폐암 표적 영상을 위한 CKAP4 항체 결합 Si 양자점 미셀

방법

시약

소 혈청 알부민(BSA)은 Sigma에서 구입했습니다(assay ≥ 98%; Missouri, USA). Adamas-beta로부터의 테트라히드로푸란(THF)(순도:99.9%; 스위스 바젤); Aladdin(Shanghai, China)의 DSPE-PEG-COOH; Abcam의 CKAP4 항체(0.55mg/mL, Cambridge, UK); Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 및 Hyclone(미국 유타주)의 인산염 완충 식염수(PBS); Gibco(뉴욕, 미국)의 소태아 혈청(FBS) 및 티리신; 파라포름알데히드(4%), Triton X-100을 사용한 면역염색 투과성 완충액 및 Beyotime(중국 상하이)의 면역염색을 위한 차단 완충액; Solarbio의 글리세린(순도 ≥ 99%; 중국 베이징); 및 Kingmorn의 트립신(0.25%, 중국 상하이)

악기

투과 전자 현미경(TEM) 이미지는 JEM-2100F 전자 현미경(JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 촬영했습니다. JEM Zetasizer Nano-ZS90(Malvern Instruments, Malvern, UK)을 사용하여 수경을 측정했습니다. UV-Vis 흡수 스펙트럼은 Cary 50 분광 광도계(Varian, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 얻었습니다. F-182 4500 분광광도계(Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 형광 방출 스펙트럼을 얻었다. X-선 광전자 분광법(XPS)은 RBD로 업그레이드된 PHI-5000C ESCA 시스템(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 수행되었습니다. 광발광(PL) 양자 수율(QY)은 형광 분광계(FLS1000, Edinburgh Instruments, Livingston, England)를 사용하여 추정되었습니다. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)은 Thermo IS50(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)을 사용하여 수행되었습니다. X선 회절(XRD)은 SmartLab(Rigaku Corporation, Tokyo, Japan)에서 테스트했습니다.

셀

A549 및 293 T 세포주는 Shanghai Institute of Cell Biology(중국 상하이)에서 구입했습니다.

Si QD 미셀의 준비

먼저, 하이드로실릴화 반응에 의해 dodecly-Si 양자점을 제조하고 THF에 용해하여 이전에 보고된 방법에 따라 dodecly-Si 양자점 용액(15 mg/mL)을 제조하였다[12]. 그런 다음 DSPE-PEG-COOH 20mg을 10mL 탈이온수에 녹이고 혼합하여 DSPE-PEG-COOH 용액(2mg/mL, 10mL)을 제조했습니다. 그 후, dodecly-Si QDs 용액(15mg/mL, 66μL)을 10mL DSPE-PEG-COOH 용액에 천천히 적가했습니다. 3분 동안 초음파 교반 후 투명하고 투명한 용액을 얻었다. 그런 다음 용액을 흄 후드에 넣고 어둠 속에서 12시간 동안 교반했습니다. 그 후 용액을 24시간 동안 투석한 후 3일 동안 동결건조하여 Si QD 미셀을 얻었다.

Si QD Micelles-CKAP4의 준비

이 연구에서 CKAP4 항체는 EDC에 의해 카르복실기를 활성화함으로써 Si QD 미셀과 접합되었다[14]. 방법은 다음과 같습니다. 4mg의 Si QD 미셀을 900μL PBS에 분산시켜 Si QD 미셀 용액을 제조했습니다. EDC(10mg)를 PBS 100μL에 첨가하여 EDC 용액을 제조했습니다. 그런 다음 100µL의 EDC 용액을 900µL의 Si QD 미셀에 천천히 첨가하고 5분 동안 초음파 교반했습니다. 또한, 20μL의 CKAP4 항체를 천천히 첨가하고, 용액 혼합물을 암실 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 그런 다음 제품을 4000rpm에서 15분 동안 한외여과했습니다. PBS로 3회 세척한 후 Si QD micelles-CKAP4로 명명하였다.

