microRNA-499-5p를 복원하면 Sox6을 타겟팅하여 패혈증 유발 폐 손상 마우스를 보호합니다.

자료 및 방법

윤리 기준 준수

모든 동물 실험은 국립 보건원의 실험 동물 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 수행되었습니다. 프로토콜은 Shandong University Cheeloo College of Medicine, Weihai Municipal Hospital의 동물 실험 윤리 위원회에서 승인했습니다.

실험 동물

건강한 수컷 특이적 무병원체 등급 BABL/c 마우스(6-8주령, 체중 18-22g)를 Shandong University(중국 산동)의 실험 동물 센터에서 구입했습니다. 환경은 24 ± 2 °C에서 12번의 명암 주기로 설정되었습니다. 마우스는 무균 음식과 멸균수에 자유롭게 접근하여 처리되었습니다. 실험은 7일 동안 적응 섭식 후 시작되었습니다.

쥐의 맹장 결찰 및 천자(CLP)에 의한 패혈증 유발 폐 손상 모델의 확립

마우스를 무작위로 2개의 그룹으로 나누었습니다:가짜 그룹(n =8) 및 모델 그룹. 마우스는 수술 전 12시간 동안 금식한 후 복강내 주사로 1% 펜토바르비탈 나트륨(70 mg/kg)으로 마취시켰다. 마취의 효과가 관찰되었습니다. 쥐의 호흡과 심장 박동이 관찰되었습니다. 생쥐의 머리와 팔다리를 앙와위 자세로 고정하고 복부 피부를 준비하여 요오도퍼 면봉으로 소독하였다. 모델 그룹의 마우스는 복부 정중선의 중간 부분에 세로 절개(1.0 cm)를 처리하고 복강을 열고 장간막 혈관의 손상을 방지하기 위해 복강에서 맹장을 빼냈습니다. 맹장 끝의 1/2 부분에 1-0 실크 실로 결찰하고 장간막의 반대쪽 가장자리에 16번 천자바늘로 맹장을 천자하였다. 장 내용물을 적당량 압출하였고, 맹장을 다시 넣고 절개를 봉합했습니다. 복강을 개방한 후, 가짜 그룹의 마우스는 맹장만 빼낸 다음 맹장을 다시 넣었습니다. 수술 후 마우스에 0.9% 염화나트륨 용액 1mL를 피하 주사하고 케이지에 분리하여 정기적으로 먹였습니다.

체내 형질감염

모델링 전에 마우스를 7개 그룹(n =8):모델 그룹, miR-499-5p 아고미르 그룹, 아고미르 음성 대조군(NC) 그룹, 작은 간섭 RNA(si)-Sox6 그룹, si-NC 그룹, miR-499-5p 아고미르 + 과발현(oe)-Sox6 그룹 및 miR-499-5p agomir + oe-NC 그룹. 모델링 1시간 전에 마우스를 그룹화에 따라 처리하였다. 마우스를 1% pentobarbital sodium으로 복강내 주사하여 마취시킨 후 45° 기울기의 앙와위 자세로 고정하고 마우스의 혀를 입의 반대쪽으로 옮겨 기도의 개통을 확인하였다. 생쥐의 목 앞쪽 피부를 소독하고 절단하여 기관을 노출시켰다. 형질감염 복합체(50μL)를 마이크로샘플러(그룹에 따라 적하, 동일한 양의 인산완충식염수(PBS)를 모델 그룹에 적하)로 흡수한 다음 천천히 기관에 적하했습니다. 형질감염 후 마우스를 수직으로 회전시켰고 형질감염 복합체가 폐에 완전히 분포되었다[15]. Transfection 과정에서 쥐의 호흡과 심장박동을 관찰하였다. 호흡 및 심정지가 발생한 경우 형질감염을 즉시 중단하고 호흡기관을 폐쇄하지 않았다. 마우스의 호흡과 심장 박동이 안정되었을 때 형질감염을 계속하였다. MiR-499-5p agomir 및 이의 NC뿐만 아니라 Sox6의 해당 플라스미드는 Shanghai GenePharma Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 구입했습니다. 형질감염 후 마우스를 우리에 분리하여 1일 동안 먹인 후 안락사시켰다. 마우스를 복강내 주사로 1% 펜토바르비탈 나트륨으로 마취시키고, 앙와위 자세로 고정한 다음, 복부 대동맥 정맥 절개로 안락사시켰다. 마우스의 피부를 국소적으로 소독하고, 흉강을 개방하고, 기관과 우측 주기관지를 결찰하고, 우측 주기관지를 분리하고, 우측 폐를 제거하였다. 우폐의 하엽을 10% 중성 포르말린에 넣어 병리학적 검사를 하고, 중엽을 재빨리 칭량하여 습중량(W)을 구하여 56℃에서 굽고, 72시간 후 건조중량(D)을 구하여, 따라서 W/D 비율이 계산되었습니다. 우상엽은 mRNA 및 단백질 검출을 위해 액체 질소에 저장되었습니다. 좌측 폐를 생리식염수 0.4mL로 3회 세척하고, 약 1mL의 기관지폐포세척액(BALF)을 채취하여 1.5mL Eppendorf(EP) 튜브에 옮겨 얼음 위에 놓았다. BALF를 1500rpm에서 5분간 원심분리한 후 새로운 EP tube에 옮겨 염증인자 검출을 위해 -80℃에서 보관하였다.

