분자 도킹 연구로 평가된 항생제 내성 박테리아에 대한 유망한 살균제로서의 다중 농도 Cu:Ag 바이메탈 나노입자 개발

결과 및 토론

XRD 분석은 제형화된 제품의 상의 구성 및 결정 구조를 평가하기 위해 수행되었습니다. 그림 3a는 20°와 80° 사이에 표시된 XRD 패턴을 보여줍니다. 바이메탈 Cu:Ag에서 ~ 38.2°, 46°, 64.4° 및 77.1° 주변에서 관찰된 반사는 JCPDS No 04-0783 [32, 49,50,51,52]. 반면, Cu의 경우 32.6°, 44.2° 및 51°에서 나타나는 회절은 (110), (111) 및 (200) 격자 평면으로 표시되어 각각 fcc 구조의 CuO 및 금속성 Cu의 존재를 확인하고, JCPDS No. 04-0836[32, 53,54,55,56]과 잘 일치합니다. 추출된 패턴에서 Ag 및 Cu 상을 구성하는 NP의 존재를 나타내는 Ag 및 Cu 피크가 모두 관찰되었습니다. 더욱이, Ag 함량이 더 낮은 샘플(예:1:0.025, 1:0.050 및 1:0.075)에 CuO의 존재는 Cu NP가 산화되고 더 낮은 Ag 농도로 인해 고온에서 비보호 거동을 나타냄을 보여줍니다. 52]. 반대로, Ag 함량이 가장 높은 샘플(1:0.1)에서 CuO 피크는 부분적으로 산화물이 없는 제품의 형성을 나타내는 낮은 강도를 나타냅니다[57]. 이것은 Ag의 첨가로 인해 바이메탈 나노입자의 산화 저항성이 향상될 것임을 시사한다[52]. 각 결정학적 평면은 원자 밀도를 기반으로 하는 에너지적으로 구별되는 부위를 포함하는 동안 기기 검출 한계 내에서 불순물의 추가 피크는 검출되지 않았습니다. Cu 및 Ag NP는 모두 평면의 최대 방향을 노출시키는 역할을 하는 (111)에서 높은 원자 밀도 패싯을 가지고 있습니다[51, 58]. Bragg의 법칙을 사용하여 Ag 및 Cu의 d-간격은 각각 0.24 및 0.21nm인 것으로 확인되었으며, 이는 두 요소의 개별 평면(111)에 해당하고 HR-TEM 결과와 일치했습니다(그림 6) [51, 59 ,60,61,62]. 준비된 바이메탈 제품에서 얻은 해당 SAED 링(그림 3b-d)은 잘 결정화된 제품을 보여주고 XRD 패턴과 잘 일치하는 뚜렷한 링 패턴을 나타냅니다.

아 Cu:Ag 바이메탈 NP, b에서 얻은 XRD 프로파일 –d 샘플 b에 대해 HR-TEM을 사용하여 얻은 SAED 링 1:0.025, c 1:0.050 및 d 1:0.10, e 준비된 샘플의 FTIR 스펙트럼

FTIR 스펙트럼은 500~4000cm ⁻¹ 사이에서 기록되었습니다. 도 3에 제시된 바와 같이; 600~900cm ⁻¹ 사이에 위치한 전송 대역 Cu:Ag 결합의 형성으로 인해 발생합니다[63]. ~ 1200 및 1400cm ⁻¹ 주변에서 관찰된 밴드 각각 C–O 및 C–H에 기인합니다. ~ 1800 및 2100cm ⁻¹ 에서 피크가 나타남 PVP 및 NH₄로 인한 C=O 및 NH 결합에 해당 오 [64]. 약 ~ 2800cm ⁻¹ 에서 관찰된 투과율 및 3400cm ⁻¹ C≡N과 수산기(O–H)의 존재에 기인한다[64].

그림 4a는 금속 Ag 및 Cu의 표면 플라즈몬 공명 흡수에 기인하는 340, 410 및 500 nm에 위치하는 명확한 흡수 밴드를 갖는 Ag-Cu 바이메탈 NP의 흡수 스펙트럼을 보여줍니다[52]. 410nm에 나타나는 밴드는 일반적으로 Ag NP의 존재로 인해 발생하며, 510nm에 위치한 후자의 피크는 Cu NP의 존재에 기인합니다[52, 57,58,59, 65,66,67]. 이전에 논의된 XRD 결과에 의해 확인된 바이메탈 개발 대신 바이메탈 NP가 별개의 Ag 및 Cu 상으로 개발되었음을 제안할 수 있습니다[52]. 410nm에서 흡수 밴드의 약간의 적색 편이와 Ag 함량이 증가함에 따라 최대 흡수의 증가가 관찰되었습니다[58]. Tauc 방정식을 사용하여

여기서 α 흡수 계수 [2.303 log(T /d ), 티 투과광이며 d 샘플 셀의 두께를 보여줍니다.], h 플랑크 상수(6.62607015 × 10 ⁻³⁴ )를 상징합니다. Js), \(\nu\)는 빛의 주파수, K 흡수 지수를 보여주고, E _g eV의 밴드 갭 에너지와 같습니다. "n의 값 "는 밴드갭의 전자전이형과 관련이 있다[13, 26, 68, 69]. 준비된 바이메탈 제품의 밴드 갭을 계산한 결과 그림 4b–e와 같이 3.2, 2.9, 2.7, 2.6eV인 것으로 나타났습니다.

