나노클레이: 코로나19에 대한 유망한 나노 면역 방어 전략

요약

다양한 노력에도 불구하고 효과적인 코로나19 백신 개발에는 상당한 시간이 소요될 수 있습니다. 인간이 이미 경험한 전통·자연 의학이 더 빠른 해결책이 될 수 있습니다. 연구진이 암 전이, 흑색종 치료, 골 재생 분야에서 나노클레이를 고친화성 소재로 활용한 경험을 바탕으로, 본 연구에서는 나노클레이를 코로나19 예방 및 치료에 활용할 것을 제안합니다. 나노클레이는 높은 친화력 덕분에 바이러스가 인체 hACE2 수용체와 결합하기 전에 이를 포착할 수 있습니다. 본 연구에서는 코로나바이러스 스파이크 단백질과 hACE2 단백질의 상호작용을 나노클레이 유무에 따라 분자 수준에서 시뮬레이션 및 모델링했습니다. 그 결과, SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 나노클레이 간에는 매우 높은 친화도·응집력이 존재하는 반면, 스파이크와 hACE2 사이의 결합력은 상대적으로 낮았습니다. 나노클레이는 이미 약물 전달체로 사용되고 있으므로, '나노클레이 단독' 주사제로도 활용 가능할 것으로 기대됩니다. 향후 in vitro 및 in vivo 연구를 위한 권고사항도 함께 제시했습니다.

배경

신종 코로나바이러스 SARS-CoV-2의 갑작스러운 출현과 급속한 확산은 인간의 건강과 생명은 물론 세계 경제에도 심각한 타격을 입혔습니다. SARS-CoV-2 스파이크 S 단백질은 인간 안지오텐신 전환 효소 2(hACE2)와 높은 친화력으로 결합하여, 이를 표적 세포 침입의 수용체로 이용합니다(그림 1a, b) [1]. 바이러스 표면의 스파이크 단백질은 코로나바이러스의 숙주 세포 진입을 매개합니다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하며, 이는 명시적으로 hACE2를 수용체로 인식합니다 [2, 3]. hACE2 표면에는 SARS-CoV-2 S 결합에 결정적인 두 개의 바이러스 결합 핫스팟이 존재합니다. SARS-CoV-2 RBD의 자연 선택적 돌연변이들은 이 핫스팟을 둘러싸며 감염성, 병원성, 종간 및 인간 대 인간 전파를 조절합니다 [2, 4, 5].

현재 SARS-CoV-2를 특이적으로 표적하는 임상 승인 백신이나 약물은 없습니다. 정식 백신 개발 프로토콜을 따를 경우 효과적인 백신이 나오기까지 훨씬 더 오랜 시간이 걸릴 수 있습니다. SARS-CoV-2에 대한 치료용 항체 개발에 많은 관심이 쏠리고 있으나, 여러 노력에도 불구하고 아직 발견되지 않았습니다 [6] (일부 임상시험 제외 [7]). 한 시험에서는 SARS-CoV-2 S 당단백질의 RBD에 결합하여 강력한 중화 효과를 보인 항체가 보고되었습니다 [8]. 이 시험에서는 항체 칵테일(여러 항체의 혼합물)이 SARS-CoV-2에 대한 중화 효과를 높인다는 이유로 권장되었습니다. 그러나 과거 SARS-CoV 감염 환자의 회복기 혈장 항체를 이용해 SARS-CoV를 치료한 사례에서, 항체 의존성 감염 촉진(ADE) 등 유해한 면역 반응과 감염력 증가 같은 부작용이 나타났습니다 [7]. 또한 SARS-CoV와 MERS 백신 개발 경험에 비추어 볼 때, SARS-CoV-2 백신 개발 노력의 성공 가능성도 그리 높지 않아 보입니다. 따라서 인간이 안전하게 복용·섭취해 온 전통·자연 의학을 SARS-CoV-2 치료 옵션 중 하나로 고려할 수 있습니다. 천연 소재이자 인간 사용 이력이 있는 '고전하 나노클레이'를 코로나바이러스 차단제이자 스파이크 매개 세포 진입 억제제로 제안하는 이유입니다.