또한, 마우스를 3개의 그룹(n =10/그룹):가짜 그룹, 모델 그룹 및 miR-499-5p 아고미르 그룹(50μL miR-499-5p 아고미르는 수술 1시간 전에 기관에 주입됨). 7일 동안 전체 생존율을 12시간마다 모니터링했습니다. 7일 이내에 마우스의 생존 상태를 관찰하고 miR-499-5p의 독성을 결정하였다[16].

헤마톡실린-에오신(H&E) 염색 및 부상 점수

폐 조직을 파라핀 절편으로 만들고 H&E로 염색하고 광학 현미경으로 관찰했습니다. 미국 흉부 학회(American Thoracic Society)에서 발행한 폐 손상에 대한 병리학적 점수 시스템에 의해 폐 손상(폐포 울혈, 출혈, 호중구 침윤 또는 폐포강 또는 혈관벽의 응집, 폐포벽 비후 및/또는 유리막 형성)을 점수화했습니다. 0점은 병변이 없거나 매우 경미함을 나타냄; 1점은 경미한 병변을 나타냅니다. 2점은 중등도의 병변을 나타냄; 3점은 심각한 병변을 나타냅니다. 4점은 매우 심각한 병변을 나타냈다. 4개 항목의 총점은 폐손상의 총점을 나타낸다[17].

메이슨 염색 및 점수

폐 조직을 파라핀 절편(4μm)으로 만들고 Masson 염색으로 처리했습니다[18]. 콜라겐 섬유, 점액, 연골은 청색, 세포질, 근육, 셀룰로오스 및 신경교는 적색, 세포핵은 청흑색이었다. 반정량적 Ashcroft 점수 시스템[19]에서 0점은 정상 폐를 나타냅니다. 1점은 폐포 또는 기관지 벽의 경미한 섬유질 비후를 나타냄; 3점은 폐 구조의 손상 없이 폐포 또는 세기관지 벽의 중간 정도의 두꺼워짐을 나타냅니다. 5점은 섬유 띠 또는 덩어리를 형성하는 폐 구조 손상을 동반한 섬유증 악화를 나타냄; 7점은 심각한 폐 구조 손상 및 섬유증의 넓은 영역을 나타내며 섬유 띠 또는 덩어리를 형성합니다. 8점은 모든 지역 섬유 패킹을 나타냅니다.

말단 Deoxynucleotidyl Transerase-Mediated Deoxyuridine Triphosphate-Biotin Nick End-Labeling(TUNEL) 염색

폐 조직의 세포 사멸은 TUNEL 키트 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)로 테스트하고 광학 현미경으로 관찰했습니다. 세포 사멸 세포는 핵에서 갈색으로 염색되었습니다. apoptosis index는 TUNEL 양성 세포의 비율을 나타냅니다[20].

