상승적인 항종양 활성을 위한 제어된 세포내 약물 전달 나노시스템으로서 마이크로파 보조 키토산 기능화 그래핀 산화물

결과 및 토론

합성 및 특성화

합성된 GO 시트의 형태는 투과 전자 현미경(TEM)으로 특성화되었습니다. 그림 1a는 평균 크기가 약 45nm인 100nm 미만의 GO 나노시트의 균일한 크기 분포를 보여줍니다. GO의 높은 전자 밀도는 낮은 전자 밀도와 수화 특성으로 인해 거의 보이지 않는 키토산에 비해 더 나은 대조를 나타냅니다[21]. 더 높은 표면적 때문에 나노크기의 GO 또는 환원된 GO 시트가 약물 운반체로 널리 사용되었습니다[22]. 그림 1c의 SAED(selected-area electron diffraction) 패턴은 동심원 고리를 표시하며, 이는 산화 그래핀에 해당하는 다결정 성질의 존재를 나타냅니다[23].

아 GO 나노시트의 저배율 TEM 이미지, b 나노시트 및 c의 고해상도 TEM 이미지 GO 나노시트의 전형적인 SAED 패턴

생리학적 용액에서 GO 나노시트를 안정화하기 위해 키토산 기능이 있는 GO 나노시트는 마이크로파 시스템을 사용하여 마이크로웨이브 보조 환원에 의해 제조되었습니다[24]. 생성된 환원된 GO-키토산(ChrGO)을 UV-Vis 분광법으로 분석했습니다. 그림 2a는 GO 및 ChrGO의 UV-Vis 스펙트럼을 보여줍니다. GO는 230nm에서 급격한 흡수 피크를, 300nm에서 숄더를 나타냈으며, 이는 π에 기인합니다. –π * 방향족 C=C 결합 및 n의 전이 –π * 각각 C=O 결합의 전이 [25, 26]. 키토산을 GO에 접목한 후 ChrGO의 경우 230 nm의 피크가 270 nm로 적색 편이되었고 300 nm의 숄더가 분명히 사라졌는데, 이는 방향족 탄소 원자 간의 전자 접합이 부분적으로 복원되었기 때문입니다[27]. 합성된 ChrGO의 흑색 용액은 그림 2b에 나와 있으며, 이는 부분적으로 환원된 산화 그래핀(p-rGO)의 형성을 나타냅니다. GO 나노시트와 ChrGO는 모두 탈이온화된 H₂에 잘 분산되었습니다. O. 수용액에서 GO 또는 GO 유도체의 콜로이드 안정성은 생물 의학 응용에 매우 중요합니다. 결과는 환원 후 키토산이 GO와 결합되었음을 시사했습니다.

