탯줄 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀 miR-18b-3p, 렙틴 표적화로 자간전증 위험 낮춘다

요약

마이크로RNA를 발현하는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(hucMSCs) 유래 엑소좀이 인간 질환에서 주목받고 있습니다. 그러나 hucMSCs 유래 엑소좀 miR-18b-3p의 자간전증(PE)에 대한 상세한 분자 메커니즘은 추가 조사가 필요합니다. 본 연구는 엑소좀과 miR-18b-3p/렙틴(LEP)이 PE 발생에 미치는 영향을 조사하고자 했습니다. hucMSC와 hucMSC-엑소좀(Exos)의 형태를 확인했습니다. 엑소좀을 miR-18b-3p를 발현하는 다양한 렌티바이러스로 감염시켜 miR-18b-3p의 PE에서의 역할을 탐구했습니다. N-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 복강 내 주사로 PE 쥐 모델을 수립했습니다. PE 쥐 태반 조직에서 LEP와 miR-18b-3p 발현을 측정했습니다. 또한 엑소좀이 LEP와 miR-18b-3p 발현에 미치는 영향을 측정했습니다. PE 쥐의 수축기 혈압(SBP), 단백뇨, 염증 인자, 태아 쥐와 태반 무게, 세포 아폽토시스를 측정했습니다. 마지막으로 이중 루시페라제 보고자 유전자 분석과 RNA 풀다운 분석으로 miR-18b-3p와 LEP의 관계를 검증했습니다. 엑소좀, miR-18b-3p 복원 또는 LEP 억제는 PE 쥐의 SBP와 단백뇨를 감소시키고 태아 쥐와 태반 무게를 증가시켰으며, 혈청 염증 인자 수준을 감소시키고 PE 쥐의 아폽토시스 세포를 억제하여 PE 진행에 억제 효과를 보였습니다. PE 쥐 태반 조직에서 miR-18b-3p는 감소하고 LEP는 증가했습니다. LEP는 miR-18b-3p의 직접 표적 유전자였습니다. miR-18b-3p 상향 조절 또는 엑소좀 처리는 LEP 발현을 억제하고 PE 발생을 감소시켰으며, miR-18b-3p 하향 조절은 반대 효과를 보였습니다. LEP 하향 조절은 miR-18b-3p 감소의 PE 쥐에 대한 효과를 역전시켰습니다. hucMSCs 유래 엑소좀 miR-18b-3p가 LEP를 표적화하여 PE 발생과 발달에 관여합니다. 이 연구는 PE 메커니즘과 조사에 대한 새로운 이론적 근거를 제공할 수 있습니다.

서론

자간전증(PE)은 단백뇨와 고혈압을 특징으로 하며, 인간 임신에서 태아와 산모의 사망률과 이환율의 주요 원인입니다. PE의 병인과 병태생리는 명확하지 않으며, 비정상적인 영양막 침투로 인한 산모 내피 기능 장애, 만성 태반 관류 부전, 고혈압 및 불량한 결과와 관련이 있다고 보고되었습니다. 태아와 태반 분만 외에는 PE에 대한 특정 치료법이 없습니다. 따라서 이 질병의 예후를 개선하기 위한 치료 표적 탐구가 시급합니다.

인간 탯줄(huc)은 다양한 영양 인자와 사이토카인을 분비하고 강력한 항염증 및 면역조절 능력을 보이는 중간엽 줄기세포(MSCs)의 적합한 공급원입니다. 한 연구는 PE가 탯줄 와튼 젤리 유래 MSCs에서 신경교 표지자 발현을 가속화함을 검증했습니다. hucMSCs 엑소좀(Exos)이 PE 쥐에서 태반 형태와 혈관신생에 보호 효과가 있음도 보고되었습니다. 엑소좀은 작은(50-100nm) 분비 소포로, 발암 인자를 포장하여 순환계를 통해 먼 부위나 주변 세포로 전달함으로써 종양 미세환경에서 세포 간 통신을 매개합니다. 한 연구는 PE 환자에서 엑소좀에 의한 sFlt-1과 sEng의 내피 세포로의 효과적 전달이 혈관 기능 손상과 합병증을 유도함을 밝혔습니다. 마이크로RNA(miRNA)는 18-25 뉴클레오티드 길이의 내인성 비코딩 RNA로, 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절합니다. 한 연구 데이터에 따르면 miR-18b 발현이 PE에서 영양막 세포의 침투, 생존능, 이동에 영향을 미칩니다. 또한 Wu 등은 miR-18b가 고당 유도 인간 망막 내피 세포 증식을 완화함을 제안하여 당뇨망막병증 병인 기전 이해에 새로운 통찰을 제공했습니다. 그러나 hucMSC 유래 엑소좀 miR-18b-3p의 PE에서의 역할은 아직 알려지지 않았습니다. 렙틴(LEP)은 생리적 상태에서 세포 분화/증식과 면역에 다면적 효과를 가지며 주로 지방세포에서 유래하지만 태반을 포함한 다른 조직에서도 발현됩니다. 한 연구는 비정상적인 LEP 프로모터 메틸화가 PE 진행에 관여함을 검증했습니다. 또 다른 연구는 태반이 임신 중 LEP 발현의 주요 부위임을 제안했습니다. 그럼에도 불구하고 miR-18b-3p와 LEP의 결합 관계는 여전히 불분명합니다. 따라서 본 연구는 LEP 관여 하에 hucMSC 유래 엑소좀 miR-18b-3p의 PE에서의 역할을 탐구하고자 하며, hucMSC 유래 엑소좀 miR-18b-3p가 LEP를 표적화하여 PE 진행을 억제할 수 있을 것으로 추론했습니다.