면역조직화학

폐 조직 절편을 자일렌으로 탈파라핀화하고 3% 과산화수소와 함께 배양하고 염소 혈청으로 차단했습니다. 그런 다음, Caspase-3(ab13847, 1:500), Caspase-9(ab32539, 1:250) 및 SOX6(ab30455, 1:500, 모두 Abcam, MA, USA)을 면역염색 절편에 대한 항체로 사용했습니다. 광학 현미경(Leica Microsystems, IL, USA)을 사용하여 이미지를 캡처한 다음 Image Pro Plus 6.0 소프트웨어(Media Cybernetics, Rockville, MA, USA)로 분석했습니다[21].

역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)

OMEGA kit(Solarbio science &technology Co., Ltd., Beijing, China)는 폐 조직에서 total RNA를 추출하고 RNA 농도를 측정하기 위해 채택되었습니다. 상보적 DNA(cDNA)는 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)에 따라 역전사하여 구성되었습니다. 프라이머는 표 1과 같이 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 설계하였다. PCR 반응은 FastStart Universal SYBR Green Master(Rox) kit(Roche)에 따라 진행하였다. 실험은 2 ^{−△△Ct로 정량분석하였다.} 방법. U6은 miR-499-5p의 loading control이었고, GAPDH는 다른 유전자의 내부 매개변수였다[22].

서부 얼룩 분석

폐 조직을 치료하기 위해 방사성 면역 침전 분석 용해 완충액을 사용하여 총 단백질을 수집했습니다. 총 단백질 농도는 비신코닌산 방법으로 측정하였다. 단백질 시료(30 μg)를 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel 전기영동으로 처리한 후 polyvinylidene fluoride 멤브레인으로 옮겨 5% 탈지분유로 차단하여 1차 항체인 Sox6(ab30455, 1:1000, Abcam), Caspase와 반응시켰다. -3(9661, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, USA), Caspase-9(9502, 1:1000, Cell Signaling Technology), 종양 괴사 인자-α(TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam ), 인터루킨-1β(IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, USA), IL-6(ab6672, 1:1000, Abcam) 및 GAPDH(sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA). 그런 다음 멤브레인을 2차 항체(1:2000)와 함께 배양하고 향상된 화학 발광에 의해 개발했습니다[23].

효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)

BALF에서 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 수준은 ELISA 키트(Boster, Hubei, China)에 의해 결정되었습니다. 비색 측정은 450 nm에서 수행되었습니다.

산화 스트레스 지수 감지

폐조직을 액체질소로 칭량하여 저온 조건에서 일정 비율의 식염수로 희석한 후 균질화하여 저온에서 4℃, 3000 r/min, 20분간 원심분리하고 상등액을 취하여 측정하였다. myeloperoxidase(MPO)의 활성은 MPO 검출 키트(NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China)에 의해 테스트되었으며, malondialdehyde(MDA), superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GSH-Px) 및 catalase(CAT)가 테스트되었습니다. JianCheng Bioengineering Institute에서 제공한 키트로.

이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석

Sox6은 생물학적 웹사이트(http://www.targetscan.org/vert_72/)에 근거한 miR-499-5p의 표적 유전자일 수 있다. miR-499-5p와 Sox6 mRNA 3' 비번역 영역(UTR) 사이에는 4개의 결합 부위가 있었습니다. pmiR-RB-REPORT-Sox6 야생형(WT) 및 pmiR-RB-REPORT-Sox6 돌연변이형(MUT) 벡터는 Guangzhou RiboBio Co., Ltd.(Guangdong, China)에 의해 구축되었으며, 해당 루시페라제 리포터 플라스미드는 다음과 같습니다. 생성. TC-1 세포(마우스 폐 상피 세포, 1 × 10 ⁵ 세포/웰, Shanghai Yiyan Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China)를 24웰 플레이트에 접종하고 miR-499-5p agomir 또는 agomir-NC, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT 또는 Lipofectamine2000을 통한 pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT. 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석 시스템(Promega, WI, USA)을 적용하여 루시퍼라제 활성을 측정했습니다.