아 수용액에서 GO 나노시트 및 ChrGO의 UV-Vis 스펙트럼, b GO 나노시트 및 합성 ChrGO 사진

FTIR 분광법은 GO, 키토산 및 ChrGO의 구조를 특성화하기 위해 수행되었습니다(그림 3a). GO의 특징적인 피크는 3440cm ⁻¹ 에 위치했습니다. 및 1376cm ⁻¹ , 각각 OH 및 C-OH 결합에 해당합니다. 1072cm의 피크 ⁻¹ C–N–C의 신축 진동에 할당되었습니다. 눈에 띄게 키토산 분자의 피크는 2912cm ⁻¹ 입니다. 및 2848cm ⁻¹ CH₃의 신축 진동에 기인합니다. – 및 –CH₂ – [28, 29]. 키토산으로 기능화된 p-rGO는 새로운 결합을 생성하여 ChrGO 스펙트럼에서 새로운 피크를 생성했습니다. 1636cm ⁻¹ 에서 C=O 밴드의 강도가 크게 감소했습니다. 환원 과정이 GO의 산소 함유 그룹을 제거했음을 시사하는 ChrGO의 경우 GO의 경우와 비교됩니다[30]. ChrGO의 FTIR 스펙트럼은 GO에서 키토산의 성공적인 접합을 확인했습니다. 또한, 라만 분광법을 사용하여 그래핀의 전자적 특성과 구조를 특성화했습니다. G 밴드는 E _2g sp의 음소수 ² 탄소 도메인, 반면 D 밴드는 sp의 진동에 할당됩니다. ³ 탄소 원자 도메인 및 무질서한 탄소 원자. D 밴드의 강도는 탄소 시트의 장애 및 결함 특성을 나타냅니다[31]. GO 나노시트의 감소는 D 대 G 밴드의 신호 비율에서도 분석되었다[32]. GO의 대표적인 라만 스펙트럼은 D 밴드(1341cm ⁻¹ ) 및 G 밴드(1591cm ⁻¹ ) ) 그림 3b. I_D의 상대 강도 변화 /I_G 값은 환원 과정에서 GO의 전자 접합 상태의 변화를 나타냅니다[33]. D 밴드의 이동은 환원된 GO의 성공적인 기능화를 표시합니다. 나의 가치 _D /나 _G sp3 도입으로 인해 0.99(GO)에서 1.12(ChrGO)로 증가 기능화 후 결함 및 그래핀 특성 구조의 불완전한 복구 [34]. 이 관찰은 이전 보고서와 잘 일치하며 키토산 기능화된 그래핀의 형성을 시사합니다[16].

아 GO, ChrGO 및 키토산의 FTIR 스펙트럼, b GO 및 ChrGO의 라만 스펙트럼

ChrGO의 표면 조성은 XPS에 의해 확인되었습니다. ChrGO의 XPS 스펙트럼 전체 스캔은 284, 399 및 533eV에서 3개의 피크를 보여주며 각각 C1, N1 및 O1에 할당됩니다(그림 4a). 상대 원소 분석은 GO에 비해 탄소 함량의 감소와 함께 ChrGO 산소 및 질소 수준의 증가를 나타냈습니다. 그림 4b에 표시된 ChrGO의 고해상도 C1s 스펙트럼은 C–C 또는 C=C(sp ² , 284.7eV), C-O(에폭시/히드록실, 286.4eV), C=O(sp ³ , 288.2eV) 및 O=C-O(카르복실레이트, 289.1eV) 결합. ChrGO에서 아미드 피크의 출현은 GO에서 키토산의 기능화에 대한 증거를 제공합니다[35]. 표면의 풍부한 친수성 작용기는 ChrGO를 수용액에서 매우 잘 녹게 했으며 이는 FTIR 결과와 일치합니다. 효모 추출물의 환원성 아미노산 및 알파-리놀렌산과 같은 생체 분자는 ChrGO의 마이크로웨이브 보조 제작에 중요한 역할을 할 수 있습니다[20].