세포독성 시험

이 연구에서는 트리판 블루를 사용하여 나노 물질의 생물학적 안전성을 테스트했습니다[15]. A549 및 293 T 세포를 24웰 플레이트(1 × 10 ⁶ /well) 37°C에서 12시간 동안 배지를 버린 후 일련의 농도의 Si QD 미셀 또는 Si QD 미셀-CKAP4(Si 농도:0–152 µg/mL)를 24웰 플레이트에 추가하고 37°C에서 2시간 동안 배양했습니다. 배지를 버린 후, 세포를 수집하고 PBS로 2회 세척하였다. 트리판 블루를 세포 현탁액과 1:1의 비율로 혼합했습니다. Countstar를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 감지하고 기록했습니다. 세포생존율(%) =생세포수/(생세포수 + 죽은세포수) × 100. 3개의 생물학적 복제물을 사용하였다. 통계 분석에는 Prism 소프트웨어(버전 7.01; GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 사용했습니다. 데이터는 Dunnett의 사후 테스트와 함께 양방향 ANOVA를 사용하여 분석되었습니다. 통계적 유의성은 P로 설정되었습니다. <0.05. *피 <0.05; **피 <0.01; 및 ***P <0.001.

시험관 내에서 폐암 세포를 표적으로 하는 나노물질

시험관내 폐암 세포에 대한 Si QD 미셀 및 Si QD 미셀-CKAP4의 표적화 능력은 다음과 같이 검출되었다:먼저, A549 세포를 레이저 공초점 접시(3 × 10 ⁵ 세포/접시) 37°C에서 12시간 배지를 버린 후, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 1mL 파라포름알데히드(4%)를 세포에 첨가하고 25°C에서 10분 동안 인큐베이션했습니다. 파라포름알데히드를 버리고 PBS로 3회 세척하였다. 다음으로 Triton X-100이 포함된 면역염색 투과 완충액 1mL를 세포에 첨가하고 25°C에서 10분 동안 배양했습니다. Triton X-100으로 면역염색 투과 완충액을 버린 후, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 면역염색용 차단 완충액 1mL를 세포에 첨가하고 25°C에서 10분 동안 배양했습니다. 면역염색을 위해 차단 완충액을 버린 후, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음 200μL Si QD 미셀 또는 Si QD 미셀-CKAP4(Si 농도 150μg/mL)를 세포에 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양했습니다. 나노물질을 버린 후 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 사진은 레이저 공초점 현미경(Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 촬영되었습니다. 여기광은 405nm로 설정되었고 방출 파장은 630nm로 설정되었습니다.

시험관 내 정상 세포에 대한 Si QD 미셀 및 Si QD 미셀-CKAP4의 표적화 능력은 다음과 같이 감지되었습니다. 먼저, 293 T 세포를 1 × 10 ⁶ 의 밀도로 1.5mL Eppendorf 튜브에 수집했습니다. 세포/관. 1000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버렸다. 다음으로, 1mL 파라포름알데히드(4%)를 세포에 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션했습니다. 1000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버렸다. 그 다음 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음 Triton X-100이 포함된 1mL 면역염색 투과 완충액을 세포에 첨가하고 25°C에서 10분 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리했습니다. 상층액을 버리고 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음 면역염색용 차단 완충액 1mL를 세포에 첨가하고 25°C에서 10분 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리했습니다. 상층액을 버리고 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 200μL Si QD 미셀 또는 Si QD 미셀-CKAP4(Si 농도 150μg/mL)를 세포에 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양했습니다. 1000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 침전물을 PBS로 3회 세척했습니다. 세포를 수확하고 현미경 슬라이드를 준비했습니다. 현미경은 레이저 공초점 현미경을 사용하여 수행되었습니다. 여기광은 405nm로 설정되었고 방출 파장은 630nm로 설정되었습니다.

세 가지 독립적인 실험을 수행했습니다. 평균 형광 강도의 정량적 분석은 ImageJ 소프트웨어(Bethesda, MD, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 통계 분석에는 Prism 소프트웨어(버전 7.01)를 사용했습니다. 데이터는 Dunnett의 사후 테스트와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 분석되었습니다. 통계적 유의성은 P로 설정되었습니다. <0.05. ***피 <0.001.

종양 보유 마우스 모델

Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.(중국 상하이)에서 10마리의 수컷 누드 마우스(5~6주)를 구입했습니다. 모든 마우스는 Tongji University의 Experimental Animal Center(Shanghai, China)에서 특정 병원체 없는(SPF) 조건하에 수용되었습니다. 종양 보유 마우스 모델을 확립하기 위해 마우스에 1 × 10 ⁶ 을 피하 주사했습니다. A549 세포. 종양 직경이 6mm에 도달했을 때 종양 보유 마우스를 실험에 사용했습니다. 모든 마우스 실험은 기관 지침에 따라 수행되었으며 Tongji University의 Institutional Animal Use and Care Committee의 승인을 받았습니다.

