PAMAM-양자점 복합체를 이용한 신속한 임상 면역분석법

요약

본 연구에서는 임상 면역분석에 사용되는 복합체 그룹을 보고합니다. 이 복합체는 PAMAM-접합 염소 항토끼 IgG와 양자점(QDs)-접합 염소 항마우스 IgG로 구성됩니다. 토끼 항항원과 마우스 항항원을 첨가하면 해당 항원이 검출됩니다. 이 복합체를 이용한 실험은 간편하고 편리하며, 시간과 단계가 짧습니다. 또한 유세포분석(FCM), 면역세포화학(ICC), 면역조직화학(IHC) 등 다양한 실험 방법에 적용 가능하여 여러 종류의 항원을 검출할 수 있습니다.

서론

양자점(QDs)은 높은 형광 양자 수율, 높은 광안정성, 낮은 광표백 특성으로 인해 발광체로 널리 사용됩니다. 또한 세포 이미징과 생명공학 분야에서 유기 형광체로도 광범위하게 활용됩니다. 특히 카드뮴 함유 QDs(CdSe, CdTe)는 430~660 nm 범위의 동일 파장 조사 하에서 크기 의존적 방출 전자기 스펙트럼을 보이므로 큰 장점이 있습니다. 따라서 항체-접합 QDs는 분자 영상을 위한 가장 유망한 프로브입니다.

폴리아미도아민 덴드리머(PAMAM)는 가장 광범위하고 깊이 연구된 덴드릭 거대분자 중 하나로, 수많은 표면 관능기, 내부 공극, 나노미터 크기, 높은 생체적합성을 특징으로 합니다. 약물 및 항체와 접합 시 약물의 용해도와 전신 순환을 개선하면서 생물학적 활성은 저해하지 않습니다. 따라서 PAMAM으로 변형된 항체는 임상 면역분석에 자주 사용됩니다.

임상 면역분석에는 웨스턴 블롯(WB), ELISA, 면역조직화학(IHC), 면역세포화학(ICC), 유세포분석(FCM) 등 다양한 방법이 있습니다. 그중 FCM은 특정 항체 프로브를 이용해 단일 세포나 생물학적 입자를 세포 및 분자 수준에서 신속하게 분석하므로 가장 널리 사용되는 면역분석법 중 하나입니다. 세포 선별 시 해당 항체 프로브만으로 충분하지만, 소단백질, 바이러스, 사이토카인 같은 작은 생물학적 분자 선별이 필요하면 CBA(세포구슬배열)법을 채택해야 합니다. FCM으로는 작은 사이토카인을 직접 검출할 수 없기 때문입니다. CBA법은 표면에 특이적 포획 항체가 구성된 염료 표지 구슬을 사용합니다. CBA 구슬을 시료와 해당 염료 표지 항체와 혼합하면 샌드위치 복합체가 형성되어(ELISA와 유사), 작은 항원을 FCM으로 검출할 수 있습니다.

본 연구에서는 PAMAM-접합 염소 항토끼 IgG와 QDs-접합 염소 항마우스 IgG로 구성된 복합체 그룹을 제시합니다. 이 복합체는 FCM, ICC, IHC에 활용 가능합니다. 토끼 항항원과 마우스 항항원을 첨가하면 해당 항원이 검출됩니다. 이 모델은 해당 마우스 및 토끼 항체가 존재할 때 소단백질, 바이러스, 사이토카인 등 다양한 항원 유형을 검출할 수 있습니다. 도식 1은 FCM에서 복합체 형성 및 활용 과정을 HSP27을 예로 들어 보여줍니다. HSP27은 HSPB1(열충격단백질 가족 B 1번)로도 알려져 있으며, 약물 내성, 세포 성장, 세포사멸, 종양 발생 및 전이 등에 관여하는 중요한 단백질입니다. 이 모델에서 PAMAM-접합 염소 항토끼 IgG는 CBA 구슬과 유사하게 운반체이자 포획체 역할을 하여 작은 분자 항원을 FCM으로 검출할 수 있게 합니다. QDs-접합 염소 항마우스 IgG는 형광 프로브 역할을 합니다. 항원이 막단백질이나 세포내 단백질인 경우 기존 FCM법으로 검출 가능하며, 이때는 QDs만 필요하고 PAMAM 부분은 필요하지 않습니다. 세포내 단백질과 막단백질의 경우 세포 자체가 FCM법으로 직접 검출 가능한 표적이 되므로, 위세포를 구성하기 위한 PAMAM 부분이 필요하지 않습니다. 따라서 복합체를 분리하여 개별적으로 사용할 수 있습니다.