퇴적암 광물에서 유래한 나노 크기의 천연 소재인 나노클레이는 세균과 바이러스에 매우 높은 친화력을 가집니다 [9]. 분자 구조 내 동질 치환(isomorphous substitution)으로 인해 표면에 전하 결핍이 생기며, 이는 물 분자와 용해된 양이온에 의해 중화됩니다(그림 2). 이러한 대전 구조와 넓은 표면적 덕분에 세균 표면과 독소 등 대전 개체에 대한 친화력을 갖습니다. 주요 생물의학적 특성으로는 높은 흡착력, 미생물 포집 능력, 무독성 등이 있습니다. 각 전하 활성 점토 광물은 고유한 형태, 특성, 상호작용 거동을 보입니다. 가장 많이 연구된 생물의학적 응용은 5-플루오로우라실, 트라스투주맙 등 항암제의 전달체 및 복합체 역할입니다 [11-17]. 따라서 여러 질병의 잠재적 대체 의약품으로 주목받아 왔습니다 [18-22]. 점토 나노입자는 접착성 덕분에 서방형 약물 전달체로도 활용됩니다 [15, 23]. 또한 소 로타바이러스와 소 코로나바이러스의 흡착 및 치료에도 성공적으로 사용되었습니다 [24].

연구진은 앞서 대전 점토 광물의 기본 특성 및 거동 모델링 [31-33], 암 전이 제어 [10], 흑색종 치료에 대한 in vitro/in vivo 연구 [34], 칼슘 침착/골 재생 연구 [35]를 수행했습니다. 이전 연구 [35]에서 점토 나노입자가 대전 표면에 높은 친화력을 가짐을 입증했습니다. 나노클레이의 높은 인력과 암세포의 비특이적 부착 증가가 시너지를 이루어 암 전이 제어에 유리한 후보가 됩니다. 해당 연구에서는 Na-몬모릴로나이트(SWy-3)와 팔리고르스카이트(PFl-l) 두 가지 대전 점토 광물로 암세포 전이를 제어할 수 있음을 보였습니다. 이어진 연구 [34]에서는 in vitro/in vivo 실험을 통해 이들 나노클레이가 흑색종 암세포의 증식과 생존력을 억제함을 확인했습니다. 이들 연구에서는 실험실 실험뿐만 아니라 나노클레이-세포 상호작용에 대한 분자 수준 시뮬레이션도 병행하여, 나노입자 유무에 따른 응집력/친화도의 상대적 수준을 평가했습니다.

이상의 나노클레이 고친화성 잠재력에 관한 연구진의 모든 경험을 종합할 때, 나노클레이를 항체처럼 모방하여 코로나바이러스를 끌어당겨 포집함으로써 인체 hACE2와의 결합을 사전에 차단할 수 있으리라 기대합니다. 본 논문은 분자 수준 시뮬레이션과 모델링 접근을 통해 이러한 인식을 검증하는 첫 단계입니다. 시뮬레이션 결과를 바탕으로 향후 in vitro 및 in vivo 연구 단계에 대한 권고안도 제시합니다. 나노클레이가 이미 약물 전달체로 성공적으로 쓰이고 있는 만큼, '나노클레이 단독' 의약품으로서 주사 또는 경구 투여도 가능할 것으로 보며, 이를 위한 잠정적 투여 방법론도 제안합니다.

재료-분자

SARS-CoV-2 및 hACE2의 선정과 모델링

SARS-CoV-2 스파이크 S와 hACE2 분자는 단백질 데이터 뱅크(RCSB) [36-38]에서 확보했습니다. Materials Studio 소프트웨어 [39]에서 구축한 두 분자의 분자 모델은 각각 그림 3a, b에 나와 있습니다. 시뮬레이션 전, 소프트웨어의 전하 평형법(QEq)을 이용해 전하를 부여했습니다.

나노클레이 결정립의 선정과 모델링

스멕타이트 그룹 점토 광물 중 가장 활성이 높은 Na-몬모릴로나이트를 선정했습니다. Na-몬모릴로나이트는 층상 필로실리케이트 스멕타이트입니다(그림 2). 콜로이드 상태에서 인접 층간에는 자유 나트륨, 칼슘, 마그네슘 양이온이 음전하를 띤 외부 표면에 정전기적으로 끌려 존재합니다 [40]. 건조 분말 상태에서는 약 0.5 × 0.5 × 0.001 µm 크기의 등방성 플레이크/시트 형태로 존재합니다(그림 2a). 층간 표면의 음전하는 양이온에 의해 평형됩니다. 콜로이드 상태가 되면 층간 양이온이 점토 입자에서 해리되어 다른 음전하 표면과 결합합니다. 이 입자들은 말단의 끊어진 결합으로 인해 양전하를 띤 가장자리를 가집니다. 형태 및 추가 특성은 표 1에 정리했으며, Materials Studio에서의 결정립 모델링 방법은 아래에 설명합니다.