아 GO 및 ChrGO의 XPS 스펙트럼 조사, b C1의 고해상도 스펙트럼

GO 및 ChrGO의 X선 회절(XRD) 패턴은 그림 5a에 나와 있습니다. GO XRD 스펙트럼에서 11.0°의 주요 피크와 20.7°의 약한 피크는 흑연 구조를 명확하게 나타냅니다. GO의 성공적인 합성을 보여주는 GO의 (001) 평면에 해당하는 11.0°에서의 피쳐 회절 피크 [36]. 20°와 24° 사이의 작은 범프는 산화되지 않은 원시 흑연에 기인하는 흑연 부분을 보여줍니다[37]. 키토산의 기능화와 함께 GO의 (001) 피크는 사라지고 21.4°에서 넓은 회절 피크가 두드러집니다. 이러한 이동은 GO의 감소에 기인할 수 있으며, 여기서 감소는 rGO 팩을 GO보다 더 단단하게 만듭니다. ChrGO 샘플의 (002) 반사는 매우 광범위하여 샘플이 적층 방향을 따라 정렬되지 않았음을 시사하며, 이는 GO의 불완전한 환원에 기인할 수 있습니다[33]. GO, 키토산 및 ChrGO의 분해 거동은 열 중력 분석(TGA)에 의해 연구되었습니다[38]. 질소 분위기에서 측정한 ChrGO, GO 및 키토산의 TGA 곡선은 그림 5b에 나와 있습니다. GO는 100°C 이하에서 무게가 감소하기 시작했는데, 이는 적층 구조에서 흡착된 유리수 제거에 기인합니다[39]. GO는 불안정한 산소 함유 그룹의 분해와 관련하여 191–231°C 범위에서 무게의 42%를 잃었습니다. 100–250°C에서 ChrGO의 중량 손실 비율은 GO보다 현저히 낮으며 ChrGO는 GO와 비교하여 다른 분해 패턴을 나타냄이 분명합니다. ChrGO와 순수한 키토산의 열 제거는 250~440°C에서 발생했으며, 이는 키토산 및 카르복실기의 글리코시드 단위와 같은 보다 안정적인 작용기의 해중합 및 열분해와 관련이 있습니다[40]. GO와 비교하여 ChrGO는 열적으로 안정적이며 250–440°C에서 첫 번째 분해 단계에서 36%의 주요 중량 손실을 제공한 반면 GO의 경우 중량 손실이 거의 나타나지 않습니다. 450–800°C의 고온 영역에서 상당한 체중 감소는 탄소 골격의 열 분해로 인한 것이며, 이는 아미노산과 같은 효모 추출물의 키토산 잔류물 및 생체 분자에 기인할 수 있습니다[41]. <그림>

아 GO 및 ChrGO의 XRD 패턴, b GO, 키토산 및 ChrGO의 TGA 곡선

GO 및 ChrGO의 표면 전하는 콜로이드 안정성의 중요한 매개변수인 Malvern Zeta Nano ZS-90 기기로 측정되었습니다. GO 나노시트의 더 높은 표면 전하 밀도는 더 안정적인 콜로이드 분산을 생성합니다[42]. 추가 파일 1:그림 S1에서 볼 수 있듯이 GO의 제타 전위는 pH 3에서 − 10.7mV에서 pH 11에서 − 35.5mV로 단조 감소하여 GO 나노시트 표면의 음전하를 확인했습니다. ChrGO에 대한 제타 전위 값은 3에서 11 사이의 모든 pH에서 GO의 전위보다 비교적 낮았습니다. ChrGO 나노시트는 전체 pH 값 범위에서 안정성을 나타내는 반면 환원된 GO 콜로이드는 다음으로 인해 탈이온수에서 덜 안정적인 것으로 보고되었습니다. π 증가 –π 탈산소화된 표면에 쌓임 [43]. 일부 유리 아민 그룹이 키토산 표면에 존재했지만[44] ChrGO의 더 높은 제타 전위는 달성되지 않았습니다. ChrGO의 더 낮은 제타 전위 값은 생리학적 용액에서 콜로이드 안정성을 향상시킨 효모 추출물의 풍부한 음성 아미노산 분자에 기인할 수 있습니다[20]. ChrGO의 음으로 대전된 표면은 약물의 로딩 및 전달에 잠재적으로 적용 가능합니다.

합성된 ChrGO의 생체 적합성

합성된 ChrGO의 생체적합성은 약물 전달에 적용하는 데 중요합니다. ChrGO 및 GO의 세포 독성을 세포독성 분석으로 조사하였다. Cos-7 세포와 BT-474 세포를 ChrGO 또는 GO의 존재 하에 24시간 동안 배양했습니다. 세포 독성의 결과는 그림 6에 나와 있습니다. ChrGO는 Cos-7 및 BT-474 세포에 명백한 세포 독성을 나타내지 않았다고 결론지을 수 있습니다. 100μg/mL의 농도에서도 세포 생존율은 90% 이상이었습니다. 그러나 GO는 100μg/mL 농도에서 Cos-7 및 BT-474 세포에 대해 각각 73.0 ± 0.5% 및 71.0 ± 0.5%의 세포 생존율로 용량 의존적 방식으로 상당한 세포 독성을 나타냈습니다. 그 결과 GO 표면에 작용화된 키토산은 세포독성이 현저히 낮고 생체적합성이 향상됨을 보여주었다. 거대분자를 사용한 GO의 표면 기능화는 세포독성 효과를 현저하게 약화시키는 것으로 보고되었습니다[45]. Hu et al. 세포 배지에 있는 태아 소 혈청은 비-소세포성 폐암 A549 세포에서 GO의 세포 독성을 현저하게 감소시킨다고 보고했습니다[46].