통계 분석

모든 데이터는 SPSS 21.0(IBM Corp. Armonk, NY, USA) 소프트웨어로 분석되었습니다. 측정 데이터는 평균 ± 표준 편차로 전달되었습니다. 두 그룹 간의 비교는 t에 의해 수행되었습니다. 검정에서 여러 그룹 간의 비교는 일원 분산 분석(ANOVA)으로 평가되었으며 Tukey의 사후 검정은 ANOVA 분석 후 쌍별 비교에 사용되었습니다. 생존곡선은 Kaplan-Meier 방법으로 작성하였다. 피 value <0.05는 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다.

결과

패혈증 유발 폐 손상 마우스의 폐 조직에서 miR-499-5p가 감소하는 반면 W/D 비율 및 Sox6은 증가

miR-499-5p의 독성은 패혈증 마우스의 생존 시간을 감지하기 위해 마우스에서 테스트되었습니다. 결과는 (그림 1a) 가짜 그룹의 생쥐의 7일 이내 생존율이 100%였고 패혈증 생쥐의 생존율이 감소했음을 보여줍니다. miR-499-5p 처리 후 패혈증 마우스의 생존율이 개선되었습니다. 폐 조직의 W/D 비율 결과(그림 1b):가짜 그룹에 비해 모델 그룹(P <0.05). agomir NC군과 si-NC군에 비해 miR-499-5p agomir군과 si-Sox6군에서 W/D 비율이 감소하였다(둘 다 P <0.05). miR-499-5p agomir + oe-NC 그룹에 비해 miR-499-5p agomir + oe-Sox6 그룹에서 W/D 비율이 현저히 높아졌습니다(P <0.05).

패혈증 유발 폐 손상 마우스의 폐 조직에서 miR-499-5p가 감소하는 동안 W/D 비율 및 Sox6이 증가했습니다. 아 Kaplan-Meier가 만든 생쥐의 생존 곡선. ㄴ 각 그룹에서 폐 조직의 W/D 비율. ㄷ 마우스의 폐 조직에서 miR-499-5p의 발현. d 마우스의 폐 조직에서 Sox6 mRNA의 발현. 이 웨스턴 블롯 분석에 의한 Sox6의 단백질 밴드. 에 쥐의 폐 조직에서 Sox6의 단백질 발현. 지 쥐의 폐 조직에 대한 Sox6 면역조직화학. (a) P <0.05 대 가짜 그룹. (b) 피 <0.05 대 agomir NC 그룹. (c) 피 <0.05 대 si-NC 그룹. (d) P <0.05 vs miR-499-5p agomir + oe-NC 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시되었으며, 데이터는 일원 분산분석(one-way ANOVA) 후 Tukey 사후 검정으로 평가되었습니다.

MiR-499-5p 및 Sox6 발현이 감지되었고 우리는 다음을 발견했습니다(그림 1c–f):sham 그룹과 달리 miR-499-5p는 감소하고 Sox6은 모델 그룹에서 증가했습니다(둘 다 P <0.05). agomir NC 그룹과 관련하여 miR-499-5p 아고미르 그룹에서 miR-499-5p가 증가하고 Sox6이 감소했습니다(둘 다 P <0.05). si-NC 그룹과 비교하여, si-Sox6 그룹에서 Sox6 우울(P <0.05). miR-499-5p agomir + oe-NC 그룹과 비교하여 Sox6은 miR-499-5p agomir + oe-Sox6 그룹에서 극적으로 상승했습니다(P <0.05).

패혈증 마우스의 폐 조직에서 Sox6의 단백질 함량은 면역 조직 화학에 의해 결정되었습니다(그림 1g). 가짜 그룹에 비해 Sox6 단백질 발현이 모델 그룹에서 증가하는 것으로 관찰되었습니다(P <0.05); agomir NC 그룹과 si-NC 그룹에 비해 miR-499-5p agomir 그룹과 si-Sox6 그룹에서 더 낮은 Sox6 단백질 발현을 조사했습니다(둘 다 P <0.05); miR-499-5p agomir + oe-NC 그룹에 비해 MiR-499-5p agomir + oe-Sox6 그룹(P <0.05).