시험관 내 폐암 조직을 표적으로 하는 Si QD Micelles-CKAP4

종양이 있는 마우스를 마취 하에 희생시켰다. 종양 및 정상 폐 조직을 수집하여 파라핀 절편을 제조하였다. 탈수, 항원 회수 및 혈청 차단 후, Si QD 미셀 또는 Si QD 미셀-CKAP4(Si 농도 150μg/mL)를 조직에 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양했습니다. 나노물질을 버린 후, 조직을 PBS로 3회 세척하였다. 조직을 4', 6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)로 10분 동안 염색했습니다. PBS로 3회 세척한 후, 조직에 변색 방지 배지를 첨가하고 25°C에서 5분 동안 배양했습니다. 변색방지 배지를 버린 후, 조직을 PBS로 3회 세척하였다. 여기 파장이 405nm이고 방출 파장이 630nm인 형광 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 사진을 촬영했습니다. 세 가지 독립적인 실험을 수행했습니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 평균 적색 형광 강도의 정량적 분석을 수행했습니다. 통계 분석에는 Prism 소프트웨어(버전 7.01)를 사용했습니다. 데이터는 Dunnett의 사후 테스트와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 분석되었습니다. 통계적 유의성은 P로 설정되었습니다. <0.05. ***피 <0.001.

생체 내 형광 이미징

실험에서 9마리의 종양 보유 마우스를 3개의 그룹(Si QD 미셀-CKAP4 주입군, Si QD 미셀 주입군 및 식염수 주입군)으로 나누었다. Si QD 미셀-CKAP4 주입 그룹의 마우스에 200μL의 Si QD 미셀-CKAP4(Si:4mg/kg)를 정맥 주사했습니다. Si QD 미셀 주입 그룹의 마우스에 200μL의 Si QD 미셀(Si:4mg/kg)을 정맥 주사했습니다. 식염수 주입 그룹의 마우스에 200μL 식염수를 정맥 주사했습니다. 형광 이미지는 서로 다른 시점(0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4시간)에서 획득했습니다. Si QD 미셀-CKAP4 주사 그룹의 마우스를 마취하고 4시간에 안락사시켜 심장, 간, 비장, 폐, 신장 및 종양에서 형광 신호를 감지했습니다. 본 연구에서는 PE 필터 세트(λ)와 함께 VISQUE Invivo Smart-LF(VIEWORKS, 경기도, 한국)를 사용하여 형광 이미징을 수행했습니다. _흥분 450–500nm, λ _방출 600–650nm). 통계 분석에는 Prism 소프트웨어(버전 7.01)를 사용했습니다. 데이터는 Dunnett의 사후 테스트와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 분석되었습니다. 통계적 유의성은 P로 설정되었습니다. <0.05. *피 <0.05; **피 <0.01.

헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색

이 연구에서 12마리의 종양이 있는 마우스에 식염수(200μL), Si QD 미셀(Si:4mg/kg, 200μL) 또는 Si QD 미셀-CKAP4(Si:4mg/kg, 200μL)를 주사했습니다. 꼬리 정맥을 통해. 24시간 후, 마우스를 안락사시켰습니다. H&E 염색은 심장, 간, 비장, 폐 및 신장에서 수행되었습니다. 광학현미경으로 병리학적 변화를 관찰하였다[14, 16].

결과

Si QD 미셀의 준비 및 특성화

먼저 dodecyl-Si 양자점은 이전에 발표된 보고서(Scheme 1, Step 1)에 따라 하이드로실릴화에 의해 제조되었습니다[12]. 보고된 데이터와 유사하게 우리 그룹이 합성한 dodecyl-Si 양자점은 메틸벤젠에 잘 분산되어 있습니다[12]. TEM은 dodecyl-Si 양자점이 비교적 균일한 크기를 갖는 구형임을 보여주었다. TEM 이미지에서 dodecyl-Si QD의 크기는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정되었습니다. 데이터에 따르면 dodecyl-Si QD의 직경은 4.1~5.3nm 범위이며 평균 직경은 약 4.7nm입니다(그림 1a). dodecyl-Si QD의 확대 이미지에서 명백한 격자 무늬가 관찰될 수 있습니다(그림 1a). 이 연구에서는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 격자의 평면 거리를 측정했습니다. 데이터에 따르면 격자 무늬 사이의 평균 거리는 약 0.35nm로 이전에 보고된 dodecyl-Si QD(0.34nm)와 거의 동일합니다. 따라서 본 연구에서 합성된 dodecyl-Si 양자점은 좋은 결정성을 보였다[12]. 동적 광산란(DLS)은 평균 6.5nm에서 4.8~13.5nm 범위의 dodecyl-Si QD의 유체역학적 직경을 보여주었습니다(그림 1b).