재료 및 방법

윤리적 승인

본 연구는 우한대학 인민병원 기관윤리위원회 승인을 받았습니다. 모든 참가자는 동의서에 서명했습니다. 모든 동물 실험은 우한대학 인민병원 국제위원회의 실험동물 관리 및 사용 지침을 준수했습니다.

hucMSCs 분리, 배양 및 동정

건강한 산모에서 분만된 태아 탯줄을 수집하여 잘게 자르고 체로 거른 후 인산염 완충액(PBS)과 혼합했습니다. 탯줄 조직을 원심반경 10cm에서 1500r/min으로 5분간 원심분리했습니다. 조직을 10% 태아소혈청(FBS)을 함유한 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)/F12에 현탁시켜 배양 플라스크에 옮겼습니다. 배양액을 4일 후 교체하고 이후 3일마다 1회 교체했습니다. 세포 융합도가 약 90%에 도달하면 아세포 배양했습니다. 부착 성장과 hucMSCs 형태를 광학현미경으로 관찰했습니다. 세포를 오일 레드 O 염색액(중국 베이징 Beyotime Institute of Biotechnology)으로 염색하여 hucMSCs의 골아세포 분화를, 알칼리성 인산분해효소(ALP) 염색액(중국 베이징 Beyotime)으로 염색하여 지방세포 분화를 검출했습니다. 유세포분석기(미국 Beckman Coulter Life Sciences)로 CD73, CD166(둘 다 1:10, 미국 BD Biosciences), CD105(1:20, 영국 AbD Serotec)를 측정했습니다.

hucMSC-Exos 추출 및 동정

잘 자라는 hucMSCs를 배양했습니다. 상청액을 수집하여 원심반경 10cm에서 28,500r/min으로 1시간 원심분리했습니다. 상청액을 버리고 세포를 2% 글루타르알데히드와 1% 오스뮴산으로 고정하고 에탄올로 탈수, 산화프로필렌에 침지, 2건 건조, Epon812로 포매, 절편화했습니다. 절편을 우라늄과 납으로 각각 염색했습니다. 마지막으로 전자현미경으로 엑소좀을 관찰했습니다. 나노사이트 검출기(영국 Malvern Instruments)로 엑소좀 나노입자의 브라운 운동 이미징과 크기를 측정했습니다. hucMSC-Exos의 표면 표지자를 웨스턴 블롯 분석으로 동정했으며, 결과 hucMSC-Exos가 CD9, CD81, CD63을 발현함을 보였습니다.

렌티바이러스 감염 방법

hucMSC를 miR-18b-3p 저발현 벡터와 miR-18b-3p 저발현 벡터 네거티브 컨트롤(NC)을 함유한 렌티바이러스에 감염시켰습니다(중국 상하이 Shanghai GenePharma Co, Ltd). 최종적으로 안정적으로 발현하는 hucMSC-antagomir NC와 hucMSC-miR-18b-3p antagomir를 얻었습니다. 세포를 48시간 배양하고 상청액을 수집하여 초고속 원심분리로 해당 Exos-antagomir NC와 Exos-miR-18b-3p antagomir를 얻었습니다.

실험 동물

건강-청결 등급과 성숙한 Wistar 쥐(체중 200-250g, 8주령, 성별 무관)를 중국 우한 우한대학 실험동물센터에서 선정했습니다. 쥐는 18-28°C 온도, 40-70% 상대습도, 충분한 먹이와 물이 있는 배리어 시스템에서 사육했습니다.

쥐 PE 모델 수립

참고 문헌[17]에 따라 일산화질소 합성효소 억제제인 N(G)-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르(L-NAME, Beyotime) 50mg/kg을 복강 내 주사하여 쥐 PE 모델을 수립했습니다. PE 모델 수립 성공 기준은 혈압이 20mmHg 이상 상승하고 115mmHg 이상이며 단백뇨가 증가하는 것입니다.