복원된 miR-499-5p 또는 고갈된 Sox6은 폐 조직 병리를 완화하고, 폐 손상 점수, 콜라겐 섬유 및 패혈증 유발 폐 손상의 폐 섬유증 정도를 감소시킵니다. 마우스

H 염색 결과(그림 2a):sham 그룹에서 폐 조직 구조가 손상되지 않았으며, 폐포 중격은 기본적으로 부종이나 염증 없이 나타났으며, 폐포강이 깨끗했습니다. 모델에서 agomir NC, si-NC, miR-499-5p agomir + oe-Sox6 군에서는 삼출, 부종, 출혈이 폐조직의 대부분의 폐포강에서 관찰되었고, 염증세포의 대량 침윤이 폐간질에서 나타났다. miR-499-5p agomir, si-Sox6, miR-499-5p agomir + oe-NC군에서는 모델군에 비해 폐조직의 병변이 감소하였다.

<그림>

복원된 miR-499-5p 또는 고갈된 Sox6은 패혈증 유발 폐 손상 마우스에서 폐 조직 병리를 완화하고 폐 손상 점수, 콜라겐 섬유 및 폐 섬유증 정도를 감소시킵니다. 아 쥐의 폐 조직에서 H 염색 결과. ㄴ 각 그룹에서 마우스의 폐 조직 손상 점수. ㄷ 마우스에서 폐 조직의 Masson 염색. d 각 그룹에서 마우스의 폐 섬유증 점수. (a) P <0.05 대 가짜 그룹. (b) 피 <0.05 대 agomir NC 그룹. (c) 피 <0.05 대 si-NC 그룹. (d) P <0.05 vs miR-499-5p agomir + oe-NC 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시되었으며, 데이터는 일원 분산분석(one-way ANOVA) 후 Tukey 사후 검정으로 평가되었습니다.

마우스 폐 손상 점수와 반정량적 Ashcroft 점수 결과는 다음을 보여주었습니다(그림 2b,d):가짜 그룹과 관련하여 폐 손상 점수와 폐 섬유증 정도는 모델 그룹에서 분명히 향상되었습니다(P> <0.05). agomir NC 그룹 및 si-NC 그룹에 비해 폐 손상 점수 및 폐 섬유증 정도는 miR-499-5p agomir 및 si-Sox6 그룹에서 감소했습니다(둘 모두 P <0.05). miR-499-5p agomir + oe-NC군과 대조적으로 miR-499-5p agomir + oe-Sox6군에서는 폐 손상 점수와 폐 섬유증 정도가 현저히 높아졌다(P <0.05).

Masson 염색 결과(그림 2c):sham 그룹에서 마우스 폐 조직에는 소량의 파란색 콜라겐 섬유가 포함되어 있습니다. 모델, agomir NC, si-NC 및 miR-499-5p agomir + oe-Sox6 그룹에서 콜라겐 섬유가 증가했습니다. miR-499-5p agomir 군, si-Sox6 군, miR-499-5p agomir + oe-NC 군에서 모델 군에 비해 콜라겐 섬유가 감소하였다.

복원된 miR-499-5p 또는 고갈된 Sox6은 패혈증 유발 폐 손상 마우스의 폐 조직에서 TUNEL 양성 세포, Caspase-3 및 Caspase-9 단백질 발현을 감소시킵니다

Western blot, TUNEL 염색 및 면역 조직 화학 결과는 (그림 3a-f) :정상 핵은 파란색이었고 세포 사멸 핵은 다른 색조로 갈색이었습니다. 가짜 그룹에 비해 TUNEL 양성 세포, Caspase-3 및 Caspase-9 단백질 발현은 모델 그룹에서 향상되었습니다(모든 P <0.05). agomir NC 및 si-NC 그룹과 비교하여, TUNEL 양성 세포, Caspase-3 및 Caspase-9 단백질 발현은 miR-499-5p agomir 및 si-Sox6 그룹에서 감소했습니다(모든 P <0.05). miR-499-5p agomir + oe-NC 그룹과 비교하여, TUNEL 양성 세포, Caspase-3 및 Caspase-9 단백질 발현은 miR-499-5p agomir + oe-Sox6 그룹에서 증가했습니다(모두 P <0.05).