소프트웨어에서 Na-몬모릴로나이트 결정립은 양이온 교환 용량(CEC), 교환성 양이온, 층간 전하 등 기본 물성(표 1)을 바탕으로 구축했습니다. 분자/결정립 크기는 동적 빛 산란(DLS) 입도 분석 결과 [10]을 반영해 결정했습니다. 소프트웨어 설계 모드에서 고유 물성을 이용해 생성한 최종 결정립 형태는 그림 3c와 같습니다. 생성 후 QEq 법으로 전하를 부여했습니다.

방법-분자 수준 시뮬레이션

본 파트에서는 SARS-CoV-2 스파이크 S가 점토 결정립 및 hACE2와 상호작용하는 과정을 시뮬레이션하고 평가했습니다. 이 모델이 실제 in vitro 조건을 완벽히 재현하지는 못하지만, 필수적인 상호작용을 모두 포함하고 있어 상대적·비교적 연구에 매우 적합합니다.

소프트웨어에서 SARS-CoV-2 S, Na-몬모릴로나이트 결정립, hACE2로 구성된 시스템의 흡착 및 시뮬레이션을 몬테카를로(MC) 및 분자 역학(MM) 기법으로 수행했습니다. 모든 시뮬레이션 구성의 친화도 향상은 계산된 응집 에너지 밀도(CED)로 평가했습니다. CED는 분자 시스템의 응집력을 나타내는 척도입니다. 대규모 연산이 필요하므로 KFUPM(사우디아라비아)의 고성능 컴퓨팅(HPC) 시설을 활용했습니다. 전반적인 방법론과 시뮬레이션 파라미터 선택은 연구진의 선행 연구 [41-47]를 기반으로 했으며, 세부 내용은 후술합니다.

SARS-CoV-2 스파이크(S)의 hACE2 및 점토 결정립과의 상호작용

SARS-CoV-2 S와 점토 결정립의 상호작용을 시뮬레이션하기 위해, Na-몬모릴로나이트 결정립을 다양한 개수로 스파이크 S 모델 위에 흡착시켰습니다. 흡착 시뮬레이션에는 소프트웨어 흡착 모듈의 메트로폴리스 몬테카를로 법을 사용했습니다. 각 단계에서 결정립은 스파이크 S 모델 주변 공간을 차지하며 시스템 전체 에너지를 낮춥니다. 최대 25,000 단계까지 필요한 수의 결정립을 흡착시킨 후, 소프트웨어의 Forcite 모듈(MD 원리 기반)로 시스템 에너지를 최소화했습니다. SARS-CoV-2 스파이크 분자와 hACE2의 상호작용 모델링에도 유사한 흡착 과정을 반복했습니다. 이때 hACE2 분자를 스파이크 S의 RBD 주변에 흡착시킨 뒤, 마찬가지로 MD 기반 모듈로 에너지 최소화를 수행했습니다.

Forcite 모듈의 NPT 앙상블(입자 수, 압력, 온도 일정)과 수정된 범용 힘장 [41]을 사용해 MD 시뮬레이션을 수행했습니다. 시뮬레이션은 5~30 ps 동안 0.5 fs 간격으로 실행하거나 일정한 부피에 도달할 때까지 진행했습니다. 온도 제어에는 베렌센 서모스탯(감쇠 상수 0.1 ps)을, 압력 제어에는 베렌센 바로스탯(감쇠 상수 0.1 ps)을 사용했습니다. 시뮬레이션 온도는 310 K(37 °C), 압력은 대기압(100 kPa)으로 유지했습니다. 단일 결정립에 대해 여러 서모스탯/바로스탯을 시험한 결과 베렌센 방법이 가장 적절했습니다. 몬테카를로 법에서는 교환, 컨포머, 회전, 병진, 재성장 비율을 각각 0.39, 0.2, 0.2, 0.2, 0.2로, 확률도 동일하게 설정했습니다. 회전 및 병진 진폭은 각각 5°, 1 Å로 정했습니다.

