SPIO 나노입자의 합성 및 파킨슨병에 대한 줄기 세포 라벨링의 후속 적용

재료 및 방법

자료

철 아세틸아세토네이트, TREG(트리에틸렌 글리콜), 디에틸렌 글리콜 및 PEG는 Aladdin Industrial Corporation(중국 상하이)에서 구입했습니다. 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT)는 Sigma-Aldrich Corporation(Shanghai, China)에서 구입했습니다. Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM), 트립신-EDTA(0.25%) 및 태아 소 혈청(FBS)은 Thermo Fisher Scientific에서 구입했습니다. 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염 및 N-히드록시 숙신이미드는 Sigma-Aldrich(중국)에서 구입했습니다. N,N-디메틸포름아미드, 에틸 알코올 앱솔루트 및 에틸 아세테이트는 Sinopharm Chemical Reagent Corporation에서 구입했습니다. 초순수는 Millipore 순수 및 초순수 정수 시스템에 의해 생산되었습니다. 항인간 CD90-FITC, 항인간 CD45-PE, 항인간 CD34-FITC 및 항인간 CD105-PE는 Biolegend에서 구입했습니다.

USPIO의 합성

USPIO는 선행 연구[18,19,20,21]와 같이 폴리올법으로 합성하였다. 실험 단계는 다음과 같습니다. 철 아세틸아세토네이트 1mmol과 TREG 25mL를 아르곤, 구형 응축관 및 온도계가 연결된 3구 플라스크에 혼합했습니다. 15분 동안 아르곤 흐름과 함께 배양한 후, 혼합물을 120℃로 가열하고(가열 속도는 3°C/min) 1시간 동안 유지한 다음, 혼합물을 동일한 가열 속도로 250°C까지 더 가열하고 유지했습니다. 30분 동안 반응 혼합물을 실온으로 자연 냉각하고 무수 에틸 알코올 2mL로 희석한 다음 에틸 아세테이트로 침전시켰다. 침전물을 8000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 수집한 다음 무수 에틸 알코올에 재현탁했습니다. USPIO는 추가 사용을 위해 4°C의 무수 에틸 알코올에 보관되었습니다.

PAA/PEG 코팅된 USPIO의 준비

USPIO-PAA는 이전 보고서[22]에 따라 인수되었습니다. 구체적으로 폴리아크릴산(PAA) 1.5g을 디에틸렌글리콜 24mL에 녹였다. 5분 아르곤 흐름 후, 혼합물을 110°C로 가열하고 용액이 투명해질 때까지 유지했습니다. 초음파 분산 후 상기 정제된 용액에 이전 단계에서 제조된 USPIO 28mg을 함유하는 에탄올 분산액을 첨가하였다. 용액을 최종적으로 3°C/분의 속도로 210°C로 가열했습니다. 환류 2시간 후 반응을 중단하고 실온으로 자연 냉각했습니다. 냉각 후 반응액에 에틸아세테이트를 첨가하여 USPIO 나노입자를 침전시킨 후 8000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 침전물을 에탄올에 분산시킨 후 에틸 아세테이트로 침전시켰다. 3회 세척 과정을 거친 후 USPIO-PAA를 초순수에 분산시켜 사용하였다. 생체 적합성을 향상시키기 위해 EDC 및 NHS 매개 아미드화에 의해 PEG를 나노 입자 표면에 추가로 연결했습니다[23]. 0.45g의 PEG를 5ml의 초순수에 용해시키고 20mg의 EDC 및 12mg의 NHS가 보충된 15ml USPIO-PAA 분산액(35mg Fe 함유)에 첨가했습니다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 기계적으로 교반한 후, 회전 증발 장치에서 40℃에서 물을 제거하면서 10 ml의 DMF 용매를 첨가하였다. 마지막으로 40mg DEC 및 24mg NHS를 혼합물에 첨가하고 실온에서 48시간 동안 혼합했습니다. 반응 용액을 72시간 동안 초순수에 담긴 투석 백에 옮기고, 그 동안 12시간마다 초순수를 교체하였다. 혼합물을 한외여과 튜브로 추가로 옮겨 10분 동안 4000rpm에서 원심분리하여 Mr> 30kD의 분자를 수집했습니다. 최종 생성물을 초순수에 용해시키고 4°C에서 보관했습니다. 일부 경우에 물에 용해된 SPIO-PAA/PEG는 한외여과 원심분리 튜브(> 30KD 공극 크기, Millipore)로 원심분리하여 수집하고 펠릿을 추가 실험을 위해 진공 오븐에서 건조했습니다.

