미세RNA-499-5p, Sox6 표적화로 패혈증 유발 폐손상에서 폐기능 회복

초록

배경

마이크로RNA(miR)는 패혈증에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 본 연구는 생쥐에서 miR-499-5p가 성결정 영역 Y 관련 고이동성 그룹 박스 6(Sox6)을 표적화하여 패혈증 유발 폐손상에 미치는 보호 효과를 논의하는 것을 목표로 합니다.

방법

맹장 결찰 및 천공법으로 패혈증 유발 폐손상 모델을 확립했습니다. 생쥐 폐조직의 습중량/건중량(W/D) 비율, miR-499-5p, Sox6, Caspase-3, Caspase-9 발현을 측정했습니다. 폐손상 점수, 콜라겐 섬유, 폐섬유화 정도를 결정했습니다. 또한 폐조직의 세포 사멸을 측정했습니다. 손실 및 기능 획득 분석을 통해 기관지폐포세척액(BALF)과 폐조직의 염증 인자 함량과 산화 스트레스 지수를 검출했습니다. miR-499-5p와 Sox6 간의 표적 관계를 검증했습니다.

결과

패혈증 유발 폐손상 생쥐 폐조직에서 W/D 비율과 Sox6은 증가한 반면 miR-499-5p는 감소했습니다. miR-499-5p 회복 또는 Sox6 고갈은 폐조직 병리를 완화하고, 폐손상 점수, 콜라겐 섬유, 폐섬유화 정도, TUNEL 양성 세포, Caspase-3 및 Caspase-9 단백질 발현, BALF 및 폐조직의 염증 인자 함량, 폐조직의 산화 스트레스 반응을 감소시켰습니다. miR-499-5p는 Sox6을 표적화했습니다.

결론

miR-499-5p 고발현은 Sox6 고갈을 통해 폐조직 세포 사멸을 완화하고 패혈증 유발 폐손상 생쥐의 염증을 억제하며, 패혈증 유발 폐손상의 잠재적 후보 표지자와 치료 표적이 될 수 있습니다.

서론

패혈증은 감염의 결과로 발생하는 전신 염증으로 급성 호흡곤란 증후군 등 다장기 기능 장애를 유발합니다[1]. 심한 저혈압, 진행성 저산소증, 조직 손상, 염증 변화가 특징입니다[2]. 폐는 패혈증에서 가장 중요하고 취약한 장기이며, 급성 폐손상(ALI)은 빈번한 패혈증 유발 염증 질환입니다[3]. 패혈증 유발 ALI의 심각성은 폐포모세관 네트워크의 투과성 손상으로 인한 산소 공급 감소에 기인할 수 있습니다[4]. 폐세포 사멸은 패혈증 유발 폐손상의 중요한 인자입니다[5]. 패혈증 유발 ALI의 병태생리는 알려지지 않았으며, 지지 요법과 항생제가 패혈증 및 ALI 환자의 유일한 치료법이고 높은 사망률에 미치는 영향은 제한적입니다[6].

마이크로RNA(miRNA)는 약 18-24개 뉴클레오티드로 구성된 작은 비부호화 내인성 발현 RNA 조각으로, 광범위한 세포 기능을 제어하고 특정 유전자의 표적 영역에 결합하여 mRNA 번역/전사를 억제하거나 활성화함으로써 발현을 조절합니다[7]. miR-499-5p는 최근 발견된 미오신 코딩 miRNA 구성원입니다[8]. 한 연구에서 패혈증 환자의 혈청 miR-499-5p 수치가 장기 부전을 나타내는 데 활용될 수 있다고 보고했습니다[9]. 또 다른 연구에서는 miR-499-5p 발현이 패혈증 유발 심장 세포 사멸에 관여함이 밝혀졌습니다[10]. 성결정 영역 Y(SRY) 관련 고이동성 박스(HMG)(SOX) 패밀리는 SRY와의 서열 동일성이 50% 이상인 HMG 클래스 DNA 결합 도메인을 포함하는 유전자 세트로 정의됩니다[11]. Sox6 전사 인자는 SRY 관련 HMG 박스 패밀리의 일부로 진행 과정에서 여러 조직에서 발현되며, 증식 전구 세포에서 기능적으로 성숙한 세포로의 전환에 중요한 역할을 합니다[12]. Sox6 증가가 패혈증 유발 심장 세포 사멸에 연관됨이 보고되었습니다[10]. Sox2와 Sox4 발현이 인간 소세포 폐암에서 증가함이 밝혀졌습니다[13, 14]. 하지만 Sox6과 패혈증 유발 폐손상 관계는 추가 연구가 필요합니다. 따라서 본 연구는 Sox6을 표적화하여 miR-499-5p가 패혈증 유발 폐손상 생쥐에 미치는 보호 효과를 탐구하고자 했습니다.