결과 및 고찰

이 복합체 그룹은 PAMAM 부분과 QDs 부분 두 부분으로 구성됩니다. PAMAM 부분은 PAMAM-접합 염소 항토끼 IgG입니다. 제5세대 아미노 말단 PAMAM 덴드리머(G5 PAMAM)를 표면 안정제로 사용하여 수용액 환경에 이상적인 용해도 특성을 부여했으나, 이 덴드리머는 강한 양전하를 띠어 항체 결합에 해로울 수 있습니다. 양전하를 중화하기 위해 PAMAM을 DMSO에 용해하고 숙신산 무수물(디히드로-2,5-디케토테트라하이드로푸란)을 첨가해 PAMAM 아미노기를 중화했습니다. PAMAM의 아미노기가 숙신산 무수물과 반응해 아마이드 결합을 형성합니다. 반응 후 생성물을 투석, 동결건조, 칭량, 재용해하면 거의 중성인 생성물인 'N-PAMAM'을 얻으며, 이는 염소 항토끼 IgG와 접합 가능합니다. 특히 G5 PAMAM은 수많은 공극을 포함하며, IgG가 G5 PAMAM의 빈 공간 내에 캡슐화될 수 있습니다. 염소 항토끼 IgG를 MES 완충액(0.1 mol/L, pH 6.0)에 용해한 후 EDC와 sulfo-NHS(몰비 1:1)를 첨가하고 15분간 배양했습니다. 마지막으로 N-PAMAM(중성 PAMAM)을 첨가하고 4°C에서 하룻밤 교반 배양했습니다. 이 고분자는 수용액에서 자가조립해 고분자 미셀을 형성하며, 그렇지 않으면 불용성인 저분자량 게스트를 캡슐화합니다. 반응 후 비반응 물질을 제거하기 위해 투석이 필요했습니다. 이후 생성물을 동결건조, 칭량, 보존 완충액에 재용해하여 최종적으로 N-PAMAM-접합 염소 항토끼 IgG를 제조했습니다.

MES 중 N-PAMAM-IgG(염소 항토끼)의 형광 및 UV-vis 스펙트럼은 그림 1에 나와 있습니다. N-PAMAM(중성 PAMAM)과 IgG에 비해 N-PAMAM-IgG의 형광 방출 피크 강도가 가장 낮았습니다. UV-vis 스펙트럼에서는 IgG, MES 완충액, PAMAM, N-PAMAM과 비교해 N-PAMAM-IgG만이 200 nm 파장에서 흡수 피크를 보였습니다. 형광 스펙트럼이나 UV-vis 스펙트럼 모두에서 N-PAMAM-IgG는 N-PAMAM 및 IgG와 다른 특성을 보여, 두 물질이 단순히 혼합된 것이 아니라 결합되었음을 간접적으로 입증합니다. N-PAMAM-IgG의 항체 활성을 확인하기 위해 ELISA를 수행했습니다. 그림 2에서 보듯, IgG(염소 항토끼)의 항체 활성은 N-PAMAM과의 결합 후에도 손실되지 않았습니다.

QDs-접합 염소 항마우스 IgG 제조 및 특성

QDs 부분은 QDs-접합 염소 항마우스 IgG입니다. 항체-접합 QDs는 일반적으로 교차 결합 반응으로 형성되며, 항체 분자가 QDs 표면의 카르복실기나 아미노기 같은 관능기에 결합합니다. 본 연구에서는 카르복실 리간드로 안정화된 코어/쉘 CdSe/ZnS 수용성 양자점을 사용하고, EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 염산염)를 이용한 카르보디이미드 결합 반응을 진행했습니다. 이 방법은 항체를 QDs 표면에 접합하는 가장 대중적인 방법 중 하나입니다. CdSe/ZnS QDs 미셀을 EDC와 sulfo-NHS가 존재하는 붕산염 완충액(5 mM BS, pH 7.2)에서 먼저 배양했습니다. 이후 염소 항마우스 IgG를 첨가하고 4°C에서 암소 하룻밤 교반 배양했습니다. 마지막으로 10% BSA(우혈청알부민)를 첨가해 미반응 QDs를 차단하고, 연속 원심분리와 재용해로 미반응 물질을 제거해 정제했습니다. QDs-접합 IgG(염소 항마우스)의 항체 활성은 4°C 암소 보관 시 3개월간 유지됩니다.

