임상 면역분석에 사용되는 PAMAM 및 양자점 기반 복합체 그룹

결과 및 토론

콤플렉스 그룹에는 PAMAM 부분과 QD 부분의 두 부분이 포함됩니다. PAMAM 부분은 PAMAM 결합 염소 항토끼 IgG입니다. 수성 환경에 이상적인 용해도 특성을 제공하기 위해 표면 안정화제로 5세대 아미노 말단 PAMAM 덴드리머(G5 PAMAM)를 사용했지만 이 덴드리머는 항체 결합에 유해한 강한 양전하를 가지고 있습니다. 양전하를 중화하기 위해 PAMAM을 DMSO에 용해시키고 숙신산 무수물(dihydro-2,5-diketotetrahydrofuran)을 첨가하여 PAMAM 아미노기를 중화했습니다. PAMAM의 아미노기는 숙신산 무수물과 반응하여 아미드 결합을 형성합니다[6,7,8,9,10]. 반응 후, 생성물을 투석, 동결건조, 칭량하고 재용해시켰으며, 생산은 거의 중성이었고 염소 항토끼 IgG와 결합할 수 있는 생성물을 "N-PAMAM"이라고 명명하였다. PAMAM, 특히 G5 PAMAM은 많은 수의 공동을 포함하며 IgG는 G5 PAMAM의 빈 공간 내에 캡슐화될 수 있습니다[11]. 염소 항토끼 IgG를 먼저 MES 완충액(0.1 mol/L, pH 6.0)에 용해시킨 다음, EDC 및 설포-NHS(몰비 1:1)를 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, N-PAMAM(중성 PAMAM)을 첨가한 다음 4 °C의 쉐이커 베드에서 밤새 인큐베이션했습니다. 이 고분자는 수용액에서 자가 조립되어 불용성 저분자량 게스트를 캡슐화하는 고분자 미셀을 형성합니다[12]. 반응 후, 미반응 물질을 제거하기 위해 투석이 필요하였다. 그 후 동결건조하여 칭량한 후 보존 완충액에 재용해하여 최종적으로 N-PAMAM이 결합된 염소 항토끼 IgG를 제조하였다.

MES에서 N-PAMAM-IgG(염소 항토끼)의 형광 및 UV-vis 스펙트럼은 그림 1에 나와 있습니다. N-PAMAM(중성 PAMAM) 및 IgG와 비교하여 N-PAMAM-IgG의 형광 방출 피크 강도가 가장 낮았다. UV-vis 스펙트럼은 IgG, MES 버퍼, PAMAM 및 N-PAMAM에 비해 N-PAMAM-IgG만이 파장 200 nm에서 흡수 피크를 가짐을 보여줍니다. 형광 스펙트럼이든 UV-vis 스펙트럼이든 N-PAMAM-IgG는 N-PAMAM 및 IgG와 다른 특성을 보여 N-PAMAM과 IgG가 단순히 혼합된 것이 아니라 결합되었음을 간접적으로 증명합니다. N-PAMAM-IgG의 항체 활성을 검출하기 위해 ELISA를 수행하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 N-PAMAM과 결합하여도 IgG(goat anti-rabbit) 항체 내성은 소실되지 않았다.

아 MES에서 PAMAM-IgG(염소 항토끼)의 형광 스펙트럼. 여기 파장은 548 nm였다. ㄴ MES에서 PAMAM-IgG(염소 항토끼)의 UV-vis 스펙트럼 및 파장 범위에 대한 방출 스펙트럼

N-PAMAM-IgG(염소 항토끼) 항체 내성을 검출하는 ELISA 방법. N-PAMAM-IgG는 항원으로 사용되었고 다른 농도로 희석되었습니다. 토끼 IgG-HRP를 항체 프로브로 사용하여 N-PAMAM-IgG의 내성을 검출했습니다. 흡광도 측정은 450 nm의 파장에서 수행되었습니다.

QDs의 부분은 QDs-conjugated goat anti-mouse IgG입니다. 항체 결합 양자점은 일반적으로 항체 분자가 양자점 표면의 카르복실기 또는 아미노기와 같은 작용기에 결합하는 교차 결합 반응에 의해 형성됩니다[13, 14]. 이 연구에서는 카르복실 리간드로 안정화된 코어/쉘 CdSe/ZnS 수용성 양자점과 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염)를 사용한 카르보디이미드 커플링 반응을 사용했습니다. 이 방법은 QD 표면에 항체를 접합하는 가장 널리 사용되는 방법 중 하나입니다[15,16,17]. CdSe/ZnS 양자점의 미셀은 먼저 붕산염 완충액(5 mM BS, pH 2)에서 EDC 및 설포-NHS의 존재하에 배양되었습니다. 그 다음, 염소 항-마우스 IgG를 첨가하고, 혼합물을 4 °C의 쉐이커 베드에서 암실에서 밤새 인큐베이션하였다. 마지막으로 10% BSA(bovine serum albumin)를 첨가하여 미반응 양자점을 차단하고, 순차적인 원심분리와 재용해를 통해 생산물을 정제하여 미반응 물질을 제거하였다. QDs-conjugated IgG(goat anti-mouse)의 항체 활성은 암실에서 4 °C 보관 후 3 개월 동안 유지될 수 있습니다.