재료 및 방법

윤리 기준 준수

모든 동물 실험은 미국 국립보건원의 실험동물 관리 및 사용 지침을 따랐습니다. 프로토콜은 웨이하이 시립병원, 질루 의과대학, 산둥대학교 동물실험윤리위원회 승인을 받았습니다.

실험 동물

건강한 수컷 특정 병원체 무감염(SPF) 등급 BALB/c 생쥐(6-8주령, 18-22g)를 산둥대학교 실험동물센터(산둥, 중국)에서 구입했습니다. 환경은 24±2°C, 12시간 명암 주기로 유지했습니다. 생쥐는 무균 사료와 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 7일간 적응 사육 후 실험을 시작했습니다.

생쥐에서 맹장 결찰 및 천공(CLP)으로 패혈증 유발 폐손상 모델 확립

생쥐를 sham 그룹(n=8)과 모델 그룹으로 무작위 배정했습니다. 수술 전 12시간 금식 후 1% 펜토바르비탈 나트륨(70mg/kg) 복강 내 주사로 마취했습니다. 마취 효과를 관찰하고 호흡과 심박수를 확인했습니다. 생쥐 머리와 사지를 앙와위에서 고정하고 요오드 솜으로 복부 피부를 소독했습니다. 모델 그룹 생쥐는 복부 정중선 중간 부분에 1.0cm 종절개를 가하고 복강을 열어 맹장을 꺼내 장간막 혈관 손상 없이 복강 밖으로 꺼냈습니다. 맹장 끝의 1/2 지점에서 1-0 실크실로 결찰하고, 장간막 반대쪽 가장자리를 16번 천공 바늘로 천공했습니다. 적당량의 장 내용물을 짜내고 맹장을 다시 넣은 후 절개부를 봉합했습니다. Sham 그룹은 복강을 연 후 맹장만 꺼내 다시 넣었습니다. 수술 후 생쥐에 1mL 0.9% 생리식염수 피하 주사 후 케이지 분리하여 일상 사육했습니다.

체내 형질도입

모델링 전 생쥐를 7개 그룹(n=8)으로 배정했습니다: 모델 그룹, miR-499-5p 아고미르 그룹, 아고미르 음성 대조군(NC) 그룹, 소간섭 RNA(si)-Sox6 그룹, si-NC 그룹, miR-499-5p 아고미르 + 과발현(oe)-Sox6 그룹, miR-499-5p 아고미르 + oe-NC 그룹. 모델링 1시간 전 그룹별로 처리했습니다. 생쥐를 1% 펜토바르비탈 나트륨 복강 내 주사로 마취하고 45° 경사 앙와위에서 고정, 혀를 입 옆으로 이동시켜 기도 개방성을 확보했습니다. 목 앞쪽 피부를 소독하고 절개하여 기관을 노출시켰습니다. 형질도입 복합체(50µL)를 마이크로샘플러로 흡입(그룹별 상이, 모델 그룹에는 같은 양의 인산완충식염수(PBS) 점적)하여 기관에 천천히 점적했습니다. 형질도입 후 생쥐를 수직 회전시켜 형질도입 복합체가 폐에 완전히 분포되게 했습니다[15]. 형질도입 과정 중 생쥐 호흡과 심박수를 관찰했습니다. 호흡 및 심정지 발생 시 즉시 형질도입을 중단하고 기도 개방 후 호흡과 심박수 안정 시 재개했습니다. miR-499-5p 아고미르, 그 NC 및 Sox6 해당 플라스미드는 Shanghai GenePharma Co., Ltd.(상하이, 중국)에서 구입했습니다. 형질도입 후 생쥐를 케이지 분리하여 1일 사육 후 안락사시켰습니다. 1% 펜토바르비탈 나트륨 복강 내 주사 마취, 앙와위 고정 후 복부 대동맥 절개로 안락사시켰습니다. 생쥐 피부 국소 소독, 흉강 개방, 기관 및 우주기관 결찰, 우주기관 절단, 우폐 적출. 우폐 하엽을 10% 중성 포르말린에 넣어 병리 검사용, 중엽은 신속히 칭량하여 습중량(W) 측정 후 56°C에서 72시간 건조 후 건중량(D) 측정하여 W/D 비율 계산. 우폐 상엽은 액체 질소에 보관하여 mRNA 및 단백질 검출용. 좌폐를 0.4mL 생리식염수로 3회 세척하여 약 1mL 기관지폐포세척액(BALF) 수집, 1.5mL Eppendorf(EP) 튜브에 옮겨 얼음에 보관. BALF를 1500rpm에서 5분 원심분리 후 새 EP 튜브로 옮겨 -80°C 보관하여 염증 인자 검출용.