보존 완충액(2.5 mM BS, pH 8.0, 0.1% BSA)에서 QDs-IgG(염소 항마우스)와 QDs의 입자 크기는 그림 3a에 나와 있습니다. 결합 반응 후 생성물의 직경이 명백히 증가했으며, 생성물은 좋은 균일성과 안정성을 보였습니다. 이는 검출 프로브로서 사용하기 위한 핵심 특성입니다. QDs-IgG와 QDs의 형광 스펙트럼은 그림 3b에 나타나며, 그림 3a에서 생성물 직경 증가는 IgG가 QDs와 결합했음을 보여주지만, QDs-IgG의 형광 방출 피크는 QDs와 동일했습니다. 이 결과는 IgG와 QDs의 결합이 QDs의 광학적 특성을 변화시키지 않았음을 의미하며, 면역분석 적용에 유리합니다. QDs-IgG의 항체 활성을 확인하기 위해 PVDF 막을 이용한 ELISA법을 수행했습니다. 마우스 항-AKT 항체를 1, 10, 100, 200 μg/ml로 희석한 4단계 농도 기울기 항원을 동일 농도(0.1 mg/ml)의 QDs-IgG(염소 항마우스)와 혼성화했습니다. 37°C 암소에서 40분간 혼성화 후 PBST(pH 6.0, 0.1% Tween 20)로 3회 세척하고 자외선 조사했습니다. 그림 3c의 형광 강도는 항원 농도 증가에 따라 증가하여 QDs-IgG가 높은 항체 활성을 가짐을 입증했습니다.

FCM을 이용한 HSP27 단백질 검출

앞서 언급한 대로 이 복합체 그룹을 FCM에 활용하는 방법을 소개합니다. 소단백질, 바이러스, 사이토카인 등 다양한 항원을 검출할 수 있으며, 여기서는 HSP27 단백질을 예로 들어 자세히 설명합니다. HSP27은 세포질에 위치하며 종양 세포에서 대량 분비되는데, 특히 폐암, 췌장암, 비뇨기상피암, 신장암, 유방암, 흑색종에서 많이 분비됩니다. HSP27의 일부가 세포외로 분비되므로 세포를 용해해 단백질을 추출해야 합니다. 본 실험에서는 MCF-7(인간 유방암 세포)을 실험군, L02(정상 인간 간세포)를 대조군으로 선정했습니다. 세포를 용해해 세포내 단백질을 추출하고, 총단백질을 수집한 후 단백질 농도에 따라 토끼 항-HSP27과 마우스 항-HSP27을 첨가해 37°C에서 50분간 배양했습니다. 이후 N-PAMAM-IgG를 첨가하고 37°C에서 30분간 배양한 후, 실험군과 PAMAM군 두 그룹으로 균등 분할했습니다. 마지막으로 실험군에 QDs-IgG를 첨가하고 37°C 암소에서 30분간 배양했습니다. 그림 4는 두 세포 그룹의 유세포분석 형광 분석 결과입니다. MCF-7 그룹에서 실험군 곡선의 형광 강도가 PAMAM군 곡선보다 훨씬 높았으며, L02 그룹에서는 두 곡선이 거의 겹쳤습니다. 세포 추출물에 HSP27이 존재하면 토끼 항-HSP27과 마우스 항-HSP27 존재 하에서 N-PAMAM-IgG와 QDs-IgG가 간접적으로 결합해 샌드위치 복합체를 형성합니다. HSP27이 없으면 비특이적 흡착에 의해 소량의 QDs-IgG만 N-PAMAM-IgG에 결합합니다. 따라서 실험군 곡선의 형광 강도가 대조군 PAMAM 곡선보다 높으면 시료에 HSP27이 포함된 것입니다. 그림 4에서 MCF-7 세포가 L02 세포보다 더 많은 HSP27 단백질을 분비함을 확인할 수 있습니다.