응집 에너지 밀도(CED) 측정

본 연구에서 SARS-CoV-2-점토 결정립 복합체와 SARS-CoV-2-hACE2 복합체의 친화도/결합 수준은 CED 변화로 평가했습니다. 점토 결정립 흡착 및 후속 분자 역학 시뮬레이션 후, Forcite 모듈의 CED 옵션으로 CED를 산출했습니다. 연구진은 총 CED, 반데르발스 CED, 정전기적 CED로 구성된 CED 개념이 다양한 분자 수준 과정과 상호작용을 잘 설명하며, 시뮬레이션된 복합체 간 친화도/결합 정도를 모사하는 데 적합함을 경험적으로 확인했습니다 [41-47]. 정량적으로 CED는 1몰의 물질을 액상에서 기상으로 전이시키는 데 필요한 에너지량으로 정의되며, 분자 간 상호 인력/인력을 반데르발스 힘과 정전기 힘으로 평균화한 값(NPT 앙상블 기준)입니다.

Forcite 모듈에서 반데르발스 에너지는 원자 기반 컷오프로 평가했습니다. 이 방법에서는 비결합 상호작용을 컷오프 거리까지만 계산하고 그 이상은 무시합니다. 직접 컷오프로 인한 불연속성을 피하기 위해 스무딩 함수로 비결합 상호작용을 거리 범위에 걸쳐 부드럽게 끕니다. 실제 퍼텐셜에 스무딩 함수를 곱해 유효 퍼텐셜을 만듭니다. 중간 영역에서 함수의 선택은 힘 계산을 위해 이 영역에서 연속적으로 미분 가능해야 합니다. 본 연구에서는 스플라인 폭 1 Å, 컷오프 거리 12.5 Å의 3차 스플라인 스무딩 함수를 사용했습니다.

결과 및 고찰

최종 SARS-CoV-2 S-hACE2 복합체 구성은 그림 4a에, SARS-CoV-2 스파이크와 다양한 개수의 Na-몬모릴로나이트 결정립 복합체는 그림 4b, c에 각각 나타냈습니다. 비교를 위해 다양한 비율/개수의 점토 결정립이 스파이크에 흡착된 경우와 hACE2 상호작용의 총 CED를 그림 5에 플로팅했습니다.

연구진의 경험에 비추어, 나노클레이는 높은 접착 특성 덕분에 SARS-CoV-2 억제제 역할을 할 수 있으리라 가정했습니다. 스파이크 S와 강하게 결합하여 hACE2와의 결합을 방해하는 방식입니다. 분자 수준 시뮬레이션 결과, SARS-CoV-2와 나노클레이 사이의 CED가 SARS-CoV-2와 hACE2 사이의 CED보다 매우 높게 나타남(그림 5)에 따라, 나노클레이가 SARS-CoV-2의 hACE2 결합을 억제할 수 있음을 시사합니다. 또한 그림 5에서 알 수 있듯, 나노클레이에 의한 억제 정도는 양(투여량) 의존적으로 증가합니다.

나노클레이와 SARS-CoV-2 스파이크 S의 상호작용

연구진은 앞서 나노클레이가 암세포와 미세환경 단백질 간 부착을 촉진해 전이를 제어하는 역할을 입증했습니다 [10]. Na-몬모릴로나이트와 팔리고르스카이트 75/25 혼합물로 부착력을 측정한 결과, 암세포와 세포외 기질 단백질 간 부착력이 100% 증가했습니다(그림 6a). 나노클레이가 Raji 세포와 피브로넥틴 단백질을 결합시키는 SEM 이미지는 그림 6b에 있습니다. 샘플 이미징은 밀러 의대(플로리다)의 FEI ESEM-FEG XL-30에서 SEM 모드로 수행했습니다. 이전 연구에서 정전기적, 반데르발스, 제타 전위(ZP) 인력이 부착 과정을 지배함을 발견했습니다 [10]. 동일한 메커니즘이 나노클레이의 접착 표면과 SARS-CoV-2 스파이크 결합에도 작용했을 것으로 결론지었습니다(그림 7). ZP는 콜로이드 형태에서 분산 또는 응집 경향, 현탁 매질 내 타 성분과의 상호작용을 나타내는 척도입니다. 일반적으로 |ZP| > 30 mV면 분산 경향, < 5 mV면 응집 경향을 보입니다. 본 연구에 사용된 점토 나노입자의 높은 분산 경향 ZP(-24 ~ -32 mV)는 더 넓은 표면적을 생성해 SARS-CoV-2 스파이크와의 상호작용을 증폭시킵니다. Na-몬모릴로나이트 나노입자는 ZP상 친수성이지만, 염 존재 시 소수성-친수성 표면 간 2차 부착 메커니즘도 촉진합니다 [10]. 또한 이 나노입자는 친수성과 상대적으로 높은 반발성 산-염기(AB) 상호작용(표 1) 덕분에 높은 분산 경향을 보이며, 이는 넓은 표면적 형성으로 이어져 반데르발스 인력과 정전기적 인력을 증대시킵니다. 아울러 Na-몬모릴로나이트 입자의 양전하 가장자리도 상대적으로 약하지만 스파이크 S에 정전기적으로 끌립니다.