동물 그룹 분류

암컷 쥐와 수컷 쥐를 1:1로 무작위 동거시키고, 전날 오후 5-6시에 두 쥐를 개별 특수 케이지에 두었습니다. 다음 날 질 분비물 정자 검사와 현미경 검사로 질 마개 양성 여부를 확인했습니다. 동시에 양성이면 그날을 임신 0일로 기록했습니다. 임신 13일부터 쥐를 6그룹(각 그룹 10마리)으로 나누었습니다: 정상군(임신 13일부터 20일까지 동량의 생리식염수 복강 내 주입), PE군(임신 13일부터 20일까지 L-NAME[50mg/kg/일] 복강 내 주입, 임신 16일부터 19일까지 태반에 20μL 생리식염수 주입), PE+miR-NC군(임신 13일부터 20일까지 L-NAME[50mg/kg/일] 복강 내 주입, 임신 16일부터 19일까지 태반에 20μL 4nmol miR-NC 주입), PE+miR-18b-3p agomir군(임신 13일부터 20일까지 L-NAME[50mg/kg/일] 복강 내 주입, 임신 16일부터 19일까지 태반에 20μL 4nmol miR-18b-3p agomir 주입), PE+miR-18b-3p antagomir군(임신 13일부터 20일까지 L-NAME[50mg/kg/일] 복강 내 주입, 임신 16일부터 19일까지 태반에 20μL 4nmol miR-18b-3p antagomir 주입), PE+miR-18b-3p antagomir+si-LEP군(임신 13일부터 20일까지 L-NAME[50mg/kg/일] 복강 내 주입, 임신 16일부터 19일까지 태반에 20μL 4nmol miR-18b-3p antagomir와 si-LEP 주입), PE+si-LEP군(임신 13일부터 20일까지 L-NAME[50mg/kg/일] 복강 내 주입, 임신 16일부터 19일까지 태반에 20μL 4nmol si-LEP 주입). 쥐를 엑소좀과 렌티바이러스를 전달하는 엑소좀으로 처리했습니다. 쥐를 5그룹(각 그룹 10마리)으로 배정했습니다: 정상군(임신 13일부터 20일까지 동량의 생리식염수 복강 내 주입), PE군(임신 13일부터 20일까지 L-NAME[50mg/kg/일] 복강 내 주입, 임신 16일부터 19일까지 태반에 20μL 생리식염수 주입), PE+Exos군(임신 13일부터 20일까지 L-NAME[50mg/kg/일] 복강 내 주입, 임신 16일부터 19일까지 태반에 20μL Exos[80μg 엑소좀을 20μL 생리식염수에 현탁] 주입), PE+Exos-antagomir NC군(임신 13일부터 20일까지 L-NAME[50mg/kg/일] 복강 내 주입, 임신 16일부터 19일까지 태반에 20μL Exos-antagomir NC[80μg 엑소좀을 20μL 생리식염수에 현탁] 주입), PE+Exos-miR-18b-3p antagomir군(임신 13일부터 20일까지 L-NAME[50mg/kg/일] 복강 내 주입, 임신 16일부터 19일까지 태반에 20μL Exos-miR-18b-3p antagomir[80μg 엑소좀을 20μL 생리식염수에 현탁] 주입).

수축기 혈압(SBP) 측정 및 24시간 단백뇨 측정

쥐 꼬리 동맥 혈압 측정법으로 쥐 혈압을 측정했습니다. 모든 임신 쥐의 꼬리 커프 SBP를 임신 10일, 13일, 16일, 19일에 쥐 꼬리 동맥 압력 측정기(Tensys(R) Medical Inc., 미국 샌디에이고)로 측정했습니다. 단시간에 3회 측정하고 평균값을 혈압으로 삼았습니다.

자유 섭식 조건에서 임신 10일, 13일, 16일, 19일에 임신 쥐의 24시간 소변을 수집하고 우한대학 인민병원 신장내과에서 단백질 함량을 측정했습니다.

시료 채취

임신 21일째 3% 펜토바르비탈 나트륨으로 임신 쥐를 마취했습니다. 쥐 말초혈액을 보존하고 원심분리하여 혈청을 취해 -20°C 냉장고에 보관했습니다. 제왕절개로 태아 쥐와 태반을 꺼내고 태막과 연결된 탯줄을 제거하고 태아 쥐와 연결된 탯줄을 잘랐습니다. 태반과 태아 쥐를 무균 거즈에 올려 혈액과 양수를 말리고 분석 저울로 무게를 측정했습니다. 태반 조직 일부를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 에탄올로 탈수, 자일렌으로 투명화, 파라핀 포매 후 연속 횡단 절편(5μm)하여 헤마톡실린-에오신(HE) 염색과 말단 탈옥시뉴클레오티딜 전이효소 매개 dUTP-비오틴 닉 엔드 라벨링(TUNEL) 염색용으로 사용했습니다. 나머지는 -80°C에 보관하여 RT-qPCR, 웨스턴 블롯 분석, ELISA용으로 사용했습니다.

ELISA

종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨(IL)-1β, IL-6 혈청 함량을 ELISA로 측정했습니다. TNF-α, IL-1β, IL-6 농도는 키트 지침(미국 R&D Systems)에 따라 측정했습니다. 광학 밀도(OD) 값(490nm)을 마이크로플레이트 리더(미국 Thermo Fisher Scientific)로 측정했습니다. OD 값을 가로축, 해당 표준 시료 농도를 세로축으로 하여 표준 곡선을 얻었습니다. 표준 곡선에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 농도를 계산했습니다.

HE 염색

태반 조직 파라핀 시료를 자일렌으로 투명화, 관능 알코올로 탈수, 헤마톡실린 염색, 1% 염산 알코올로 분화, 1% 암모니아수로 청색화했습니다. 1% 에오신 용액으로 대조 염색, 탈수(75%, 90%, 95% 에탄올, 무수 에탄올 순서), 자일렌으로 투명화, 건조, 봉입 후 전자현미경으로 관찰했습니다.