NP 특성화

샘플의 입자 크기, 크기 분포 및 형태를 TEM으로 분석했습니다. 코팅층은 음성 염색으로 측정하였다. 초음파 분산 후 수용액에 용해된 USPIO-PAA와 USPIO-PAA/PEG를 300mesh 탄소 지지막의 구리망에 첨가하고 자연 건조시킨 후 투영전자현미경(Tecnai G2F20 s-twin, FEI)에 넣었다. 관찰을 위해.

적외선 분광법 분석은 Agilent Technologies Cary 600 시리즈 FTIR 분광계에서 수행되며, 여기서 건조된 샘플 분말은 검출을 위해 샘플 탱크에 직접 추가됩니다.

USPIO-PAA/PEG 분산액의 Fe 함량은 PerkinElmer Analyst 700 모델인 화염 원자 흡수 분광법(FAAS)에 의해 결정되었습니다. 먼저, 1, 2, 3, 4 및 5μg/mL 철 표준 용액이 표준 곡선에 따라 100μL USPIO-PAA 또는 USPIO-PAA/PEG 분산 용액을 질산으로 녹이고 50mL 부피 플라스크에서 철 함량을 측정했습니다.

나노입자의 자기공명영상은 수주대학교 제1부속병원 영상과에서 자기장 3T의 임상스캐너로 진행하였다. 나노 입자를 해당 농도에 따라 1% 아가로스 겔 용액에 분산시켰다. 용액이 응고된 후, 다중 에코 시퀀스에 의해 샘플의 가로 이완 시간을 측정했습니다. MRI 획득을 DICOM 형식으로 내보낸 다음 RadiAnt DICOM 뷰어를 사용하여 열고 회색 값을 읽고 다른 에코 시간의 회색 값을 피팅을 위해 원점으로 가져와서 농도가 다른 USPIO 분산의 가로 이완 시간 값을 얻었습니다.; 마지막으로, USPIO-PAA 및 USPIO-PAA/PEG 샘플의 가로 완화율 r2는 1/T2의 가로 완화율과 샘플의 Fe 농도로 선형 피팅하여 얻었습니다. USPIO-PAA 및 USPIO-PAA/PEG의 자기 히스테리시스 루프는 앞서 설명한 방법에 따라 쑤저우 과학 기술 대학의 Quantum Design DynaCool-9 장치를 사용하여 획득했습니다[24].

HADSC 격리 및 식별

모든 연구는 '인간배아줄기세포 연구에 관한 윤리적 지침'(2003년 중화인민공화국 과학기술부 및 보건부) 및 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 지방 샘플은 Soochow University의 첫 번째 부속 병원에서 사전 동의와 윤리적 승인을 받아 얻은 것입니다. 지방조직을 세척하고 해부학적 현미경으로 혈관과 결합조직을 제거한 후 작은 조각으로 자른다. 블록을 37°C에서 30분 동안 유형 I 콜라게나제(0.3pzu/mL)로 분해한 다음 500g에서 원심분리했습니다. 10분 동안 세포 펠릿을 DMEM + 10% FBS에 현탁시키고 8 × 10 ⁴ 의 밀도로 시딩했습니다. /cm ² . 48시간 후, 부유 세포를 포함하는 오래된 배지를 버리고 새로운 배지로 교체했습니다.

HADSC는 중간엽(CD90 및 CD105) 및 조혈(CD34 및 CD45) 줄기 세포를 특이적으로 표지하는 표면 마커에 대한 유세포 분석을 특징으로 합니다. 총 1 × 105 세포를 수확하고 CD34, CD45, CD90 및 CD105 마우스 항인간 모노클로날 항체 및 적절한 이소타입 대조군에 대한 PE, FITC, APC/cy7 또는 PerCP-접합 항체와 함께 인큐베이션했습니다. 유세포 분석기(LSRFortessa, BD, USA)를 사용하여 염색된 세포를 분석하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했습니다. CD90+, CD105+, CD34- 및 CD45-의 4가지 표현형을 HADSC의 표면 마커로 선택했습니다. 세포 표면 마커의 발현 수준은 유세포 분석(BD LSRFortessa)에 의해 확인되었습니다.