폐암 조직에서 Si QD 미셀-CKAP4 준비 및 표적 생물학적 이미징의 개략도

아 dodecyl-Si 양자점의 TEM 이미지; ㄴ dodecyl-Si 양자점의 수경 분포; ㄷ Si QD 미셀의 TEM 이미지; d Si QD 미셀의 수경 분포; 이 Si QD 미셀-CKAP4의 TEM 이미지; 에 Si QD 미셀-CKAP4의 수경 분포; 지 Si QD 미셀의 C1s X선 광전자 분광법(XPS) 스펙트럼; 아 Si QD 미셀-CKAP4의 C1s XPS 스펙트럼

수분산성 Si QD 미셀을 제조하기 위해 DSPE-PEG-COOH에서 자가 조립하여 dodecyl-Si QD를 수정했습니다(Scheme 1, Step 2)[12]. 여기에서 F127 대신 DSPE-PEG-COOH를 사용하여 표면에 카르복실기가 있는 Si QD 미셀을 제조했습니다. 결과는 Si QD 미셀이 물에 잘 분산되었음을 보여주었다. TEM 이미지는 Si QD 미셀이 Si QD가 삽입된 구형 입자임을 보여주었다. Si QD 미셀의 직경은 22.7~54.6nm 범위였으며 평균 직경은 약 34.3nm였습니다(그림 1c). DLS는 Si QD 미셀의 유체역학적 직경이 43.8~615.9nm 범위이며 평균은 58.7nm임을 보여주었습니다(그림 1d). Si QD 미셀의 평균 제타 전위는 약 - 20.7mV였습니다. 이 연구에서는 Si QD 미셀의 구성을 조사하기 위해 FTIR을 수행했습니다(추가 파일 1:그림 S1A). 데이터는 NH, C-H, O-H 및 C=O의 신축 진동 흡수 피크가 3430, 2920, 2850 및 1640cm ^-1 에 있음을 보여주었습니다. , 각각; C–H 및 O–H의 굽힘 진동 흡수 피크는 1460 및 1400cm ⁻¹ 에 있었습니다. , 각각; Si–C, C–O 및 P–O–C의 신축 진동 흡수 피크는 1250, 1100 및 951cm ⁻¹ 에 있었습니다. , 각각; Si–H 및 O=C–N의 굽힘 진동 흡수 피크는 850 및 526cm ^-1 에 있었습니다. , 각각. 이 데이터는 DSPE-PEG-COOH의 특성 그룹(예:N–H, O–H, C=O, C–O, P–O–C 및 O=C–N)과 도데실-Si 양자점(예:Si-C 및 Si-H)은 Si 양자점 미셀의 FTIR 스펙트럼에서 찾을 수 있으며, 이는 도데실-Si 양자점이 DSPE-PEG-COOH에 의해 자가 조립된 미셀에 성공적으로 캡슐화되었음을 나타냅니다. 또한, Si QD 미셀은 XRD로 특성화되었습니다(추가 파일 1:그림 S1B). Si QD 미셀의 회절 피크는 날카로워 Si QD 미셀의 결정성이 양호함을 나타낸다. XRD 패턴에서 2θ에서 피크 27.073, 28.451, 56.598, 73.145는 실리콘의 (100), (002), (112), (203) 결정면에 해당하며(PDF # 80-0005), 이는 Si QD가 성공적으로 캡슐화되었음을 나타냅니다. Si QD 미셀. 2θ에서 피크 31.692, 45.431, 66.200, 75.260 및 83.955의 값은 NaCl의 (200), (220), (400), (420) 및 (422) 결정면에 해당합니다(PDF # 77-2064). Si QD 미셀에 NaCl의 존재에 대한 합리적인 설명은 다음과 같습니다. Si QD 미셀 준비 후, 우리는 Si QD 미셀을 PBS에 용해시켜 Si QD 미셀에 NaCl이 존재하게 했습니다.