TUNEL 염색

파라핀 포매 절편을 지침에 따라 통상적으로 탈랍 및 탈수하고, TUNEL 키트(중국 난징 Nanjing Kejin Biotechnology Co., Ltd.)로 아폽토시스를 검출했습니다. 4,6-디아미노-2-페닐인돌(중국 상하이 Shanghai Baitai Biotechnology Co., Ltd.)로 TUNEL 양성 세포를 형광현미경(일본 Nikon)으로 관찰했습니다[18].

RT-qPCR

태반 조직을 칭량하고 50-100mg당 1mL TRIzol(미국 Invitrogen)을 첨가하여 완전히 용해했습니다. 200μL 클로로포름을 첨가하고 4°C, 12,000rpm에서 원심분리하여 총 RNA를 추출했습니다. 단백질 핵산 분광광도계 DU-800(미국 Beckman)으로 RNA 농도와 순도를 측정했습니다. U6와 β-actin을 로딩 컨트롤로 사용했습니다. PCR 프라이머를 중국 상하이 Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd.에서 설계 및 합성했습니다. 프라이머 서열은 Table 1에 나열했습니다. RNA 역전사 키트(상하이 Sangon) 지침에 따라 RNA를 cDNA로 역전사했습니다. PCR 증폭 후 아가로스 겔 전기영동으로 산물을 확인했습니다. 데이터는 2^(-ΔΔCt) 법으로 계산했습니다.

웨스턴 블롯 분석

태반 조직 총 단백질을 RIPA 세포 용해 버퍼(중국 Beyotime)로 추출했습니다. hucMSC-Exo를 추출 버퍼로 사용하여 14,000rpm에서 원심분리했습니다. 상청액을 보존하여 혈청 내 엑소좀 표지자 단백질(CD81, CD63, CD9) 발현을 측정했습니다. 단백질 농도는 BCA 키트(중국 Beyotime, P0010)로 측정했습니다. 정량 결과에 따라 시료를 로드하고 10% SDS-PAGE 전기영동 후 막으로 전이했습니다. 막을 5% 탈지분유로 차단하고 1차 항체(LEP, CD63, CD81, CD9, β-actin, 4mL, 1:1000, 미국 Santa Cruz Biotechnology, Inc.)로 탐침하고 2차 항체 염소 항토끼 IgG/과산화효소(4mL)로 재탐침했습니다. 노출 현상 후 β-actin을 내부 기준으로 하여 Image Lab 겔 화상 분석 소프트웨어로 회색 값을 분석했습니다.

이중 루시페라제 보고자 유전자 분석

온라인 예측 소프트웨어 https://cm.jefferson.edu/로 miR-18b-3p와 LEP의 표적 관계 및 miR-18b-3p와 LEP 3'비번역 영역(UTR) 결합 부위를 예측했습니다. miR-18b-3p 결합 부위를 포함하는 LEP 3'UTR 프로모터 영역 서열을 구성했습니다. LEP 3'UTR 야생형(WT) 플라스미드와 LEP 3'UTR 돌연변이형(MUT)을 구성했습니다. 재조합 플라스미드를 각각 LEP 3'UTR-WT와 LEP 3'UTR-MUT로 명명했습니다. 배양된 293T 세포를 miR-18b-3p mimic과 LEP 3'UTR-WT, miR-18b-3p mimic과 LEP 3'UTR-MUT, mimic NC와 LEP 3'UTR-WT, mimic NC와 LEP 3'UTR-MUT로 30시간 공동 형질주입했습니다. 293T 세포를 수집하고 이중 루시페라제 보고자 유전자 검출 키트(미국 Promega)에 따라 반딧불이와 레닐라 루시페라제 활성을 발광 측정으로 측정했습니다.

RNA 풀다운 분석

비오틴화 RNA 프로브(Bio-miR-NC, Bio-miR-18b-3p, Bio-miR-18b-3p-Mut)를 293T 세포 용해액과 배양하고 항생제 스트렙토마이신과 결합된 자기 비드로 추출했습니다. 실험은 Pierce 자기 RNA 풀다운 키트(미국 Pierce) 지침에 따라 수행했습니다. RNA를 용출하고 TRIzol(미국 Pierce)로 정제했습니다. RNA 복합체 내 LEP 풍부도를 앞서 설명한 RT-qPCR로 정량화했습니다[19].

통계 분석

모든 데이터는 SPSS 21.0 소프트웨어(미국 IBM Corp.)로 분석했습니다. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈습니다. 두 그룹 비교는 독립 표본 t-검정, 다중 그룹 비교는 일원분산분석(ANOVA) 후 Tukey 사후 검정으로 수행했습니다. 통계적 유의성 기준은 p<0.05로 설정했습니다.