또한 생쥐를 3개 그룹(n=10/그룹)으로 나누었습니다: sham 그룹, 모델 그룹, miR-499-5p 아고미르 그룹(수술 1시간 전 기관 내 50µL miR-499-5p 아고미르 점적). 생존율을 12시간마다 7일간 총 7일간 모니터링했습니다. 7일 내 생쥐 생존 상태 관찰 및 miR-499-5p 독성 판정[16].

헤마톡실린-에오신(H&E) 염색 및 손상 점수

폐조직을 파라핀 절편으로 만들어 H&E 염색 후 광학현미경으로 관찰했습니다. 미국 흉부학회 폐손상 병리 채점 시스템으로 폐손상 점수 매겼습니다(폐포 울혈, 출혈, 폐포강 또는 혈관벽의 호중구 침윤 또는 응집, 폐포벽 비후 및/또는 유리막 형성). 0점: 병변 없음 또는 매우 경미; 1점: 경미; 2점: 중등도; 3점: 심각; 4점: 매우 심각. 네 항목 총점이 폐손상 총점[17].

마손 염색 및 점수

폐조직을 파라핀 절편(4µm)으로 만들어 마손 염색[18]했습니다. 콜라겐 섬유, 점액, 연골은 파란색, 세포질, 근육, 셀룰로오스, 신경교는 빨간색, 세포핵은 청흑색. 반정량적 Ashcroft 채점 시스템[19] 사용: 0점 정상 폐; 1점 폐포 또는 기관지 벽의 경미한 섬유성 비후; 3점 폐포 또는 세기관지 벽의 중등도 비후나 폐 구조 손상 없음; 5점 폐 구조 손상 동반한 악화된 섬유화, 섬유 띠 또는 덩어리 형성; 7점 심각한 폐 구조 손상과 광범위한 섬유화, 섬유 띠 또는 덩어리; 8점 모든 영역 섬유화 충진.

말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 매개 데옥시우리딘 삼인산-비오틴 닉 엔드 라벨링(TUNEL) 염색

폐조직 세포 사멸을 TUNEL 키트(Roche Diagnostics GmbH, 만하임, 독일)로 검사하고 광학현미경으로 관찰했습니다. 사멸 세포 핵이 갈색으로 염색됩니다. 세포 사멸 지수는 TUNEL 양성 세포 비율로 나타냅니다[20].

면역조직화학

폐조직 절편을 자일렌으로 탈파라핀화, 3% 과산화수소로 처리, 산양 혈청으로 차단했습니다. Caspase-3(ab13847, 1:500), Caspase-9(ab32539, 1:250), SOX6(ab30455, 1:500, 모두 Abcam, MA, USA) 항체로 면역염색했습니다. 광학현미경(Leica Microsystems, IL, USA)으로 이미지 촬영 후 Image Pro Plus 6.0 소프트웨어(Media Cybernetics, Rockville, MA, USA)로 분석[21].