SARS-CoV-2 스파이크 S와 점토 결정립 상호작용 시뮬레이션 결과(그림 5)도 위 상호작용 거동을 뒷받침합니다. 점토 나노입자 흡착으로 밀접하게 상호작용하는 강한 반데르발스 인력장이 형성되며, 이는 점토/SARS-CoV-2 구성의 CED를 높입니다. 점토 결정립 추가 후 총 CED가 크게 증가한 것(그림 5)은 SARS-CoV-2가 이 입자들과 매우 높은 친화력을 가짐을 입증하며, 이는 hACE2와의 친화력보다 훨씬 큽니다.

나노클레이를 유사 항체로

연구진의 과거 및 현재 연구 전반이 입증한 나노클레이의 고친화성 잠재력을 바탕으로, 나노클레이를 항체처럼 모방해 코로나바이러스를 끌어당겨 포집함으로써 인체 hACE2와의 결합을 차단할 수 있으리라 전제합니다. 항체는 적응 면역 반응의 일환으로 형질세포에서 합성되는 당단백질로, 체내 감염 제거를 돕습니다. 항체는 옵소닌화(식균 작용 촉진), 보체계 활성화, 미생물 응집, 바이러스/독소 중화 등 다양한 방식으로 감염 제거를 돕습니다. 바이러스 표면 단백질에 결합하면 바이러스가 표적 세포의 수용체에 부착하는 것을 막아 세포 진입을 차단합니다. 항체 결합 부위가 표면 단백질의 서로 다른 부위일 수 있으나, 최종 효과는 동일합니다. SARS-CoV-2의 경우 두 가지 항체 중화 메커니즘이 관찰되었으며 [1, 48], 그림 1c, d에 도시했습니다. 하나는 항체가 SARS-CoV-2 RBD의 부착 부위에 직접 결합해 hACE2와 경쟁하는 방식입니다. 다른 하나는 RBD의 다른 부위에 결합해 수용체와 경쟁하지 않으면서 중화하는 방식으로, 가장 강력한 단일클론항체(mAb)에서 관찰되었습니다 [1, 48]. 항체가 SARS-CoV-2 RBD와 상호작용해 hACE2 결합을 억제하는 것과 유사하게, 나노클레이로도 유사한 분자 수준 모델을 구축해 코로나바이러스 억제 효과를 모사했습니다(그림 8). 매우 높은 친화력 덕분에 나노클레이는 SARS-CoV-2 스파이크에 끌려가며, 이 스파이크의 RBD가 hACE2와 결합하는 것을 제한합니다.

나노클레이 투여 방법론 제안

점토를 약물 전달체로 활용한 다수의 시험에서 인체 세포에 대한 세포독성이 거의 없거나 전혀 없다는 유망한 결과가 나왔습니다. 카올리나이트 점토 광물은 약물 전달 시스템 후보로 시험돼 높은 생체적합성과 매우 낮은 세포독성을 보였습니다 [11]. Poly(d,l-lactide-co-glycolide)/몬모릴로나이트 나노입자의 in vitro 세포독성도 무시할 만한 수준이었습니다 [14]. 팔리고르스카이트-폴리에틸렌이민-플루오레세인 이소티오시아네이트 나노복합체 역시 in vitro에서 거의 세포독성을 보이지 않았습니다 [13]. 연구진은 in vivo 연구에서 흑색종 치료를 위해 나노클레이를 피하 주사한 경험도 있습니다 [34]. 점토가 항암제 전달체 및 기타 서방형 의약품으로 활용된 사례 [25-28]를 고려할 때, 나노클레이를 '나노클레이 단독' 의약품으로 주사 투여할 수 있을 것으로 제안하며, 이는 in vivo 및 임상시험 검증을 전제로 합니다.