결과

hucMSC와 hucMSC-Exos의 형태 및 동정

탯줄 조직 덩어리를 역상현미경으로 관찰했습니다. 3일째 조직 덩어리에서 세포가 기어 나오는 것이 보였고, 약 5일째 세포가 방추형과 실모양을 보이며 집락 형태로 자랐습니다. 3대 배양 시 세포 형태가 균일한 장방추형으로 섬유아세포 형태와 유사하며 배열이 규칙적이었습니다(Fig. 1a). hucMSC 지방세포 분화 2주 후 세포질에 지방 방울이 형성되었고, 역상현미경에서 지방 방울이 크란츠 구조를 보였습니다(Fig. 1b), 분리 배양된 hucMSC가 지방세포 분화 능력을 가짐을 시사합니다. 골아세포 분화 2주 후 역상현미경에서 다수의 갈색 칼슘 결절이 관찰되었습니다(Fig. 1c), 분리 배양된 hucMSC가 골아세포 분화 능력을 가짐을 나타냅니다. 유세포분석기로 세포 면역표현형을 측정했으며, 결과 세포가 MSCs 표면 표지자 CD73, CD105, CD166을 과발현함을 보였습니다(Fig. 1d).

hucMSC와 hucMSC-Exos의 형태 및 동정. a 역상현미경 하 hucMSC 형태, b hucMSC 오일 레드 O 염색 검사, c hucMSC ALP 염색 검사, d 유세포분석으로 면역표현형 검출, e TEM으로 관찰한 hucMSC-Exos 형태와 크기, f 나노사이트 분석으로 엑소좀 입자 크기 분포 검출, g 웨스턴 블롯 분석으로 hucMSC-Exos 내 CD9, CD81, CD63 단백질 발현 검출

hucMSC-Exos 형태를 TEM으로 관찰한 결과, 엑소좀이 원형 또는 타원형이며 중앙 밀도가 낮고 양측 염색이 두꺼운 것으로 나타났습니다(Fig. 1e). 나노사이트 분석으로 엑소좀 입자 크기 분석 결과, 입자 크기가 주로 40-100nm 사이에 분포하며 80nm 부근에 더 집중됨을 보였습니다(Fig. 1f). 웨스턴 블롯 분석 결과 모든 표면 표지자 CD81, CD63, CD9가 hucMSC-Exos에서 발현됨을 확인했습니다(Fig. 1g).

miR-18b-3p 복원이 PE 쥐의 병리적 특성을 완화한다

SBP와 24시간 단백뇨 결과: 투여 전(임신 10일) 6그룹 간 SBP와 24시간 단백뇨에 유의미한 차이가 없었습니다. 정상 쥐에서 임신 19일 SBP와 24시간 단백뇨에 뚜렷한 차이가 없었습니다. PE 쥐나 miR-NC, miR-18b-3p agomir, miR-18b-3p antagomir, miR-18b-3p antagomir+si-LEP, si-NC, si-LEP 처리 PE 쥐에서 임신 13일부터 SBP와 24시간 단백뇨가 증가하기 시작했습니다. miR-18b-3p agomir와 si-LEP 처리 PE 쥐에서 임신 16일과 19일 SBP와 24시간 단백뇨에 뚜렷한 차이가 없었습니다. PE 쥐에서 임신 19일 SBP와 24시간 단백뇨 증가; 이 증가는 miR-18b-3p 상승으로 감소했으나 miR-18b-3p 억제로 더 증가했습니다; LEP 감소는 임신 19일 PE 쥐에서 miR-18b-3p 하향 조절의 SBP와 24시간 단백뇨 역할을 소멸시켰습니다(Fig. 2a, b).

miR-18b-3p 복원이 PE 쥐의 병리적 특성을 완화한다. a 쥐 SBP 결과, b 쥐 24시간 단백뇨 결과, c 태아 쥐 체중 변화, d 쥐 태반 무게 변화, e ELISA로 측정한 혈청 염증 인자 변화. n=10, *P<0.05 vs 정상군, ^P<0.05 vs PE+miR-NC군, @P<0.05 vs PE+miR-18b-3p antagomir군, &P<0.05 vs PE+si-NC군. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈으며, 다중 그룹 비교는 일원 ANOVA 후 Tukey 검정

태아 쥐와 태반 무게가 PE 쥐에서 감소했습니다; miR-18b-3p 상향 조절 또는 LEP 하향 조절은 증가시켰고, miR-18b-3p 하향 조절은 PE 쥐에서 태아 쥐와 태반 무게를 감소시켰습니다; LEP 침묵은 miR-18b-3p 억제의 태아 쥐와 태반 무게에 대한 효과를 역전시켰습니다(Fig. 2c, d).

PE 쥐 혈청 염증 인자를 측정했습니다. PE 쥐에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 함량 증가; miR-18b-3p 상승 또는 LEP 억제는 억제했고, miR-18b-3p 감소는 촉진했습니다; LEP 고갈은 억제된 miR-18b-3p의 TNF-α, IL-1β, IL-6 함량에 대한 효과를 소멸시켰습니다(Fig. 2e).