역전사 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)

OMEGA 키트(Solarbio science & technology Co., Ltd., 베이징, 중국)로 폐조직 총 RNA 추출 및 농도 측정. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific, 매사추세츠, USA)에 따라 역전사로 상보적 DNA(cDNA) 합성. 프라이머는 Invitrogen(칼스배드, CA, USA)에서 설계(표 1 참조). FastStart Universal SYBR Green Master(Rox) 키트(Roche)에 따라 PCR 반응 수행. 2⁻ΔΔCt 법으로 정량 분석. U6을 miR-499-5p 로딩 컨트롤로, GAPDH를 다른 유전자 내부 기준으로 사용[22].

웨스턴 블롯 분석

무면역침전분석법 완충액으로 폐조직 처리하여 총단백질 수집. 비시니코닌산 법으로 총단백질 농도 측정. 단백질 시료(30µg)를 10% SDS-PAGE로 전기영동, 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 전이, 5% 탈지분유로 차단 후 1차 항체 반응: Sox6(ab30455, 1:1000, Abcam), Caspase-3(9661, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, USA), Caspase-9(9502, 1:1000, Cell Signaling Technology), 종양괴사인자-α(TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam), 인터루킨-1β(IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, USA), IL-6(ab6672, 1:1000, Abcam), GAPDH(sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA). 2차 항체(1:2000) 배양 후 향상된 화학발광법으로 현상[23].

효소결합면역흡착분석(ELISA)

BALF 내 IL-1β, IL-6, TNF-α 수치를 ELISA 키트(Boster, 후베이, 중국)로 측정. 450nm에서 발색 측정.

산화 스트레스 지수 검출

액체 질소 속 폐조직을 칭량 후 저온에서 일정 비율 생리식염수로 희석, 균질화 후 4°C, 3000r/min, 20분 저온 원심분리, 상등액 취해 측정. 골수과산화효소(MPO) 활성은 MPO 검출 키트(난징 젠청 바이오엔지니어링 연구소, 난징, 중국)로, 말론디알데히드(MDA), 초산화물 디스뮤타제(SOD), 글루타티온 퍼옥시데이스(GSH-Px), 카탈라제(CAT)는 젠청 바이오엔지니어링 연구소 제공 키트로 측정.

이중 루시페라제 보고자 유전자 분석

생물정보학 웹사이트(https://www.targetscan.org/vert_72/) 예측으로 miR-499-5p의 표적 유전자가 Sox6일 수 있음. miR-499-5p와 Sox6 mRNA 3'비번역 영역(UTR) 사이에 네 개 결합 부위 존재. pmiR-RB-REPORT-Sox6 야생형(WT) 및 돌연변이형(MUT) 벡터를 Guangzhou RiboBio Co., Ltd.(광둥, 중국)에서 구축, 해당 루시페라제 보고자 플라스미드 생성. TC-1 세포(생쥐 폐상피세포, 1×10⁵ cells/well, Shanghai Yiyan biological technology Co., Ltd., 상하이, 중국)를 24웰 플레이트에 파종, Lipofectamine2000으로 miR-499-5p 아고미르 또는 아고미르-NC, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT 또는 MUT로 형질도입. 이중 루시페라제 보고자 유전자 분석 시스템(Promega, WI, USA)으로 루시페라제 활성 측정.

통계 분석

SPSS 21.0(IBM Corp. Armonk, NY, USA) 소프트웨어로 모든 데이터 분석. 측정 데이터는 평균±표준편차로 표시. 두 그룹 비교는 t-검정, 다그룹 비교는 일원분산분석(ANOVA), ANOVA 후 Tukey 사후 검정으로 쌍별 비교. 생존 곡선은 Kaplan-Meier 법으로 작성. P값 <0.05를 통계적 유의성으로 판단.