UV 가시광선 흡수 스펙트럼은 Si QD 미셀의 흡수 범위가 200~500nm 범위임을 보여줍니다(그림 2a). 여기 파장이 330nm인 경우 Si QD 미셀의 형광 방출 스펙트럼에서 650nm의 강한 형광이 관찰되었습니다(그림 2b). Si QD 미셀 수용액(Si 농도:80 µg/mL)은 자연광에서 투명하고 투명했습니다. 그러나 365nm UV 광에서 강한 적색 형광을 방출했습니다(그림 2c). 이 연구에서는 형광 분광계(FLS1000)를 사용하여 절대 PL QY를 테스트했습니다. 여기 파장은 365nm였습니다. 데이터에 따르면 Si QD 미셀의 절대 PL QY는 약 14.49%였습니다.

아 Si QD 미셀 및 Si QD 미셀-CKAP4의 UV-가시광 흡수 스펙트럼; ㄴ Si QD 미셀 및 Si QD 미셀-CKAP4의 형광 방출 스펙트럼; ㄷ 자연광(왼쪽) 및 365nm UV 광선(오른쪽)에 노출된 Si QD 미셀 및 Si QD 미셀-CKAP4의 이미지

Si QD 미셀-CKAP4의 제조 및 특성화

우리는 EDC를 사용하여 Si QD 미셀과 CKAP4 항체를 접합했습니다(Scheme 1, Step 3)[14]. TEM 이미지는 Si QD 미셀-CKAP4가 Si QD가 삽입된 구형 입자임을 보여주었다. Si QD 미셀-CKAP4의 직경은 24.4~67.7nm 범위이며 평균 직경은 약 35.5nm입니다(그림 1e). DLS는 Si QD 미셀-CKAP4의 유체역학적 직경이 58.7~824.9nm 범위에서 평균 78.8nm로 Si QD 미셀보다 약간 큰 것으로 나타났습니다(그림 1f). 이러한 증가는 CKAP4 항체의 접합 때문일 수 있습니다. C1s XPS 스펙트럼은 C1s 영역에서 C(O)O(288.81eV), C=O(286.5eV), C–O(285.76eV), C–N(285.25eV), C의 6가지 유형의 탄소 원자를 보여주었습니다. –C(284.88eV) 및 C–H(284.34eV)(그림 1g). 그러나 C(O)O의 피크는 Si QD 미셀-CKAP4의 XPS 스펙트럼에서 거의 사라졌으며, 이는 카르복실기와 1차 아민 간의 접합이 성공적임을 나타냅니다. 따라서 CKAP4 항체는 Si QD 미셀과 성공적으로 접합되었습니다(그림 1h). Si QD 미셀-CKAP4의 평균 제타 전위는 Si QD 미셀보다 약 - 10.7 mV였습니다. 위 현상에 대한 설명은 다음과 같다. Si QD 미셀 표면에는 카르복실기가 많다. 따라서 Si QD 미셀은 강한 음전기를 나타냈다. 그러나, Si QD 미셀-CKAP4에서 CKAP4 항체의 커플링은 Si QD 미셀-CKAP4 표면의 카르복실기의 감소를 초래하였다; 따라서 Si QD 미셀-CKAP4의 평균 제타 전위가 증가했습니다.

UV 가시광선 흡수 스펙트럼은 Si QD 미셀-CKAP4의 흡수 범위가 200~500nm 범위임을 보여주었으며, 이는 Si QD 미셀의 결과와 유사합니다(그림 2a). 여기 파장이 330nm일 때 형광 방출 스펙트럼에서 Si QD 미셀-CKAP4에서 640nm의 강한 형광이 관찰되었습니다(그림 2b). 이러한 결과는 항체 접합이 Si QD 미셀-CKAP4의 형광 특성에 유의한 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다. Si QD 미셀-CKAP4 수용액(Si 농도:80µg/mL)은 자연광에서 투명하고 투명했습니다. 365nm UV 광에서 Si QD 미셀의 결과와 일치하는 강한 적색 형광을 방출할 수 있습니다(그림 2c). PL QY 테스트 결과 Si QD 미셀-CKAP4의 절대 PL QY는 약 16.96%였습니다.