과발현 miR-18b-3p가 PE 쥐 태반 조직의 조직병리학적 변화를 개선한다

정상 쥐에서 태반 융모는 혈관이 풍부하고 구조가 명확하며, 융모외세포가 태반 융모의 주요 영양막 세포이고 세포영양막은 적었습니다. PE 쥐나 miR-NC, miR-18b-3p antagomir, si-NC, miR-18b-3p antagomir+si-LEP 처리 PE 쥐에서 태반 융모 수 감소, 구조 불명확 및 위축, 일부 융모에서 섬유소 괴사, 태반 융모 내 융모외세포 결절 수 증가, 대부분 융모가 미성숙했습니다. 영양세포 수 감소, miR-18b-3p agomir와 si-LEP 처리 PE 쥐에서 병리적 변화 완화(Fig. 3a).

과발현 miR-18b-3p가 PE 쥐 태반 조직의 병리적 변화를 개선하고 아폽토시스 세포를 억제한다. a HE 염색으로 태반 조직 병리적 특징 검사, b TUNEL 염색으로 PE 쥐 태반 조직 아폽토시스 세포 판정, c TUNEL 염색으로 세포 아폽토시스율 검출. n=10, *P<0.05 vs 정상군, ^P<0.05 vs miR-NC군, @P<0.05 vs miR-18b-3p antagomir군, &P<0.05 vs si-NC군. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈으며, 다중 그룹 비교는 일원 ANOVA 후 Tukey 검정

TUNEL 염색 결과 소량의 아폽토시스 세포 관찰. PE 쥐에서 아폽토시스 세포 증가, miR-18b-3p 상승과 LEP 침묵으로 감소, miR-18b-3p 억제로 더 증가; LEP 침묵은 miR-18b-3p 억제의 PE 쥐 아폽토시스 세포 수에 대한 효과도 역전시켰습니다(Fig. 3b, c).

종합하면, miR-18b-3p 상향 조절 또는 LEP 억제 쥐에서 조직학적으로 PE 진행 정도 감소, 침묵된 LEP가 억제된 miR-18b-3p의 치료 효과를 소멸시킬 수 있음.

PE 쥐 태반 조직에서 miR-18b-3p는 하향 조절되고 LEP는 상향 조절되며 miR-18b-3p는 LEP를 표적화한다

위 결과에 기반하여 LEP 하향 조절이 병리학과 조직학에서 miR-18b-3p 하향 조절의 PE 쥐 치료 효과를 역전시켰으므로, miR-18b-3p가 LEP와 관련될 수 있다고 가설 설정했습니다.

웨스턴 블롯 분석과 RT-qPCR 결과, PE 쥐에서 miR-18b-3p 감소, LEP 발현 수준 증가; miR-18b-3p agomir 처리는 PE 쥐에서 miR-18b-3p 상향 조절, LEP 하향 조절; miR-18b-3p antagomir 처리는 LEP 발현 증가; LEP 침묵은 PE 쥐에서 miR-18b-3p 감소의 LEP 발현 촉진 효과를 역전시켰습니다(Fig. 4a-c).

PE 쥐 태반 조직에서 miR-18b-3p 하향 조절, LEP 상향 조절 및 miR-18b-3p의 LEP 표적화. a RT-qPCR로 태반 조직 miR-18b-3p, LEP mRNA 발현 검출, b 태반 조직 LEP 단백질 밴드, c 웨스턴 블롯 분석으로 태반 조직 LEP 단백질 발현 검출, d 엑소좀 처리 후 태반 조직 miR-18b-3p, LEP mRNA 발현 RT-qPCR 검출, e 엑소좀 처리 후 태반 조직 LEP 단백질 밴드, f 엑소좀 처리 후 웨스턴 블롯 분석으로 LEP 단백질 발현 검출, g 온라인 소프트웨어로 예측한 miR-18b-3p와 LEP 결합 부위, h 이중 루시페라제 보고자 유전자 분석으로 검증한 miR-18b-3p와 LEP 표적 관계, i RNA 풀다운 분석으로 검증한 miR-18b-3p와 LEP 표적 관계. n=10, *P<0.05 vs 정상군, ^P<0.05 vs miR-NC군, @P<0.05 vs miR-18b-3p antagomir군, &P<0.05 vs si-NC군, #P<0.05 vs PE군, $P<0.05 vs PE+Exos-antagomir NC군. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈으며, 다중 그룹 비교는 일원 ANOVA 후 Tukey 검정

웨스턴 블롯 분석과 RT-qPCR로 엑소좀의 PE 쥐에서의 역할을 탐구했습니다. 결과 엑소좀이 PE 쥐에서 miR-18b-3p 상향 조절, LEP 하향 조절함을 보여주어 엑소좀의 PE 발달 억제 효과를 나타냈습니다. 또한 miR-18b-3p antagomir를 전달하는 엑소좀이 PE 쥐에서 miR-18b-3p 하향 조절, LEP 상향 조절을 유도했습니다(Fig. 4d-f).