QDs-IgG(염소 항마우스)의 입자 크기와 보존 완충액(2.5 mM BS, pH 8.0, 0.1% BSA)의 QD는 그림 3a에 나와 있습니다. 커플링 반응 후, 생성물의 직경이 분명히 증가하였고 생성물의 균질성과 안정성이 양호하였다. 이러한 특성은 감지 프로브로 사용하는 핵심입니다. QDs-IgG와 QDs의 형광 스펙트럼은 Fig. 3b와 같으며, Fig. 3a와 같이 생산직경이 증가함에 따라 QDs와 결합된 IgG가 QDs-IgG 형광발광 피크를 나타내었지만 QDs-IgG 형광발광 피크는 동일하였다. QD로. 이 결과는 IgG와 QD의 커플링이 QD의 광학적 특성을 변경하지 않았음을 의미하며, 이는 면역분석에서의 적용에 유용합니다. QDs-IgG의 항체 활성을 감지하기 위해 우리는 PVDF 멤브레인으로 ELISA 방법을 사용했습니다. 마우스 항-AKT 항체를 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml의 농도로 희석하고 4개의 농도 구배 항원을 QDs-IgG(염소 항마우스)와 혼성화시켰다. 0.1 mg/ml의 동일한 농도에서. 암소에서 37 °C에서 40분 동안 혼성화한 후 PVDF 멤브레인을 PBST(pH 6.0, 0.1% Tween 20)로 3회 세척하고 PVDF 멤브레인에 자외선을 조사하였다. 형광 강도는 그림 3c와 같이 항원 농도가 증가함에 따라 형광 강도가 증가하여 QDs-IgG가 높은 항체 활성을 가지고 있음을 나타냅니다.

아 QDs 및 QDs-conjugated IgG(염소 항마우스)의 유체역학적 직경 분포. (아 ) QD의 직경 및 (b ) QDs-접합된 IgG(염소 항-마우스). QDs의 평균 직경은 64.87 nm이고 QDs-IgG의 평균 직경은 211.4 nm이며 DLS로 감지됩니다. ㄴ QDs-IgG(염소 항마우스), QD 및 보존 완충액(2.5 mM BS, pH 8.0, 0.1% BSA)의 형광 스펙트럼. QDs-IgG 형광 방출 피크는 QDs의 것과 동일하여 QD에 대한 IgG의 커플링이 QD의 광학적 특성을 변경하지 않았음을 나타냅니다. ㄷ QDs-IgG(염소 항-마우스)의 항체 내성을 검출하는 ELISA 방법, PVDF 멤브레인을 UV로 평가

이 섹션에서는 FCM에서 이 콤플렉스 그룹을 활용하는 방법을 소개합니다. 위에서 언급한 것처럼 작은 단백질, 바이러스, 사이토카인[18]과 같은 다양한 유형의 항원을 검출할 수 있으며 HSP27 단백질을 예로 들어 그 과정을 자세히 살펴보겠습니다. HSP27은 세포질에 위치하며 특히 폐암, 췌장암, 요로상피암, 신장암, 유방암 및 흑색종 피부암에서 종양 세포에서 다량으로 분비된다. HSP27의 일부는 세포외로 분비되기 때문에 우리는 단백질을 추출하기 위해 세포를 용해해야 합니다. 이 실험에서는 MCF-7(인간 유방암 세포)을 테스트 그룹으로, L02(정상 인간 간 세포)를 대조군으로 두 개의 세포주를 선택했습니다. 세포를 용해하여 세포내 단백질을 추출하였다. 총 단백질을 수집한 후, 토끼 항-HSP27 및 마우스 항-HSP27을 단백질 농도에 따라 첨가한 후, 37°C에서 50분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 N-PAMAM-IgG를 혼합물에 첨가하고 혼합물을 37℃에서 30분 동안 배양한 다음 테스트 그룹과 PAMAM 그룹의 동일한 두 그룹으로 나누었습니다. 마지막으로 QDs-IgG를 테스트 그룹에 추가하고 암실에서 30분 동안 37°C에서 배양했습니다. 그림 4는 유세포 분석에 의한 두 그룹의 세포에 대한 형광 분석을 보여줍니다. 테스트 곡선의 형광 강도는 MCF-7 그룹에서 PAMAM 곡선보다 훨씬 높았지만 L02 그룹에서는 두 곡선이 거의 겹쳤습니다. HSP27이 세포 추출물에 존재할 때, N-PAMAM-IgG와 QDs-IgG는 간접적으로 함께 결합하여 토끼 항-HSP27 및 마우스 항-HSP27의 존재 하에 샌드위치 조합을 형성합니다. HSP27이 존재하지 않으면 소량의 QDs-IgG만이 비특이적 흡착에 의해 N-PAMAM-IgG에 결합합니다. 따라서 테스트 곡선의 형광 강도가 대조군 PAMAM 곡선의 형광 강도보다 높으면 샘플에 HSP27이 포함됩니다. 그림 4는 MCF-7 세포가 L02 세포보다 HSP27 단백질을 더 많이 분비함을 보여줍니다.