<그림>

복원된 miR-499-5p 또는 고갈된 Sox6은 패혈증 유발 폐 손상 마우스의 폐 조직에서 TUNEL 양성 세포, Caspase-3 및 Caspase-9 단백질 발현을 감소시킵니다. 아 마우스의 폐 조직에서 TUNEL 양성 세포. ㄴ 마우스의 폐 조직에서 TUNEL 양성 세포의 수. ㄷ 마우스의 폐 조직에서 Caspase-3 및 Caspase-9의 면역조직화학; d 마우스의 폐 조직에서 Caspase-3 및 Caspase-9의 평균 OD 값. 이 쥐의 폐 조직에서 Caspase-3와 Caspase-9의 단백질 밴드. 에 각 그룹의 마우스 폐 조직에서 Caspase-3 및 Caspase-9 단백질 발현. (a) P <0.05 대 가짜 그룹. (b) 피 <0.05 대 agomir NC 그룹. (c) 피 <0.05 대 si-NC 그룹. (d) P <0.05 vs miR-499-5p agomir + oe-NC 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시되었으며, 데이터는 일원 분산분석(one-way ANOVA) 후 Tukey 사후 검정으로 평가되었습니다.

복원된 miR-499-5p 또는 소진된 Sox6은 패혈증 유발 폐 손상의 BALF 및 폐 조직에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 함량 감소 마우스

ELISA 및 Western blot assay 결과(그림 4a-g):TNF-α, IL-1β 및 IL-6 함량이 가짜 그룹에 비해 모델 그룹에서 증가했습니다(모두 P <0.05). miR-499-5p agomir 및 si-Sox6 군에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 함량이 아고미르 NC 및 si-NC 그룹에 비해 감소했습니다(모든 P <0.05). miR-499-5p agomir + oe-NC 그룹에 비해, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 함량은 miR-499-5p agomir + oe-Sox6 그룹에서 증가했습니다(모든 P <0.05).

<그림>

복원된 miR-499-5p 또는 고갈된 Sox6은 패혈증 유발 폐 손상 마우스의 BALF 및 폐 조직에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 함량을 감소시킵니다. 아 각 그룹의 마우스 BALF의 TNF-α 함량. ㄴ 각 그룹의 마우스 BALF의 IL-1β 함량. ㄷ 각 그룹의 마우스 BALF의 IL-6 함량. d 각 그룹의 마우스 폐 조직에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 단백질 밴드. 이 각 그룹의 마우스 폐 조직에서 TNF-α의 단백질 발현. 에 각 그룹의 마우스 폐 조직에서 IL-1β의 단백질 발현. 지 각 그룹의 마우스 폐 조직에서 IL-6의 단백질 발현. (a) P <0.05 대 가짜 그룹. (b) 피 <0.05 대 agomir NC 그룹. (c) 피 <0.05 대 si-NC 그룹. (d) P <0.05 vs miR-499-5p agomir + oe-NC 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시되었으며, 데이터는 일원 분산분석(one-way ANOVA) 후 Tukey 사후 검정으로 평가되었습니다.

복원된 miR-499-5p 또는 고갈된 Sox6은 SOD, CAT 및 GSH-Px 활동을 증가시킬 뿐만 아니라 패혈증 유발 폐 조직의 MDA 및 MPO 함량 감소 폐 손상 마우스

산화 스트레스 지수 검출 결과는 다음을 나타냈습니다(그림 5a-e):가짜 그룹에 비해 SOD, CAT 및 GSH-Px 활동은 손상된 반면 MDA 및 MPO 함량은 모델 그룹에서 증가했습니다(모든 P <0.05). agomir NC 및 si-NC 그룹에 비해 SOD, CAT 및 GSH-Px 활성은 증가하는 반면 miR-499-5p agomir 및 si-Sox6 그룹에서는 MDA 및 MPO 함량이 감소했습니다(모두 P <0.05). miR-499-5p agomir + oe-NC 그룹과 비교하여 SOD, CAT 및 GSH-Px 활성은 억제된 반면 miR-499-5p agomir + oe-Sox6 그룹에서는 MDA 및 MPO 함량이 향상되었습니다(모든 P <0.05).