결과

패혈증 유발 폐손상 생쥐 폐조직에서 W/D 비율과 Sox6 증가, miR-499-5p 감소

생쥐에서 miR-499-5p 독성을 검사하여 패혈증 생쥐 생존 시간 측정. 결과(그림 1a): sham 그룹 7일 생존율 100%, 패혈증 생쥐는 감소. miR-499-5p 치료 후 패혈증 생쥐 생존율 향상. 폐조직 W/D 비율 결과(그림 1b): sham 그룹 대비 모델 그룹에서 W/D 비율 증가(P<0.05). 아고미르 NC 그룹과 si-NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 그룹과 si-Sox6 그룹에서 W/D 비율 감소(모두 P<0.05). miR-499-5p 아고미르 + oe-NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 + oe-Sox6 그룹에서 W/D 비율 현저 증가(P<0.05).

miR-499-5p와 Sox6 발현 검출 결과(그림 1c-f): sham 그룹 대비 모델 그룹에서 miR-499-5p 감소, Sox6 증가(모두 P<0.05). 아고미르 NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 그룹에서 miR-499-5p 증가, Sox6 감소(모두 P<0.05). si-NC 그룹 대비 si-Sox6 그룹에서 Sox6 감소(P<0.05). miR-499-5p 아고미르 + oe-NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 + oe-Sox6 그룹에서 Sox6 현저 증가(P<0.05).

면역조직화학으로 패혈증 생쥐 폐조직 Sox6 단백질 함량 측정(그림 1g). sham 그룹 대비 모델 그룹에서 Sox6 단백질 발현 증가(P<0.05); 아고미르 NC 그룹과 si-NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 그룹과 si-Sox6 그룹에서 Sox6 단백질 발현 감소(모두 P<0.05); miR-499-5p 아고미르 + oe-NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 + oe-Sox6 그룹에서 Sox6 단백질 발현 증가(P<0.05).

miR-499-5p 회복 또는 Sox6 고갈로 패혈증 유발 폐손상 생쥐에서 폐조직 병리 완화, 폐손상 점수, 콜라겐 섬유, 폐섬유화 정도 감소

HE 염색 결과(그림 2a): sham 그룹에서 폐조직 구조 완전, 폐포 중격 기본적으로 나타나며 부종이나 염증 없음, 폐포강 명확. 모델, 아고미르 NC, si-NC, miR-499-5p 아고미르 + oe-Sox6 그룹에서 대부분 폐포강에 삼출, 부종, 출혈 보이고 폐 간질에 다량 염증 세포 침윤. miR-499-5p 아고미르, si-Sox6, miR-499-5p 아고미르 + oe-NC 그룹에서 모델 그룹 대비 폐조직 병변 감소.

생쥐 폐손상 점수와 반정량적 Ashcroft 점수 결과(그림 2b, d): sham 그룹 대비 모델 그룹에서 폐손상 점수와 폐섬유화 정도 현저 증가(P<0.05). 아고미르 NC 그룹과 si-NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 그룹과 si-Sox6 그룹에서 폐손상 점수와 폐섬유화 정도 감소(모두 P<0.05). miR-499-5p 아고미르 + oe-NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 + oe-Sox6 그룹에서 폐손상 점수와 폐섬유화 정도 현저 증가(P<0.05).

마손 염색 결과(그림 2c): sham 그룹에서 소량 파란 콜라겐 섬유. 모델, 아고미르 NC, si-NC, miR-499-5p 아고미르 + oe-Sox6 그룹에서 콜라겐 섬유 증가. miR-499-5p 아고미르 그룹, si-Sox6 그룹, miR-499-5p 아고미르 + oe-NC 그룹에서 모델 그룹 대비 콜라겐 섬유 감소.

miR-499-5p 회복 또는 Sox6 고갈로 패혈증 유발 폐손상 생쥐 폐조직에서 TUNEL 양성 세포, Caspase-3, Caspase-9 단백질 발현 감소

웨스턴 블롯, TUNEL 염색, 면역조직화학 결과(그림 3a-f): 정상 핵은 파란색, 사멸 핵은 다양한 음영의 갈색. sham 그룹 대비 모델 그룹에서 TUNEL 양성 세포, Caspase-3, Caspase-9 단백질 발현 증가(모두 P<0.05). 아고미르 NC와 si-NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 그룹과 si-Sox6 그룹에서 TUNEL 양성 세포, Caspase-3, Caspase-9 단백질 발현 감소(모두 P<0.05). miR-499-5p 아고미르 + oe-NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 + oe-Sox6 그룹에서 TUNEL 양성 세포, Caspase-3, Caspase-9 단백질 발현 증가(모두 P<0.05).