HADSC의 지방 형성 및 골 형성 분화는 각각 Oil Red O 및 Alizarin Red Staining에 의해 평가되었습니다. HADSC는 MesenCult™ Adipogenic Differentiation 배지(Stem cell Tech., 05412) 또는 OriCell™ Osteogenic Differentiation Kit(Cyagen, HUXMA-90021)로 배양되었습니다. HADSC의 지방생성 분화를 위해 14일째에 지질이 채워진 성숙한 지방세포에 대한 정성적 Oil Red O 염색에 의해 세포를 평가하였다(VivaCell Biosciences, C37A00150). HADSC의 골형성 분화를 위해 21일째에 세포를 Alizarin Red Staining으로 성숙한 골세포의 칼슘 결절에 대해 평가했습니다(VivaCell Biosciences, C37C00150). 도립 Nexcope 현미경을 사용하여 이미지를 획득했습니다.

USPIO-PAA/PEG의 체외 세포 흡수 및 생체 적합성 평가

HADSC는 밀도가 1 × 10 ⁶ 인 6웰 플레이트에 플레이팅되었습니다. 우물 당. 세포를 USPIO-PAA/PEG(Fe 10μg/mL 및 0.1μg/mL)가 포함된 배지와 함께 2시간 동안 인큐베이션하고 세포내 Fe 식별을 위해 Prussian blue(PB) 염색으로 염색했습니다.

USPIO-PAA/PEG의 생체적합성은 MTT 비색 및 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 통합 분석(EdU 증식 키트, Thermo)에 의해 결정되었습니다. MTT의 경우 HADSC를 5 × 10 ³ 의 밀도로 96웰 플레이트에 플레이팅했습니다. 웰당 다른 농도(0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg/mL)의 USPIO-PAA/PEG 24시간, 48시간 또는 72시간 배양. 20μl MTT 용액(5mg/mL)을 각 웰에 4시간 동안 첨가한 다음 150μL 디메틸 설폭사이드를 첨가하여 결정을 용해했습니다. 각 구멍의 흡광도 값은 효소 표지 기기(BioTek Synergy HT)를 사용하여 OD 570nm에서 측정되었습니다. EdU 분석의 경우 HADSC를 160 Fe μg/mL에서 SPIO-PAA/PEG와 함께 72시간 동안 배양한 다음 10μM EdU와 함께 24시간 동안 배양했습니다. 세포를 수집하고 4% 파라포름알데히드로 고정하고 2mg/mL 글리신으로 중화했습니다. 침투 세포를 염료 용액(Azide 647 복합체)과 함께 배양한 후, EdU 혼입 속도를 유세포 분석으로 평가했습니다.

6-OHDA 유도 PD 모델

15~20마리의 수컷 Wistar 쥐(SPF 등급, 무게 220 ± 20g)가 PD 동물에 대한 USPIO-PAA/PEG 표지 HADSC의 생체 내 추적에 사용되었습니다. 모든 절차는 중국 규정(실험 동물에 관한 사무 관리 규정, 2017)에 따라 수행되었으며 중국 과학 아카데미의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 전반적으로 동물은 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 제어된 조명(12/12시간 명암 주기, 오전 7시에 "켜짐") 하에 수용되었습니다. PD 모델은 쥐의 편측 선조체에 6-하이드록시도파민(6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, USA)을 2점 주입하여 준비했습니다. 이전에 설명된 대로[25, 26], 쥐에게 3μL의 6-OHDA 용액(5μg/μL)을 2개의 좌표(AP:1.2mm, ML:2.2mm, DV:- 4.0~6.0mm, 및 AP:− 1.0mm, ML:4.4mm, DV:− 4.5~6.5mm). 아포모르핀 유도 회전(0.5mg/kg, 피하) 테스트를 사용하여 PD 모델의 유효성을 테스트했습니다. 쥐에게 6-OHDA 치료 후 1, 2, 3주에 아포모르핀(0.5mg/kg)을 피하 주사하고 회전 점수를 30분 동안 열린 필드에서 평가했습니다. PD 모델은 아포모르핀에 의해 유도된 분당 7회 이상의 회전을 가지며 성공한 것으로 간주되었습니다.