<그림>

복원된 miR-499-5p 또는 고갈된 Sox6은 SOD, CAT 및 GSH-Px 활성을 증가시킬 뿐만 아니라 패혈증 유발 폐 손상 마우스의 폐 조직에서 MDA 및 MPO 함량을 감소시킵니다. 아 쥐의 폐 조직에서 SOD 활성. ㄴ 마우스의 폐 조직에서 MDA 함량. ㄷ 쥐의 폐 조직에서 GSH-Px 활성. d 마우스의 각 그룹의 폐 조직에서 CAT 활성. 이 쥐의 폐 조직에서 MPO 함량. (a) P <0.05 대 가짜 그룹. (b) 피 <0.05 대 agomir NC 그룹. (c) 피 <0.05 대 si-NC 그룹. (d) P <0.05 vs miR-499-5p agomir + oe-NC 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시되었으며, 데이터는 일원 분산분석(one-way ANOVA) 후 Tukey 사후 검정으로 평가되었습니다.

miR-499-5p가 Sox6을 직접 대상으로 지정

우리는 생물정보학 웹사이트 TargetScan을 통해 miR-499-5p와 SOX4/6 사이에 표적 결합 부위가 있음을 예측했습니다. RT-qPCR을 사용하여 sham 그룹과 비교하여 모델 그룹에서 SOX2/4/6 발현이 증가했으며 SOX6 발현이 대부분 증가함을 확인했습니다(모든 P <0.05); agomir NC 그룹과 비교하여 miR-499-5p agomir 그룹은 SOX2 발현에 변화가 없는 반면 SOX4 발현은 감소했으며 대부분 SOX6이 감소했습니다(추가 파일 1:그림 S1a, b). 따라서 최종적으로 miR-499-5p의 표적 유전자로 SOX6을 선택하였다. 생물학적 예측 웹사이트(http://www.targetscan.org/vert_72/)는 miR-499-5p가 Sox6을 표적으로 할 수 있음을 밝혔습니다(그림 6a). 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석은 대조군과 비교하여(그림 6b) pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT 벡터와 miR-499-5p 아고미르를 TC-1 세포에 동시 형질감염시킨 후 루시페라제 활성이 분명히 파괴되었음을 보여주었습니다(피 <0.05), 루시퍼라제 활성은 pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT 벡터로 공동 형질감염된 miR-499-5p agomir 또는 pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT 벡터로 공동 형질감염된 agomir-NC 후 뚜렷한 차이를 나타내지 않았습니다( 피> 0.05), 이는 miR-499-5p가 Sox6 3'UTR WT에 직접 결합하여 루시퍼라제 활성을 억제할 수 있음을 시사합니다.

<그림>

miR-499-5p는 Sox6을 직접 대상으로 합니다. 아 생물학적 웹사이트에 근거한 miR-499-5p와 Sox6 간의 표적 관계. ㄴ 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석의 검증 결과. *피 <0.05 대 모방 NC 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 두 그룹 간의 비교는 t 테스트

토론

패혈증은 쇼크 및 다발성 장기 기능 장애 증후군의 중요한 원인이며, 그 중 ALI가 가장 빈번하고 중요한 장기 합병증입니다[24]. 패혈증 유발성 ALI는 가장 초기에 가장 발병률이 높을 뿐만 아니라 빠르게 진행되어 치사율이 높고 현재로서는 효과적인 치료법이 없다[25]. 이전 연구에서는 miR-218의 상향 조절이 염증 인자의 분비를 약화시키고 패혈증으로 인한 폐 손상을 예방한다고 주장했습니다[26]. 또한 miR-146a의 수준을 촉진하면 ALI의 염증을 감소시킬 수 있고[27] miR-125b의 복원은 ALI가 있는 마우스의 생존을 개선하고 염증을 억제할 수 있습니다[28]. 연구에서 폐 손상에서 miRNA의 역할을 강조했지만 패혈증 유발 폐 손상에서 miR-499-5p의 자세한 메커니즘은 거의 조사되지 않았으므로 우리는 miR-499-5p에 초점을 맞춰 패혈증 유발 폐 손상에서 치료 가능성을 발견했습니다. 알리. 또한 연구에서는 Sox6의 증가가 패혈증 유발 심장 세포 사멸에 관여한다는 증거를 제공했습니다[10]. 패혈증 유발 폐 손상을 깊이 이해하기 위해 노력해야 합니다. We aim to discuss the protective effect of miR-499-5p targeting Sox6 on sepsis-induced lung injury mice.

