO, 2LO, 4LO 포논의 도움으로 잘 분리된 피크를 보여주어
초록 장비암호화 RNA(lncRNA)가 자궁경부암(CC)에서의 역할이 제시되었습니다. 본 연구는 성결정 영역 Y-박스 2(SOX2)/lncRNA 결장암 관련 전사체-1(CCAT1)/마이크로RNA-185-3p(miR-185-3p)/포크헤드 박스 단백질 3(FOXP3) 축이 CC 줄기세포의 증식과 자기갱신 능력에 미치는 영향을 논의하는 것을 목표로 합니다. CC 조직과 세포에서 miR-185-3p, SOX2, CCAT1, FOXP3 발현을 측정했습니다. CC 환자에서 SOX2/CCAT1 발현과 임상병리적 특징 간 관계를 검증했습니다.