GO와 ChrGO의 생체적합성. 다양한 농도의 나노입자를 a Cos-7 셀 및 b BT-474 세포, 그리고 세포 생존율에 미치는 영향 확인

약물 적재 및 방출

약물 담체로서 ChrGO의 잠재적인 생물의학적 응용은 약물 로딩 및 방출 거동으로 측정됩니다. 그래핀 유도체의 구조적 특성은 비표면적이 매우 커서 방향족 약물 전달에 매우 효과적이다. 아드리아마이신은 다양한 혈액암 및 고형암에 대한 일차 종양 화학요법제 중 하나로, 그래핀 유도체 약물 전달 시스템을 평가하기 위한 모델 약물로 자주 사용된다[47]. ChrGO 나노시트에 대한 아드리아마이신의 로딩 용량은 490nm에서 아드리아마이신의 특징적인 UV-Vis 흡광도 피크에 의해 확인되었습니다. 예상대로 ChrGO 나노시트에 결합된 아드리아마이신의 최대 로딩 효율은 169.8%로 높았으며, 이는 부분적으로 ChrGO 나노시트의 넓은 표면적에 기인합니다. 아드리아마이신이 로딩된 ChrGO/아드리아마이신 나노복합체는 생리학적 완충액에 쉽게 분산되어 약간 붉은 색을 띠는 투명한 용액을 표시했습니다.

ChrGO/adriamycin 복합체에서 adriamycin의 방출 프로필을 조사하기 위해 PBS의 다른 pH 값을 도입하여 종양 세포 환경을 모방했습니다. 추가 파일 1:그림 S2는 pH 5 및 7.4에서 ChrGO/아드리아마이신으로부터 아드리아마이신의 누적 방출 프로파일을 보여줍니다. ChrGO/adriamycin에서 방출된 아드리아마이신은 pH 5.0 PBS 용액에서 초기의 빠른 방출과 느린 방출 단계를 특징으로 합니다. 아드리아마이신의 누적 방출은 처음 3시간 동안 6.5%였으며 이후 pH 5.0에서 96시간 내에 26.7%로 천천히 증가했습니다. 대조적으로, ChrGO/아드리아마이신의 아드리아마이신 백분율은 더 느리게 증가하고 pH 7.4에서 더 낮았으며, 아드리아마이신의 방출 백분율은 초기 3시간 2.5%에서 96시간 7.4%로 나타났습니다. 이전 연구에서는 pH 7.4의 배지에서 기능화된 GO의 약물 방출 프로필이 매우 느리게 나타났습니다[48]. ChrGO의 카르복실기의 양성자는 아드리아마이신과 ChrGO 사이의 π-π 스태킹, H-결합 및 정전기적 상호작용을 감소시켜 아세트산 매질에서 아드리아마이신의 방출을 촉진합니다[49]. pH 감도는 ChrGO/아드리아마이신에 부위 특이적 약물 전달 가능성을 제공하여 결과적으로 종양 세포의 세포독성을 증가시킵니다.

ChrGO/아드리아마이신 복합체의 치료 효능

HER2-과발현 BT-474 암세포 내 ChrGO/adriamycin 복합체의 치료 효능은 증식 억제 분석에 의해 조사되었습니다. HER2 수용체의 과발현은 BT-474 유방암 세포의 변형에서 핵심적인 역할을 합니다. Treatment with trastuzumab alone, an anti-HER2 monoclonal antibody, results in significant growth inhibition of BT-474 cells [50]. As shown in Fig. 7a, after treatment with ChrGO/adriamycin complexes, the cell viability of BT-474 cells was decreased significantly, demonstrating a dosage-dependent toxic effect. Besides, when compared to free adriamycin, the ChrGO/adriamycin complexes demonstrated a less effective performance in killing BT-474 cells, which was ascribed to the gradual diffusion of loaded adriamycin rather than direct treatment with free adriamycin [51]. However, the therapeutic efficacy of the ChrGO/adriamycin complexes was close to that of free adriamycin as their concentration of ChrGO/adriamycin complexes increased, which can be explained by the sustained adriamycin release from the ChrGO carrier.