The W/D ratio of lung tissues was calculated in our study, and the expression of Sox6 and miR-499-5p in mouse lung tissues was assessed. The results showed that W/D ratio and Sox6 were increased while miR-499-5p was decreased in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. A recent study has proposed that miR-499-5p expression in patients with mild sepsis, severe sepsis and septic shock was dramatically decreased relative that in normal controls [9]. Another study has presented that miR-499-5p expression was markedly declined in non-small cell lung cancer (NSCLC) tissues and linked to poor clinical outcomes [29]. It is reported that the Sox6 expression was raised in lung cancer tissues in comparison with normal tissues [30]. Similarly, a previous study has revealed that the expression of Sox6 was remarkably elevated in the kidney tissues of mice with diabetic kidney disease [31]. Our study also presented that miR-499-5p directly targeted to Sox6. An important finding was that Sox6 is a target gene of miR-499 [10]. Another study provided data of that Sox6 was a target gene of miR-499-5p, and restoration of miR-499-5p suppressed the expression of Sox6 [32]. However, the target relation of miR-499-5p and Sox6 in lung tissues of sepsis-induced mice has not been uncovered yet.

In addition, it was revealed that restored miR-499-5p or depleted Sox6 alleviated lung tissues pathology, reduced lung injury score, collagen fibers and the degree of pulmonary fibrosis, and reduced TUNEL positive cells, Caspase-3 and Caspase-9 protein expression in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. It has been previously suggested that up-regulating miR-499-5p suppresses cell proliferation and promotes apoptosis in vivo and in vitro of NSCLC [29]. Another study has verified that restoring miR-499-5p and depleting Sox6 attenuated hypoxia/re-oxygenation-induced cell apoptosis and reduced Caspase-3 expression [32]. It was presented that down-regulating Sox6 alleviates the pathological injury and represses neuronal apoptosis in hippocampal tissues of Alzheimer’s disease [33]. Moreover, a study revealed that depletion of Sox6 inhibited high glucose-induced cell apoptosis and renal interstitial fibrosis in mouse renal mesangial cells [31]. Another study demonstrated that low expression of Sox6 declined the activity of Caspase-3 and the percentage of apoptotic cells in mouse P19CL6 cells [34]. In addition, we verified that restored miR-499-5p or depleted Sox6 declined TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in BALF and lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. Xia et al. illuminated that TNF-α and IL-6 levels were dramatically raised in sepsis-induced lung injury mice [35]. A study has demonstrated that low expression of Sox6 declines the inflammatory reaction in hippocampal tissues of Alzheimer’s disease [33]. Another result in this study implied that restored miR-499-5p or depleted Sox6 raised SOD, CAT and GSH-Px activities as well as reduced MDA and MPO contents in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. It was presented that CLP-induced ALI was featured by inflammation in morphology, enhanced W/D ratio, raised protein concentration in BALF, higher level of MPO and MDA contents as well as lower level of SOD, GSH-Px and CAT activities in lungs after CLP [36]. It was suggested that the activity of SOD and CAT were decreased in sepsis-induced ALI in mice [37]. Furthermore, a study reported that the overexpressed miR-499-5p and low expressed Sox6 decreased the level of MDA [32].

Conclusion

In conclusion, we found that high expression of miR-499-5p can attenuate the apoptosis of lung tissues cells and inhibit inflammation of sepsis-induced lung injury mice via depleting Sox6, which may have important therapeutic implications in the treatment of sepsis-induced lung injury. Nevertheless, clinical researches are needed to detect the efficacy for the treatment of sepsis-induced lung injury.

Availability of data and material

Not applicable.

금 나노입자에 의한 서브모노레이어 로다민 6G의 거리 의존성 플라즈몬 강화 형광 나노입자:암 진단 및 치료 업그레이드를 위한 새로운 접근 방식