miR-499-5p 회복 또는 Sox6 고갈로 패혈증 유발 폐손상 생쥐 BALF 및 폐조직에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 함량 감소

ELISA와 웨스턴 블롯 분석 결과(그림 4a-g): 모델 그룹에서 sham 그룹 대비 TNF-α, IL-1β, IL-6 함량 증가(모두 P<0.05). 아고미르 NC와 si-NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 그룹과 si-Sox6 그룹에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 함량 감소(모두 P<0.05). miR-499-5p 아고미르 + oe-NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 + oe-Sox6 그룹에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 함량 증가(모두 P<0.05).

miR-499-5p 회복 또는 Sox6 고갈로 패혈증 유발 폐손상 생쥐 폐조직에서 SOD, CAT, GSH-Px 활성 증가 및 MDA, MPO 함량 감소

산화 스트레스 지수 검출 결과(그림 5a-e): sham 그룹 대비 모델 그룹에서 SOD, CAT, GSH-Px 활성 저하, MDA, MPO 함량 증가(모두 P<0.05). 아고미르 NC와 si-NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 그룹과 si-Sox6 그룹에서 SOD, CAT, GSH-Px 활성 증가, MDA, MPO 함량 감소(모두 P<0.05). miR-499-5p 아고미르 + oe-NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 + oe-Sox6 그룹에서 SOD, CAT, GSH-Px 활성 억제, MDA, MPO 함량 증가(모두 P<0.05).

miR-499-5p가 직접 Sox6을 표적화함

생물정보학 웹사이트 TargetScan 예측으로 miR-499-5p와 SOX4/6 사이에 표적 결합 부위 존재. RT-qPCR로 sham 그룹 대비 모델 그룹에서 SOX2/4/6 발현 증가, SOX6이 가장 많이 증가(모두 P<0.05); 아고미르 NC 그룹 대비 miR-499-5p 아고미르 그룹에서 SOX2 발현 변화 없음, SOX4 감소, SOX6 가장 많이 감소(추가 파일 1: 그림 S1a, b). 따라서 최종적으로 SOX6을 miR-499-5p 표적 유전자로 선정. 생물학적 예측 웹사이트(https://www.targetscan.org/vert_72/)에서 miR-499-5p가 Sox6 표적화 가능함 확인(그림 6a). 이중 루시페라제 보고자 유전자 분석 결과(그림 6b): 대조군 대비 pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT 벡터와 miR-499-5p 아고미르를 TC-1 세포에 공동 형질도입 후 루시페라제 활성 현저 감소(P<0.05), miR-499-5p 아고미르와 pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT 벡터 공동 형질도입 또는 아고미르-NC와 pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT 벡터 공동 형질도입 시 루시페라제 활성 유의한 차이 없음(P>0.05). 이는 miR-499-5p가 직접 Sox6 3'UTR WT에 결합하여 루시페라제 활성을 억제함을 시사.

고찰

패혈증은 쇼크와 다장기 기능 장애 증후군의 주요 원인으로, 그중 ALI가 가장 빈번하고 중요한 장기 합병증입니다[24]. 패혈증 유발 ALI는 가장 일찍 발생하고 발생률이 가장 높을 뿐만 아니라 빠르게 진행되며 치사율이 높고 현재 효과적인 치료법이 없습니다[25]. 선행 연구에서 miR-218 상향조절이 염증 인자 분비 완화와 패혈증 유발 폐손상 예방에 기여함이 보고되었습니다[26]. 또한 miR-146a 수준 증가가 ALI 염증 감소[27], miR-125b 회복이 ALI 생쥐 생존율 향상과 염증 억제[28]에 기여함이 밝혀졌습니다. miRNA의 폐손상 역할이 강조되었지만, 패혈증 유발 폐손상에서 miR-499-5p의 상세 메커니즘은 거의 연구되지 않아 miR-499-5p의 패혈증 유발 ALI 치료 잠재력 발견에 초점을 맞췄습니다. 또한 Sox6 증가가 패혈증 유발 심장 세포 사멸에 관여함이 입증되었습니다[10]. 패혈증 유발 폐손상 심층 이해를 위한 노력이 필요합니다. 본 연구는 Sox6을 표적화하는 miR-499-5p의 패혈증 유발 폐손상 생쥐 보호 효과를 논의하고자 합니다.