바이메탈 b에서 얻은 UV-Vis 스펙트럼 –이 Tauc 플롯 분석

합성된 상태의 Cu:Ag 바이메탈 나노복합체의 SEM 이미지(그림 5a-d)에서 작은 입자가 큰 입자의 표면에 증착되는 것이 관찰되었습니다. Ag 함량이 2.5%에서 7.5%로 증가하면 다양한 형태의 다양한 입자가 형성되어 최종적으로 두툼한 Cu:Ag NP가 됩니다. 또한, 불균일하고 작은 Ag 입자의 축적은 도펀트 농도가 증가함에 따라 증가하여 표면에 더 많은 산란 블록이 나타남을 시사합니다. 이는 Cu에 Ag 도핑이 형태에 미치는 주요 영향을 의미하며, 이는 HR-TEM 현미경 사진으로 더 확인되었습니다(그림 5e–h 참조).

a–d 준비된 제품에서 얻은 SEM 이미지, e–h HR-TEM 현미경 사진

준비된 바이메탈의 형태와 d-간격을 더 자세히 설명하기 위해 10nm 해상도의 HR-TEM을 사용했습니다. 그림 6a에서 Cu NP의 d-간격(0.21nm)은 Cu의 (111)면에 해당하며 XRD 결과에서도 분명합니다(그림 3a). 그림 6b는 층 간격(0.21~0.22nm)의 약간의 증가를 나타내고 (111) 평면과 일치하는 0.24nm 면간 거리를 가진 Ag NP를 보여줍니다. 유사하게, 그림 6c, d는 계산된 층 간격과 바이메탈의 분리된 상을 보여주는 반면, 그림 6e는 Ag 및 Cu NP의 입자 모양을 보여줍니다. HR-TEM 이미지의 입자는 코어-쉘 구조를 가지고 있는 것으로 보입니다. 그림 6d에서는 단일 입자 내에서 Cu와 Ag에서 나오는 격자 무늬가 기록되었습니다. 이것은 불규칙한 준구형 NP를 생성하는 Cu:Ag 비율이 다른 코어-쉘 바이메탈 NP의 형성을 강력하게 시사합니다. 또한 TEM 이미지는 입자가 어둡고 밝은 영역처럼 보이는 것으로 나타났습니다. 단일 입자 내에서 이러한 대조의 변화는 바이메탈 Cu:Ag 입자의 생성을 암시하는 두 가지 별개의 구성 물질의 존재를 나타낼 수 있습니다[70, 71].

a–d 준비된 모든 샘플의 d-간격 측정을 위한 HR-TEM(10nm) 이미지, e 바이메탈 입자를 보여주는 저배율 이미지

EDS 스펙트럼에서 뚜렷한 피크의 존재와 바이메탈에서 유래하는 원소 조성은 Cu:Ag NP의 성공적인 형성을 확인시켜줍니다. 그림 7a는 Cu와 Ag의 명확한 피크를 보여주는 1:0.050 샘플에서 얻은 EDS 스펙트럼을 나타냅니다. 그림 7b는 도핑된 샘플에서 C 및 O의 피크가 감지된 1:010 샘플에서 가져온 것입니다. 탄소 탭이 SEM 검사 중 샘플을 고정하는 데 사용되거나 SEM–EDS 센서의 배경 수로 인해 표시됩니다.

바이메탈 NP에서 얻은 EDS 프로파일

한천 웰 확산 분석을 사용한 Cu:Ag 바이메탈 NP의 시험관내 살균 효능이 표 1에 나와 있습니다. 결과는 합성된 NP 농도와 억제 영역(mm) 사이의 정비례 관계를 보여줍니다. 통계적으로 유의미함(P <0.05) S에 대한 (2.5, 5, 7.5 및 10wt%) Ag 도펀트에 대해 기록된 억제 영역. 아우레우스, 대장균 및 A. 바우만니 범위는 각각 0.85–2.8 mm, 0.55–1.95 mm 및 0.65–1.85 mm입니다(표 1 참조). 모든 결과는 음성 및 양성 대조군으로서 각각 DIW(0 mm) 및 아목시실린(4 mm)과 비교되었습니다. 유사하게, 도핑된 NP의 % 연령 효능은 S에 대해 (21.2-70%), (13.7-48.7%) 및 (16.2-46.2%) 증가했습니다. 아우레우스, 대장균 및 A. 바우만니 , 각각. 전반적인 Cu:Ag 바이메탈 NP는 S에 대해 더 강력한 것으로 밝혀졌습니다. 구균 (즉, 그램 + ive) E와 비교됩니다. 대장균 및 A. 바우만니 (즉, 그램 -ive).