Si QD Micelles-CKAP4 시험관 내 세포독성 시험

인간 폐암 세포주 A549 및 인간 신장 상피 세포주 293 T를 표적 세포로 사용하여 Si QD 미셀 및 Si QD 미셀-CKAP4의 생물학적 안전성을 조사했습니다. 이 연구에서 다양한 농도의 Si QD 미셀과 Si QD 미셀-CKAP4(Si 농도 0, 2.375, 4.75, 9.5, 19, 38, 76, 152 µg/mL)를 37℃에서 A549 또는 293 T 세포와 함께 먼저 배양했습니다. °C에서 2시간 세포 생존력은 트립판 블루를 사용하여 감지되었습니다(그림 3)[15]. Si QD 미셀 및 Si QD 미셀-CKAP4의 ID50은 GraphPad 소프트웨어를 사용하여 얻었습니다. 데이터에 따르면 Si QD 미셀의 ID50은 A549 및 293 T 세포에서 152μg/mL 이상이었습니다. Si QD 미셀-CKAP4의 ID50은 A549 세포에서 25.94μg/mL, 293 T 세포에서 72.69μg/mL였습니다. 이러한 결과는 Si QD 미셀-CKAP4의 세포독성이 Si QD 미셀의 세포독성보다 유의하게 높았고, A549 세포에서 Si QD 미셀-CKAP4의 세포독성이 293 T 세포의 세포독성보다 유의하게 높음을 나타내었다. 이러한 현상은 보체 의존적 세포독성 때문일 수 있다[17]. 또한 이러한 결과는 Si QD 미셀-CKAP4가 폐암 세포보다 정상 세포에서 더 높은 생물학적 안전성을 나타냄을 나타내어 생체 내 적용의 기반을 마련했습니다.

A549 a의 세포 생존율 및 293 T b 다양한 농도의 Si QD 미셀 및 Si QD 미셀-CKAP4(Si 농도:0, 2.375, 4.75, 9.5, 19, 38, 76, 152 µg/mL)와 함께 2시간 동안 배양(n =3; 평균 ± SD; Dunnett의 사후 검정을 사용한 양방향 ANOVA; *피 <0.05; **피 <0.01; 및 ***P <0.001)

Si QD Micelles-CKAP4 시험관 내 폐암 세포 표적화

시험관 내 폐암 세포에서 Si QD 미셀-CKAP4의 표적화 기능을 추가로 조사하기 위해 A549 및 293 T 세포를 표적 세포로 사용했습니다. Si QD 미셀 및 Si QD 미셀-CKAP4는 먼저 A549 및 293 T 세포와 함께 37°C에서 2시간 동안 배양되었습니다. 타겟팅 효과는 레이저 공초점 현미경을 사용하여 감지되었습니다(그림 4). 그 결과 Si QD 미셀-CKAP4 인큐베이션 A549의 적색 형광이 Si QD 미셀-CKAP4 및 293 T 동시 인큐베이션 그룹, Si QD 미셀 및 A549 공동 인큐베이션 그룹, Si QD 미셀보다 유의하게 더 높음을 보여주었습니다. 및 293 T 공동 인큐베이팅 그룹. 이러한 결과는 Si QD 미셀-CKAP4가 시험관 내에서 A549 세포를 특이적으로 표적화할 수 있음을 나타냅니다.

시험관 내에서 A549 세포를 표적으로 하는 Si QD 미셀-CKAP4의 능력 검출. 아 A549 및 293 T를 Si QD 미셀-CKAP4 및 Si QD 미셀(Si 농도 150μg/ml)과 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션했습니다. 상층액을 버리고 두 번 세척한 후 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Bar, 25μm)으로 세포 사진을 찍었습니다. ㄴ 평균 형광 강도의 정량적 분석은 ImageJ(n =3; 평균 ± SD; Dunnett의 사후 검정을 사용한 일원 분산 분석; ***피 <0.001)