세포 이식 및 생체 내 MRI 영상

HADC는 80% 합류에 도달했을 때 2시간 동안 USPIO-PAA/PEG(철 농도는 10μg/mL)와 함께 배양되었습니다. PD 모델 준비 3주 후, 3 × 10 ⁶ USPIO-PAA/PEG로 표지된 HADC 또는 식염수를 PD 쥐 모델의 왼쪽 선조체에 다음 좌표(AP:1.2mm, ML:2.2mm, DV:- 4.0 ~ 6.0mm)에서 주입했습니다. 이식을 받은 동물에게 수술 직후와 수술 후 2일 동안 부프레노르핀(0.5mg/kg)을 투여했습니다. 이 동물들은 이식 수술 후 1주, 2주 또는 3주에 아포모르핀 유도 회전 테스트를 받았습니다.

생체 내 MRI의 경우 식염수 또는 HADSC 주사 후 3, 9, 15 및 21일째에 생체 내 영상 시스템(IVIS) 작은 동물 영상 시스템(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 동물의 영상을 촬영했습니다.

조직학 분석

나머지 쥐 모델의 뇌를 채취하여 줄기 세포 이식 후 3주째에 분석을 위해 30mm 두께로 절단했습니다(n =그룹당 5). 절편을 항-티로신 수산화효소(TH, abcam, England)와 함께 배양하고 Alexa-594-접합된 당나귀 항 토끼 항체(Abcam)로 시각화했습니다. DAPI는 핵을 이용한 대조염색에 사용되었습니다. 이미지는 Leica TCS SP5 공초점 현미경을 사용하여 캡처되었습니다.

통계 분석

수치 데이터는 평균 ± SD로 표현하였다. 데이터는 차이를 평가하기 위해 GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 양측 스튜던트 t 테스트 또는 일원 ANOVA에 적용되었습니다. *는 p를 나타냅니다. <0.05 및 NS는 유의한 차이가 없음을 나타냅니다.

결과

나노입자의 합성 및 특성화

실험 설계는 그림 1에 나와 있습니다. 소수성 USPIO NP는 열분해 방법을 사용하여 준비되었습니다. 그림 2a–c에서 볼 수 있듯이 원래 USPIO NP의 직경은 4.07 ± 0.57nm였습니다. PAA로 코팅하여 USPIO-PAA NP의 직경이 6.34 ± 0.54nm로 증가했습니다. PEG로 NP를 추가로 수정하면 USPIO-PAA/PEG NP의 직경이 10.07 ± 0.55nm에 이릅니다. 3개의 나노입자는 모두 구형이었고 균일하게 분산되었다. 통계 분석에서는 유의한 차이가 있음을 보여주었습니다(F =10, **p <0.01, ##p <0.01) USPIO, USPIO-PAA 및 USPIO-PAA/PEG NP의 직경 중 PAA 및 PEG로 성공적인 수정을 나타냅니다(그림 2d).

실험 설계의 개략도

나노 입자의 특성화. a–c USPIO NP의 대표적인 TEM 이미지(a ), USPIO-PAA NP(b ) 및 USPIO-PAA/PEG NP(c ). d 통계 분석은 USPIO, USPIO-PAA 및 USPIO-PAA/PEG의 입자 크기 사이에 상당한 차이를 나타냈습니다(n =그룹당 20). 이 USPIO, USPIO-PAA 및 USPIO-PAA/PEG NP의 나노입자의 푸리에 변환 적외선. 화살표는 1728cm ⁻¹ 에서 비흡수 피크를 나타냅니다. PAA 수정으로 인해 1595cm ⁻¹ 및 3440cm ⁻¹ PEG 변형 때문입니다. 수치 데이터는 mean ± SD, **p로 표시됩니다. <0.01 대 USPIO NP, ##p <0.01 대 USPIO-PAA/PEG NPs. 막대는 20nm를 나타냅니다.