아 In vitro cell viability of BT-474 cells incubated with concentrations of free adriamycin and adriamycin loaded in ChrGO/adriamycin complexes, b cytotoxicity of ChrGO/adriamycin complexes (5 μg/mL) in combination with trastuzumab (5 μg/mL) in BT-474 cells. Adria:adriamycin. **p  < 0.01, ***p <0.001

To study whether trastuzumab, an anti-HER2 monoclonal antibody, could improve the antitumour activity of equivalent amounts of adriamycin loaded on ChrGO, BT-474 cells were treated with trastuzumab alone or in combination with ChrGO/adriamycin. Treatment with trastuzumab alone produced a significant inhibition of BT-474 proliferation, which is consistent with a previous report [52]. The combined therapy with trastuzumab and ChrGO/adriamycin resulted in an enhanced cell growth inhibition effect, as shown by a reduction of 88.5% compared with a reduction of 54.5% with trastuzumab alone (5 μg/mL) and 59.5% with equivalent ChrGO/adriamycin alone (5 μg/mL) versus the negative control (Fig. 7b). The results suggest that the ChrGO system may be effectively used to develop composites for combination therapies, and the combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in a modest, but significant, reduction of cell viability compared to each drug alone.

Cell Cycle Analysis and Apoptosis

To determine whether the ChrGO/adriamycin complexes have effects on cell cycle progression, a cell cycle assay of ChrGO/adriamycin complexes alone or in combination treatment with trastuzumab was performed on BT474 cells. As shown in Fig. 8a, flow cytometry analysis revealed that trastuzumab alone increased the cell population in the G0/G1 phase. Treatment with ChrGO/adriamycin alone mediated a significant reduction in the number of G0/G1 cells and accumulation in S phase and G2/M phase compared to control cells. Besides, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab mediated S phase arrest, accompanied by a significant decrease in the number of cells in the G0/G1 phase. While ChrGO/adriamycin is most active in the S phase of the cell cycle, ChrGO/adriamycin treatment with trastuzumab can cause an increase in G0/G1 phase compared to ChrGO/adriamycin alone. A previous report showed that trastuzumab can cause cell arrest in the G1 phase [53]. Adriamycin inhibits cell proliferation and DNA replication, ultimately leading to cell cycle arrest [54].

아 Cell cycle analysis after treatment with ChrGO/adriamycin alone or in combination with trastuzumab in BT-474 cells, b effect of ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) on induction of apoptosis in BT-474 cells. Adria:adriamycin. **p  < 0.01, ***p <0.001

To assess the effects of ChrGO/adriamycin on apoptotic molecules, BT-474 cells were treated for 48 h with either ChrGO/adriamycin, trastuzumab, or a combinational treatment of both agents. For the visualization of apoptosis, caspase 3/7 activity has been extensively used as an apoptosis-specific marker due to its activity related to the process of apoptosis [55]. As observed from Fig. 8b, compared to the negative control, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) alone significantly increased the caspase 3/7 activity. However, trastuzumab (5 μg/mL) alone did not significantly increase caspase 3/7 expression, suggesting that trastuzumab does not induce apoptosis. In contrast, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) significantly increased caspase 3/7 activity compared to that with each drug alone. The dual-targeted therapy showed higher apoptosis, indicating superior therapeutic efficacy due to the presence of different mechanisms of action. Similar to other studies, adriamycin amplifies the apoptotic response in HER2-overexpressing cancer cells [56]. In conclusion, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab induces cell cycle arrest and apoptosis, which ultimately results in augmented cell death.