Si QD Micelles-CKAP4 시험관 내 폐암 조직 표적화

폐암 조직을 표적으로 하는 Si QD 미셀-CKAP4의 가능성을 탐구하기 위해 우리는 A549 조직에 대한 Si QD 미셀-CKAP4의 표적화 특성을 확인하기 위한 시험관 내 실험을 설계했습니다. 이 연구에서, A549 세포는 마우스에 피하로 접종되었다. 종양 형성 후, A549 종양 조직 및 정상 폐 조직을 수집하고 Si QD 미셀 및 Si QD 미셀-CKAP4와 함께 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션했습니다. 타겟팅 효과는 레이저 공초점 현미경을 사용하여 감지되었습니다(그림 5). 결과는 Si QD 미셀-CKAP4로 배양된 A549 조직이 405nm의 여기 파장에서 강한 적색 형광을 방출할 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 Si QD 미셀 배양 A549 조직, Si QD 미셀-CKAP4 배양 정상 폐 조직, Si QD 미셀 배양 정상 폐 조직에서는 약한 적색 형광만이 관찰되었다. Si QD 미셀-CKAP4 배양 A549 조직의 적색 형광은 Si QD 미셀 배양 A549 조직, Si QD 미셀-CKAP4 배양 정상 폐 조직 및 Si QD 미셀 배양 정상 폐 조직보다 유의하게 높았다. 이러한 데이터는 Si QD 미셀-CKAP4가 시험관 내에서 폐암 조직을 효과적으로 표적화할 수 있음을 나타내며, 이는 폐암에 대한 잠재적인 형광 조영제로 추정됩니다.

시험관 내에서 A549 조직을 표적으로 하는 Si QD 미셀-CKAP4의 능력 검출. 아 A549 조직 및 정상 폐 조직을 Si QD 미셀-CKAP4 및 Si QD 미셀(Si 농도:150μg/ml)과 함께 37℃에서 2시간 동안 배양했습니다. 두 번 세척한 후 조직을 DAPI로 염색하여 핵을 시각화했습니다. 조직은 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Bar, 200μm)으로 사진을 찍었습니다. ㄴ 평균 적색 형광 강도의 정량적 분석은 ImageJ(n =3; 평균 ± SD; Dunnett의 사후 검정을 사용한 일원 분산 분석; ***피 <0.001)

생체 내 형광 이미징

9마리의 종양이 있는 마우스를 3개의 그룹(Si QD 미셀-CKAP4 주입군, Si QD 미셀 주입군 및 식염수 주입군)으로 나누었다. Mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were intravenously injected with 200 µL Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg). Mice in the Si QD micelle injection group were intravenously injected with 200 µL of Si QD micelles (Si:4 mg/kg). Mice in the saline injection group were intravenously injected with 200 µL saline. Fluorescence images were acquired at different time points (0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, and 4 h). The significant fluorescence signals were not observed in lung cancer tissues among all the mice in the three groups (data not shown). This might be because of the weak fluorescence penetration of the Si QD micelles-CKAP4 and Si QD micelles.

The mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were anesthetized and euthanized at 4 h to detect the fluorescence signal in their heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor. Data showed that a significant fluorescence signal could be observed in the liver, kidney, and tumor tissues. However, there was no significant fluorescence signal in the heart, spleen, or healthy lung tissues (Fig. 6). The significant fluorescence signal in the liver and kidney indicated that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. In addition, the fluorescence signal in A549 tumor tissues was significantly higher than that in healthy lung tissues. This phenomenon contributed to the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer tissues. These results indicate that Si QD micelles-CKAP4 specifically targets lung cancer tissue, which is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.

아 Bright photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. ㄴ Fluorescence photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. ㄷ Relative fluorescence intensities of heart, liver, spleen, lung, kidney and tumor tissue (n = 3; mean ± SD; one-way ANOVA with Dunnett’s post test; *피 <0.05; **P  < 0.01)

Biosafety Evaluation of Si QD Micelles-CKAP4 In Vivo

Finally, we investigated the acute toxicity of the Si QD micelles-CKAP4 in vivo. In this study, tumor-bearing mice (n  = 12) were intravenously injected with saline (200 µL), Si QD micelles (Si:4 mg/kg, 200 µL), or Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg, 200 µL) and then euthanized 24 h later. H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys are shown in Fig. 7. Compared with saline-injected mice, there were no evident pathological changes in the major organs of Si QD micelles-injected mice and Si QD micelles-CKAP4-injected mice. The above data indicated that Si QD micelles (Si:4 mg/kg) and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) showed no significant toxicity in vivo.

H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys in tumor-bearing mice injected with saline, Si QD micelles (Si:4 mg/kg), and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) for 24 h (magnification:200×)