NP의 크기, 농도 및 모양은 나노구조에 의해 생성되는 산화 스트레스에 직접적인 영향을 미칩니다. 증가된 양이온(++) 가용성으로 인해 Ag 도핑된 Cu 바이메탈 NP의 더 큰 중량% 도핑으로 인해 억제 영역(mm) 형태의 살균 효능이 향상되었습니다. 크기와 농도에 대한 살균 작용은 크기와 반비례 관계를 나타냅니다[58, 59]. 나노 크기의 구조는 세포 소기관의 압출 및 궁극적으로 박테리아의 죽음으로 이어지는 박테리아 세포막에 존재하는 활성 산소 종(ROS)을 효율적으로 생성합니다[60]. ROS 생성 외에도 Ag ⁺ 의 양이온 상호작용 및 Cu ⁺⁺ 박테리아 세포막의 음으로 하전된 부분을 사용하면 세포 용해 및 박테리아 붕괴를 통해 농도 증가에서 살균 효능이 향상됩니다[58, 61].

다양한 종류의 나노입자의 생물학적 응용은 지난 수십 년 동안 광범위하게 연구되어 왔습니다. 나노입자의 독특한 특성으로 인해 기존의 항생제를 대체할 수 있는 살균제로서의 잠재력으로 널리 활용되었습니다. 나노입자는 박테리아 세포와 상호작용하고 세포막 투과를 방해하며 주요 대사 경로를 파괴합니다[72]. 박테리아에 대한 나노 입자 독성의 특정 메커니즘을 탐구해야 합니다. NP는 정전기력, 반 데르 발스 힘 또는 소수성 상호작용을 수반하는 박테리아 세포와 상호작용하여 궁극적으로 박테리아를 사멸시키는 것으로 믿어집니다. 효소는 세균 감염에 관여하는 주요 독성 인자로 보고되었으며, 효소를 표적으로 삼아 세균 감염을 억제하는 데 도움이 됩니다[73]. 여기에서 지방산 생합성 경로와 함께 세포벽의 효소 표적에 대한 Cu:Ag NP의 분자 도킹 연구는 활성 주머니 내부의 이러한 NP의 결합 상호 작용 패턴을 확인했습니다. A에 대한 이러한 NP의 시험관 내 항균 가능성을 고려합니다. 바우민니 , S. 구균 및 E. 대장균 , 효소 표적은 살균 활성 이면의 가능한 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 이러한 미생물에서 선택되었습니다.

β가 있는 Cu:Ag 바이메탈 NP의 경우 관찰된 최상의 도킹 형태 - A로부터의 락타마제. 바우민니 Glu272(2.8Å) 및 Ser286(3.2Å)과의 수소 결합 상호작용과 Val292와의 금속 접촉 상호작용이 밝혀진 반면 도킹 점수는 - 4.013kcal/mol이었습니다(그림 8a). 유사하게, Ag-Cu 바이메탈 NP의 결합 점수는 β에 대해 관찰되었습니다. - S로부터의 락타마제. 구균 는 - 4.981kcal/mol로 그림 8b와 같이 Ser403(3.2 Å), Tyr519(3.6 Å), Gln521(3.0 Å) 및 Asn464(3.1 Å)와 H 결합 상호작용을 나타냅니다.

활성 포켓 내부의 Ag-Cu 바이메탈 NP의 결합 상호 작용 패턴. 아 β - A로부터의 락타마제. 바우민니 , b β - S로부터의 락타마제. 구균 . ㄷ , d 활성 포켓 c 내부의 Ag-Cu 바이메탈 NP의 결합 상호 작용 패턴 i>A로부터의 에노일-[아실-담체-단백질] 환원효소(FabI). 바우민니 , d iS로부터의 에노일-[아실-캐리어-단백질] 환원효소(FabI). 구균 , e E에서 FabH의 활성 포켓 내부의 Ag-Cu 바이메탈 NP의 결합 상호 작용 패턴. 대장균

현재 연구 FabI에서 선택된 두 번째 효소 표적은 지방산 생합성 경로에 속하며 분자 도킹 예측은 Cu:Ag 바이메탈 NP가 이 표적에 대한 잠재적 억제제로 제안되었습니다. Cu:Ag Bimetallic NPs는 A의 FabI에 대해 좋은 결합 점수(-3.385 kcal/mol)를 보였습니다. 바우민니 그림 8c와 같이 Ser201(2.7Å), Ala199(3.5Å) 및 Leu198(3.3Å)과 H 결합을 하고 있습니다. 유사하게, S에서 FabI의 활성 부위가 있는 Ag–Cu NP의 가장 잘 도킹된 형태. 구균 결합 점수가 - 3.012kcal/mol인 Gly202(2.5Å) 및 Gln155(2.5Å)와의 H-결합을 보여주었습니다(그림 8d).

또한 E.coli의 FabH에 대한 Cu:Ag 바이메탈 나노입자의 결합 능력 도 평가되었고 관찰된 결합 점수는 그림 8e에 표시된 Thr254(3.5Å), HIE244(2.6Å) 및 Glu302(3.0Å)와 H-결합 상호작용을 갖는 - 4.372kcal/mol이었습니다.