적외선 흡수법을 사용하여 USPIO-PAA가 1728cm ⁻¹ 에서 명백한 카르보닐 흡수 피크를 가지고 있음을 발견했습니다. PAA 분자의 카르보닐 스트레칭 진동 피크로 인해; USPIO-PAA/PEG에는 1595cm ⁻¹ 에서 탄소-질소 결합 면내 굽힘 진동 피크가 있습니다. 3440cm ⁻¹ 에서 수산기의 신축 진동 피크 (그림 2e). 이러한 모든 데이터는 PAA 또는 PEG 분자가 NP의 표면으로 성공적으로 변형되었음을 추가로 확인했습니다.

USPIO-PAA/PEG는 시험관 내 자기 반응 및 HADSC와의 생체 적합성이 우수함

USPIO-PAA 및 USPIO-PAA/PEG의 체외 이미징 능력은 다양한 농도(Fe 농도와 동일)에서 MRI 이미지의 그레이스케일 값으로 평가되었습니다. 피팅 후, 다른 농도에서 분산액의 가로 이완 시간 값을 얻었습니다. 횡이완율 1/T2를 수직좌표로, Fe 농도를 수평좌표로 하여 USPIO-PAA의 횡이완율을 107.94 s ⁻¹ 로 계산하였다. mm ⁻¹ (그림 3a) 및 84.65s ⁻¹ mm ⁻¹ USPIO-PAA/PEG용(그림 3b). 두 입자 모두 우수한 MRI 영상 특성을 보여주었다. SPIO-PAA 및 SPIO-PAA/PEG의 자기 히스테리시스 루프는 SPIO-PAA의 포화 자화 값이 10,000 Oe 이상에서 57 emu/g이고(그림 3c), SPIO-PAA/PEG 중 하나는 40 emu/g 10,000 Oe 이상(그림 3d). 보자력과 잔류성은 0에 가까웠으며(그림 3c, d), SPIO-PAA와 SPIO-PAA/PEG가 모두 초상자성임을 나타냅니다.

합성된 USPIO-PAA 및 USPIO-PAA/PEG NP의 시험관 내 자기 반응. 아 , b USPIO-PAA NP의 MRI 및 가로 이완율(a ) 및 USPIO-PAA/PEG NP(b ). r ₂ 이완율을 나타냅니다. USPIO-PAA 및 USPIO-PAA/PEG NP의 이완율은 107.94s ⁻¹ 였습니다. mM ⁻¹ 및 84.65 s ⁻¹ mM ⁻¹ . ㄷ , d USPIO-PAA NP의 자기 히스테리시스 루프(c ) 및 USPIO-PAA/PEG NP(d ). 자기 히스테리시스는 최대 자기장 강도 50,000 Oe(5 Telsa)로 295k(21.85°C)에서 측정되었습니다. 포화 자화 값은 SPIO-PAA의 경우 57 emu/g, SPIO-PAA/PEG의 경우 40 emu/g에 가까웠습니다. 두 곡선의 자화 히스테리시스는 0에 가까웠습니다.

USPIO-PAA/PEG NP를 HADSC와 다른 시간 동안 배양함으로써 USPIO-PAA/PEG NP가 세포의 생존에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 발견했습니다(p> 0.05). HADSC의 세포 생존율은 등가 Fe 농도가 0~160μg/mL 범위일 때 96% 이상으로 유지됩니다. 또한, 배양 시간의 증가(24시간에서 72시간으로)는 각 Fe 농도에서 상당한 세포 손실을 유도하지 않습니다(그림 4a). USPIO-PAA/PEG NP가 다른 농도에서 iPSC와 함께 배양되었을 때 유사한 관찰이 얻어졌습니다(그림 4b). HADSC를 72시간 동안 160μg Fe/mL USPIO-PAA/PEG로 처리했지만, EdU 통합 비율로 표시되는 증식 능력은 USPIO-PAA/PEG의 존재에 의해 손상되지 않았습니다(그림 4c). 이 모든 데이터는 합성된 USPIO-PAA/PEG NP의 생물학적 안전성을 나타냅니다.