생물정보학 온라인 예측 소프트웨어 https://cm.jefferson.edu/로 miR-18b-3p와 LEP의 표적 관계를 예측했습니다(Fig. 4g). 이중 루시페라제 보고자 유전자 분석 결과 miR-18b-3p mimic이 LEP 3'UTR-WT 루시페라제 활성을 감소시켰으나 LEP 3'UTR-MUT에는 영향 없음(Fig. 4h). 또한 RNA 풀다운 분석 결과 WT-비오틴화 miR-18b-3p에서 LEP 풍부도 증가(Fig. 4i). 이 결과들은 LEP가 miR-18b-3p의 표적 유전자임을 나타냅니다.

hucMSC-Exos가 PE 쥐의 병리적 특성을 완화한다

SBP와 24시간 단백뇨 결과: 투여 전(임신 10일) 5그룹 간 SBP와 24시간 단백뇨에 유의미한 차이 없었습니다. 정상 쥐에서 임신 19일 SBP와 24시간 단백뇨에 뚜렷한 차이 없었습니다. PE 쥐에서 임신 13일부터 SBP와 24시간 단백뇨 상승 시작. hucMSC-Exos와 hucMSC-Exos-antagomir NC 처리 PE 쥐에서 임신 16일과 19일 SBP와 24시간 단백뇨에 뚜렷한 차이 없었습니다. PE 쥐에서 임신 19일 SBP와 24시간 단백뇨 증가, hucMSC-Exos 주입으로 증가 감소. miR-18b-3p 억제는 임신 19일 PE 쥐에서 hucMSC-Exos의 SBP와 24시간 단백뇨 효과를 역전시켰습니다(Fig. 5a, b).

hucMSC-Exos가 PE 쥐의 병리적 특성을 완화한다. a 엑소좀 처리 후 쥐 SBP 결과, b 엑소좀 처리 후 쥐 24시간 단백뇨 결과, c 엑소좀 처리 후 태아 쥐 체중 변화, d 엑소좀 처리 후 쥐 태반 무게 변화, e 엑소좀 처리 후 혈청 염증 인자 변화(ELISA 측정). n=10, *P<0.05 vs 정상군, #P<0.05 vs PE군, $P<0.05 vs PE+Exos-antagomir NC군. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈으며, 다중 그룹 비교는 일원 ANOVA 후 Tukey 검정

태아 쥐와 태반 무게 측정 결과, PE 쥐에서 태아 쥐와 태반 무게 감소; miR-18b-3p 하향 조절이 PE 쥐에서 hucMSC-Exos의 태아 쥐와 태플 무게 역할을 소멸시킴(Fig. 5c, d).

ELISA로 혈청 염증 인자 측정. PE 쥐에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 함량 현저 증가. 엑소좀 처리는 PE 쥐 혈청 TNF-α, IL-1β, IL-6 함량 감소, miR-18b-3p 억제 엑소좀 주입으로 증가(Fig. 5e).

엑소좀이 PE 쥐 태반 조직의 병리적 변화를 완화하고 아폽토시스를 억제한다

정상 쥐에서 태반 융모는 혈관이 풍부하고 구조가 명확하며, 융모외세포가 주요 영양막 세포이고 세포영양막은 적었습니다. PE 쥐와 hucMSC-Exos-miR-18b-3p-antagomir 처리 PE 쥐에서 태반 융모 수 감소, 구조 불명확 및 위축, 일부 융모에서 섬유소 괴사, 태반 융모 내 융모외세포 결절 수 증가, 대부분 융모 미성숙. hucMSC-Exos 또는 hucMSC-Exos-antagomir NC 처리 PE 쥐에서 병리적 변화 개선(PE 쥐와 hucMSC-Exos-miR-18b-3p antagomir 처리 PE 쥐 대비)(Fig. 6a).

엑소좀이 PE 쥐 태반 조직의 병리적 변화를 완화하고 아폽토시스 세포를 감소시킨다. a 엑소좀 처리 후 PE 쥐 태반 조직 병리적 특징 HE 염색 검사, b 엑소좀 처리 후 PE 쥐 태반 조직 아폽토시스 세포 TUNEL 염색 판정, c TUNEL 염색으로 세포 아폽토시스율 검출. n=10, *P<0.05 vs 정상군, #P<0.05 vs PE군, $P<0.05 vs PE+Exos-antagomir NC군. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈으며, 다중 그룹 비교는 일원 ANOVA 후 Tukey 검정

TUNEL 염색 결과 정상 쥐에서 소량 아폽토시스 세포 관찰. PE 쥐에서 아폽토시스 세포 증가, miR-18b-3p 감소는 hucMSC-Exos의 PE 쥐 태반 조직 아폽토시스 세포 수에 대한 영향을 역전시킴(Fig. 6b, c).

고찰

PE는 단백뇨와 고혈압 또는 기타 불량 조건을 특징으로 하는 다계통 임신 장애로, 광범위한 산모 내피 기능 장애와 연관됩니다. hucMSC-Exo가 세포 아폽토시스 억제와 태반 조직 혈관신생 촉진을 통해 용량 의존적으로 PE 쥐 태반 조직 형태를 개선함이 보고되었습니다. 한 연구는 miR-18b 발현이 PE에서 세포 이동, 생존능, 침투에 영향을 미침 보고했습니다. 또한 조기 발병 PE에서 산모 LEP 농도 증가와 태반 LEP 저메틸화가 검증되었습니다. 본 연구는 엑소좀과 miR-18b-3p 표적 LEP가 PE 발생에 미치는 영향을 탐구하고자 설계되었습니다. 본 연구 결과 hucMSC 유래 엑소좀 miR-18b-3p가 LEP를 감소시켜 PE 진행을 억제함을 밝혔습니다.