본 연구에서 폐조직 W/D 비율 계산, 생쥐 폐조직 Sox6과 miR-499-5p 발현 평가. 결과: 패혈증 유발 폐손상 생쥐 폐조직에서 W/D 비율과 Sox6 증가, miR-499-5p 감소. 최근 연구에서 경증 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크 환자 miR-499-5p 발현이 정상 대조군 대비 현저 감소함 보고[9]. 또 다른 연구에서 비소세포폐암(NSCLC) 조직에서 miR-499-5p 발현 현저 감소 및 불량한 임상 결과와 연관됨 보고[29]. Sox6 발현이 정상 조직 대비 폐암 조직에서 증가함 보고[30]. 유사하게 당뇨병 신장병 생쥐 신장 조직에서 Sox6 발현 현저 증가 보고[31]. 본 연구에서도 miR-499-5p가 직접 Sox6 표적화함 확인. 중요한 발견으로 Sox6이 miR-499 표적 유전자임[10]. 또 다른 연구에서 Sox6이 miR-499-5p 표적 유전자이며 miR-499-5p 회복이 Sox6 발현 억제함 데이터 제시[32]. 하지만 패혈증 유발 생쥐 폐조직에서 miR-499-5p와 Sox6 표적 관계는 아직 밝혀지지 않았습니다.

또한 miR-499-5p 회복 또는 Sox6 고갈이 패혈증 유발 폐손상 생쥐 폐조직에서 병리 완화, 폐손상 점수, 콜라겐 섬유, 폐섬유화 정도 감소, TUNEL 양성 세포, Caspase-3, Caspase-9 단백질 발현 감소함이 밝혀졌습니다. 선행 연구에서 miR-499-5p 상향조절이 NSCLC 체내외에서 세포 증식 억제와 세포 사멸 촉진함 제안[29]. 또 다른 연구에서 miR-499-5p 회복과 Sox6 고갈이 저산소/재산소화 유발 세포 사멸 완화와 Caspase-3 발현 감소 검증[32]. Sox6 저하가 알츠하이머병 해마 조직에서 병리적 손상 완화와 신경 세포 사멸 억제함 제시[33]. 또한 Sox6 고갈이 생쥐 신장 메산지알 세포에서 고혈당 유발 세포 사멸과 신장 간질 섬유화 억제함 입증[31]. 또 다른 연구에서 Sox6 저발현이 생쥐 P19CL6 세포에서 Caspase-3 활성과 세포 사멸 비율 감소함 입증[34]. 또한 본 연구에서 miR-499-5p 회복 또는 Sox6 고갈이 패혈증 유발 폐손상 생쥐 BALF 및 폐조직에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 함량 감소함 검증. Xia 등 연구에서 패혈증 유발 폐손상 생쥐 TNF-α와 IL-6 수치 현저 증가 보고[35]. Sox6 저발현이 알츠하이머병 해마 조직에서 염증 반응 감소함 입증[33]. 본 연구 또 다른 결과로 miR-499-5p 회복 또는 Sox6 고갈이 패혈증 유발 폐손상 생쥐 폐조직에서 SOD, CAT, GSH-Px 활성 증가 및 MDA, MPO 함량 감소함 시사. CLP 유발 ALI가 형태학적 염증, W/D 비율 증가, BALF 단백질 농도 상승, MPO와 MDA 함량 증가, 폐에서 SOD, GSH-Px, CAT 활성 저하 특징임 보고[36]. 패혈증 유발 ALI 생쥐에서 SOD와 CAT 활성 감소 제안[37]. 또한 miR-499-5p 과발현과 Sox6 저발현이 MDA 수치 감소함 보고[32].

결론

결론적으로 miR-499-5p 고발현이 Sox6 고갈을 통해 패혈증 유발 폐손상 생쥐 폐조직 세포 사멸 완화와 염증 억제에 기여함 발견. 이는 패혈증 유발 폐손상 치료에 중요한 치료적 함의가 있을 수 있음. 그럼에도 불구하고 패혈증 유발 폐손상 치료 효능 검증을 위한 임상 연구가 필요합니다.