유세포 분석에 의한 HSP27의 형광 분석. 아 L02 세포. ㄴ MCF-7 세포. 시험군은 N-PAMAM-IgG 및 QDs-IgG, 대조군으로서 PAMAM군과 함께 인큐베이션하였고, N-PAMAM-IgG와 함께 인큐베이션하여 FCM에 의해 검출된 미세분자 단백질에 대한 유사세포를 형성하였다. 두 곡선이 거의 겹치면 샘플에 HSP27이 없는 것으로 결정할 수 있습니다. 따라서 QDs-IgG의 첨가 여부에 관계없이 형광 강도는 변하지 않습니다.

위에서 언급한 바와 같이, 이러한 복합체는 FCM에 의해 분비된 세포내 단백질을 검출할 수 있습니다. 원칙적으로 이러한 복합체는 모든 종류의 항원에 적용될 수 있습니다. 또한 조합의 두 부분을 별도로 사용할 수 있습니다. 검출하고자 하는 항원이 세포 또는 세포 표면에 있는 경우 QD 부분만 사용할 수 있습니다. 예를 들어, β-액틴은 세포에 위치하는 세포골격의 주성분 중 하나로 진핵세포에 널리 존재한다. 그림 5a는 FCM에 의해 HeLa 세포에서 β-액틴에 대한 QD 부분만을 사용한 형광 분석을 보여줍니다. HeLa 세포를 세척하고 메탄올로 처리하여 세포막의 침투를 강화한 다음 동일한 두 그룹으로 나누었습니다. β-액틴 그룹은 마우스 항-β-액틴과 함께 37℃에서 30분 동안 배양되었고, 대조군은 BSA와 함께 배양되었습니다. PBS로 세척한 후, 두 그룹 모두 QDs-IgG(염소 항마우스)와 함께 37°C에서 30분 동안 인큐베이션되었습니다. PBS로 2회 세척한 후, 두 그룹 모두 FCM에 의해 검출되었다. β-액틴 곡선의 형광 강도는 대조 곡선의 형광 강도보다 훨씬 높았으며, 이는 HeLa 세포에 β-액틴 단백질이 포함되어 있음을 나타냅니다.

아 HeLa 세포에서 β-액틴에 대한 형광 분석. β-액틴 그룹에는 마우스 항-β-액틴 및 QDs-IgG(염소 항-마우스)를, 대조군에는 BSA 및 QDs-IgG를 배양하였다. 대조군은 QDs-IgG의 비특이적 흡착으로 인한 배경 형광을 배제할 수 있습니다. ㄴ UV-vis 조사에서 HeLa 세포의 형광 현미경 이미지. DAPI는 세포 핵을 염색하고 청색 형광을 방출했습니다. QDs-IgG는 β-액틴과 간접적으로 결합되어 적색 형광을 방출합니다. 스케일 바 20 μm

또한 이러한 콤플렉스는 ICC에도 적용할 수 있습니다. 그러나 ICC의 경우 표적 항원이 세포 또는 세포 표면에 위치해야 하고 다량으로 존재해야 한다[19]. 그렇지 않으면 실험 대상이 배경과 구별되기 어려울 것입니다. 우리는 예를 들어 β-액틴 단백질을 취하고 10 cm 세포 플레이트에 HeLa 세포를 파종하고 그 안에 현미경 커버슬립을 놓고 메탄올을 사용하여 세포를 고정시킵니다. 그런 다음 세포를 마우스 항-β-액틴(PBS, 1% BSA)과 함께 37 °C에서 1 시간 동안 배양하고, PBST로 두 번 세척하고, 37 °C에서 QDs-IgG(염소 항-마우스)와 항온처리했습니다. 1 시간 동안 어둡다. PBST로 두 번 세척하고 DAPI로 세포핵을 염색한 후 형광현미경으로 형광을 검출하였다[20, 21]. 그림 5b는 HeLa 세포의 형광 현미경 이미지를 보여줍니다. 형광 염료로서의 QD의 장점은 QD의 신호와 DAPI 신호가 자외선 채널의 조사 하에서 동시에 관찰될 수 있다는 것입니다. 따라서 핵에 따르면 표적을 분명히 찾을 수 있습니다. 이 실험에서 β-actin은 세포핵 주변의 세포골격 단백질이며 분명히 관찰할 수 있다.