합성된 USPIO-PAA/PEG NP는 우수한 생체 적합성과 표지 기능을 보여줍니다. 아 , b HADSC 또는 iPSC는 24, 48, 72시간 동안 다양한 농도(0, 10, 20, 40, 80 및 160μg Fe/mL의 Fe 농도와 동일)에서 USPIO-PAA/PEG NP와 함께 배양되었으며 세포 생존율 MTT 방법에 의해 결정되었으며 a에 표시됨 , b , 각각. 다른 NP 농도에서 생존력 사이에는 큰 차이가 없습니다(n =5) 또는 배양 시간(n) =5). ㄷ 유세포 분석은 EdU 통합 속도가 USPIO-PAA/PEG(72시간 동안 160μg Fe/mL)의 존재 또는 부재 하에 배양된 HADSC에서 유사함을 보여주었습니다. EdU로 처리되지 않은 HADSC는 음성 대조군으로 제공되었습니다. d 10μg Fe/mL의 USPIO-PAA/PEG 및 2시간 동안의 배양은 프러시안 블루 염색으로 평가한 바와 같이 HADSC의 거의 100% 라벨링 효율성을 나타냈습니다. 0.1μg Fe/mL(2시간 배양 시간)의 USPIO-PAA/PEG는 HADSC에서 가벼우면서도 균일한 PB 염색을 생성했습니다. 수치 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 막대는 20μm를 나타냅니다.

세포가 USPIO-PAA/PEG NP에 의해 효과적으로 표지될 수 있는지 확인하기 위해 HADSC를 USPIO-PAA/PEG NP와 동등한 Fe 10μg/mL 또는 0.1μg/mL로 2시간 동안 배양했습니다. 그림 4d에서 볼 수 있듯이 USPIO-PAA/PEG(Fe 10μg/mL)가 있는 HADSC의 거의 100%에서 파란색으로 염색된 많은 수의 NP가 관찰되었습니다. USPIO-PAA/PEG의 용량이 0.1μg Fe/ml로 감소했음에도 불구하고 우리는 여전히 거의 모든 HADSC에서 다소 균일하고 분산된 PB 염색을 관찰했습니다. 다른 보고된 SPIO[14, 27, 28]와 비교하여 USPIO-PAA/PEG는 높은 세포 흡수 효율을 나타냈습니다.

PD 쥐 모델에서 USPIO-PAA/PEG NP로 표시된 HADSC의 장기 추적

USPIO-PAA/PEG NP로 표지된 HADSC를 정위 주입에 의해 PD 쥐 모델의 왼쪽 선조체에 이식했습니다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 HADSC 이식 3일 후 왼쪽 선조체에서 명확한 MRI 신호가 관찰되었으며 이식된 세포의 적절한 생체 내 추적을 나타냅니다. 이식 후 D3, D9, D15 및 D21에 대한 동적 관찰은 NP 라벨링이 있는 이식된 세포가 최대 3주까지 명확하게 추적될 수 있음을 보여주었고 MRI 신호는 과정 동안 뚜렷한 감소를 나타내지 않았습니다. 이러한 결과는 합성된 나노입자가 이식된 세포의 생체 내 추적에 대한 좋은 잠재력을 가지고 있음을 나타냅니다.

3일, 9일, 15일, 21일 후 뇌의 대표적인 MRI 이미지는 USPIO-PAA/PEG 라벨링 HADSC 또는 식염수로 이식됩니다. 해당 대조군, 즉 생리식염수를 주입한 정상 쥐 또는 PD 쥐 모델의 MRI 이미지는 각각 첫 번째 및 두 번째 행에 표시되었습니다. 대조군의 음성 신호와 비교하여 USPIO-PAA/PEG 표지 HADSC로 이식된 쥐의 뇌는 최대 21일까지 일정하고 명확한 MRI 신호를 보였습니다. 막대는 5mm를 나타냅니다.