본 연구 결과에 따르면 PE 쥐 태반 조직에서 miR-18b-3p 감소, LEP 상승. 우리 연구와 유사하게 PE 태반 조직에서 miR-18b mRNA 발현이 정상 태반 조직 대비 현저히 억제됨. 또한 악성 흑색종 조직에서 miR-18b 함량이 인접 비종양 조직 대비 현저히 감소함 연구. 또 다른 연구는 조산 PE에서 태반 LEP 발현이 대조군 대비 상승함 검증. 또한 자간전증 태반에서 LEP 발현이 현저히 높음 연구. 이러한 문헌은 PE에서 miR-18b-3p와 LEP 비정상 발현 탐구에 이론적 근거 제공. 또한 생물정보학 소프트웨어로 LEP가 miR-18b-3p에 의해 표적화됨 예측, 본 연구에서 이중 루시페라제 보고자 유전자 분석으로 표적 관계 추가 확인. 한 연구는 조기 발병 PE에서 LEP가 세 miRNA(miR-1301, miR-223, miR-224) 표적임 보고. 또 다른 연구는 골관절염과 류마티스 관절염에서 LEP가 miR-93 발현 감소시킴 표시. 그러나 miR-18b-3p와 LEP 결합이 인간 질환, 특히 PE에서 거의 연구되지 않음, 이것이 본 연구의 참신성. 또한 본 연구 결과 엑소좀이 PE 쥐 태반 조직에서 miR-18b-3p 증가, LEP 감소시킴 보고. 이전에는 대장암 혈장 엑소좀에서 miR-18b-5p 발현 현저 상승 보고, hucMSC-Exos와 miR-18b-3p/LEP 관계는 추가 연구 필요.

또한 본 연구 결과 복원된 miR-18b-3p가 PE 쥐 SBP와 24시간 단백뇨 감소, 태반 무게 증가, 혈청 및 태반 조직 TNF-α, IL-1β, IL-6 함량 감소, 세포 아폽토시스 억제함 보여줌. 이 데이터는 miR-18b-3p 상승이 PE 증상과 병리적 변화 완화에 기여함 나타냄. miR-18b 안정적 상향 조절이 흑색종 세포 생존능 억제, 아폽토시스 유도, 생체 내 종양 성장 감소 등 효과적 종양 억제 활성 생성함 입증. 본 연구 또 다른 결과 hucMSC-Exos가 PE 쥐 SBP와 24시간 단백뇨 감소, 태반 무게 증가, 혈청 및 태반 조직 TNF-α, IL-1β, IL-6 함량 감소, 세포 아폽토시스 억제함. 본 연구 결과 엑소좀 처리 PE 쥐 모델에서 태아 수와 질, 태반 질 증가, 세포 아폽토시스 현저 감소 나타남[8]. 흥미롭게도 이전 연구에서 태아 소 엑소좀 첨가가 대식세포 TNF-α와 IL-6 함량 감소시킴 입증. 한 연구는 정제된 엑소좀이 지질다당류/니게리신 자극 대식세포에서 IL-1β 생성 억제함 밝힘. 또한 Nong 등은 인간 유도 만능 줄기세포 유래 MSCs 생산 엑소좀 투여 후 TNF-α, IL-6 등 염증 표지자가 현저히 감소함 제안. 한 논문에서 나중에 PE 발병 여성 그룹에서 SBP 현저 상승 발견[30, 31]. PE 환자가 SBP, 이완기 혈압, 단백뇨와 양의 상관관계 있음 표시[32]. 또한 최근 연구에서 PE 여성에서 단백뇨가 임신 진행에 따라 증가함 증명[33]. 중요한 발견으로 PE 그룹 쥐가 정상 임신 그룹 대비 TNF-α 증가[34]. 또 다른 연구에서 PE 여성 혈청 IL-6, IL-1β가 대조군 대비 현저히 상승함 검증[35]. 위 결과들은 PE 환자가 보통 높은 SBP, 단백뇨, 염증 인자 수준 보임 시사. 따라서 본 연구 결과 hucMSC 유래 엑소좀 miR-18b-3p가 PE에 치료 효과 가짐 추론 가능.

결론

결론적으로, 본 연구는 hucMSCs 유래 엑소좀이 miR-18b-3p를 상향 조절하여 LEP를 표적화함으로써 PE 쥐 태반 조직에서 염증 인자 함량과 세포 아폽토시스율을 감소시켜 PE 발생을 억제함을 입증했습니다. 따라서 엑소좀 miR-18b-3p는 LEP 표적화를 통한 PE 치료 잠재 후보가 될 수 있습니다. 본 연구는 PE 발달 중 hucMSC 유래 엑소좀 miR-18b-3p가 LEP를 표적화하는 역할을 최초로 규명하여 PE 치료에 새로운 통찰 제공. 그러나 알려진 연구의 한계로 향후 임상시험에서 엄격히 모니터링되고 적절히 보고되어야 함.