USPIO-PAA/PEG NPs-표지된 HADSC는 PD 모델에서 치료 효과를 나타냄

NP로 표지된 HADSC가 치료 효과를 나타내는지 여부를 평가하기 위해 먼저 분리된 HADSC의 표현형 특성화를 수행했습니다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 배양된 HADSC는 방추형 세포였다. 유세포 분석은 HADSC가 CD90(> 99%) 및 CD105(> 99%)와 같은 중간엽 세포에 대해 고도로 발현된 마커인 반면, CD34 및 CD45와 같은 조혈 마커를 발현하는 것은 거의 없음을 보여주었습니다(그림 6b–g ). HADSC는 특정 조건에서 지방 생성 또는 골 생성 계통으로 분화할 수 있으며 분화 능력은 각각 Oil Red O 또는 Alizarin Red Staining에 의해 표시되었습니다(그림 5h). 대조군 HEK293 세포에서는 이러한 구조가 없는 반면 분화된 HADSC에서는 지질 방울 또는 석회화된 결절을 확인합니다(그림 6h). 이 모든 것은 HADSC가 중간엽 세포의 기준을 충족한다는 것을 나타냅니다.

HADSC 특성화. 아 HADSC가 전형적인 방추형 표현형을 가지고 있음을 보여주는 구 대조 현미경 아래의 대표적인 이미지. b–g HADSC를 CD45, CD105, CD34 및 CD90 마커에 대한 다른 염료와 접합된 항체와 함께 인큐베이션하고 유세포 분석을 수행했습니다. 산포도는 b, c에 나와 있습니다. , 히스토그램은 d–g에 표시됩니다. . 대부분의 세포는 CD90 및 CD105로 발현되었지만 CD34 및 CD45는 발현되지 않았음을 주목하십시오. 아 HEK293 세포에 대한 HADSC의 지방 형성 분화 및 골 형성 분화는 각각 Oil Red O 또는 Alizarin Red 염색에 의해 평가됩니다. 막대는 20μm를 나타냅니다.

6-OHDA 주입 후 1주, 2주, 3주에 apomorphine에 의한 회전은 분당 17.1 ± 1.79, 28.7 ± 1.77, 31.86 ± 1.72로 랫트 PD 모델의 성공적인 확립을 확인시켜주었다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 PD 쥐 모델의 회전 수는 1주, 2주 및 3주에 32.59 ± 1.12, 31.85 ± 1.98 및 31.54 ± 1.73으로 감소한 후 HADSC의 병변 측면 이식에 NPs-labeled 이식이 뒤따랐습니다. 통계 분석은 이식 수술 후 2주째부터 식염수 투여군과 HADSC 투여군 사이에 유의한 차이를 나타냈다(p 두 번째 주에 <0.01, p 3주차에 <0.01; n =5), NP로 표시된 HADSC가 PD 모델의 행동 장애를 개선함을 나타냅니다.

PD 쥐 모델에 6-OHDA로 손상된 동측 선조체에서 식염수 또는 USPIO-PAA/PEG 표지 HADSC를 투여하고 분당 회전 수를 기록하고 비교했습니다. 식염수를 받은 해당 PD 래트와 비교하여 HADSC를 받은 PD 래트 후 2주, 3주에 회전 수의 현저한 감소가 있습니다. ns 미미한 변화를 나타내고 **는 p를 나타냅니다. <0.01. n =각 그룹에 대해 5

PD는 흑색질에서 티로신 수산화효소(TH)를 발현하는 뉴런의 손실을 특징으로 합니다. TH에 대한 면역 염색을 사용하여 우리는 6-OHDA가 흑색질에서 TH 발현 뉴런을 감소시키고 PD 쥐 모델의 선조체에 HADSC를 이식하면 이러한 감소를 완화할 수 있음을 발견했습니다(그림 8). Combined with the observation that cell transplantation alleviates the behavioral impairments of PD rats, we concluded that USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs exert therapeutic effects in PD rat models.

Immunostaining against TH in the substantia nigra of the rats receiving saline (a , d , 지 ), PD rats receiving saline (b , e , h ) or PD rats receiving USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs (c , f , 나 ). The area in the dashed frame indicates the compact area of substantia nigra (SNc) and the ventral tegmental area (VTA). Images in the boxes of d , e , f are enlarged and shown in g , h , 나 , 각각. There are less TH-expressing cells in the SNc and VTA regions in the rats receiving 6-OHDA injection, as compared to the controls receiving saline. Following by HADSC transplantation, more of TH-expressing cells in the SNc of PD rats could be observed. The bar represents 100 μm