QDs 부분 단독 이용: β-actin 검출

위에서 언급한 바와 같이 이 복합체는 FCM으로 분비성 세포내 단백질을 검출할 수 있으며, 원리적으로 모든 종류의 항원에 적용 가능합니다. 또한 복합체의 두 부분을 별도로 사용할 수도 있습니다. 검출하려는 항원이 세포 내나 세포 표면에 위치하면 QDs 부분만 사용할 수 있습니다. 예를 들어 β-actin은 세포골격의 주요 구성 성분으로 세포 내에 존재하며 진핵세포에 널리 분포합니다. 그림 5a는 HeLa 세포에서 β-actin을 QDs 부분만 이용해 FCM으로 분석한 형광 결과입니다. HeLa 세포를 세척하고 메탄올로 처리해 세포막 투과성을 높인 후 두 그룹으로 나눴습니다. β-actin군은 마우스 항-β-actin으로 37°C에서 30분간 배양하고, 대조군은 BSA로 배양했습니다. PBS로 세척 후 두 그룹 모두 QDs-IgG(염소 항마우스)로 37°C에서 30분간 배양했습니다. PBS로 두 번 세척 후 FCM으로 분석했습니다. β-actin군 곡선의 형광 강도가 대조군 곡선보다 훨씬 높아 HeLa 세포에 β-actin 단백질이 존재함을 확인했습니다.

ICC 적용: β-actin 검출

또한 이 복합체는 ICC에도 적용 가능합니다. 다만 ICC에서는 표적 항원이 세포 내나 세포 표면에 위치하고 다량 존재해야 하며, 그렇지 않으면 실험 대상을 배경과 구별하기 어렵습니다. β-actin 단백질을 예로 들어 HeLa 세포를 10 cm 배양 접시에 심고 커버슬립을 놓은 후 메탄올로 세포를 고정했습니다. 이후 마우스 항-β-actin(PBS, 1% BSA)으로 37°C에서 1시간 배양하고 PBST로 두 번 세척한 뒤 QDs-IgG(염소 항마우스)로 37°C 암소에서 1시간 배양했습니다. PBST로 두 번 세척하고 DAPI로 세포핵을 염색한 후 형광현미경으로 형광을 검출했습니다. 그림 5b는 HeLa 세포의 형광현미경 이미지입니다. QDs를 형광 염료로 사용할 때의 장점은 QDs 신호와 DAPI 신호를 자외선 채널 조사 하에서 동시에 관찰할 수 있어, 세포핵을 기준으로 표적을 명확히 위치시킬 수 있다는 점입니다. 이 실험에서 β-actin은 세포핵 주변의 세포골격 단백질로 뚜렷하게 관찰되었습니다.

결론

결론적으로 FCM, ICC 등 임상 면역분석에 사용되는 복합체의 적용을 입증했습니다. 이 복합체 그룹은 PAMAM-접합 염소 항토끼 IgG와 QDs-접합 염소 항마우스 IgG로 구성됩니다. 토끼 항항원과 마우스 항항원을 첨가하면 해당 항원이 검출됩니다. 이 복합체는 광범위한 스펙트럼, 높은 생체적합성, 높은 광안정성, 낮은 생물학적 독성이 장점입니다. 이 복합체는 해당 일차 항체만 교체하면 되는 범용 모델입니다. 본 논문에서는 HSP27과 β-actin을 검출했지만, 이론적으로 모든 유형의 항원에 적용 가능합니다. 또한 항원의 특성에 따라 검출 방법을 선택할 수 있으며, 실제 필요에 따라 복합체를 분리해 개별적으로 사용할 수도 있습니다. 이 방법을 통해 소단백질, 바이러스 등 작은 분자도 유세포분석으로 검출할 수 있습니다. 적절한 개선을 통해 면역형광(IF), 웨스턴 블롯(WB), 측면유동 면역크로마토그래피 스트립(LCS) 등 다른 방법에도 적용 가능할 것으로 기대됩니다.

재료 및 방법

재료

CdSe/ZnS 양자점(카르복실기 함유 수용성 QDs, cas no. N/A)은 중국 NEPQD에서 구입했습니다. PAMAM(제5세대 아미노 말단, Lot no. CYD-150A)은 중국 CYD에서 구입했습니다. 염소 항토끼 IgG(ab6702)와 마우스 항-β-actin(ab8226)은 영국 Abcam에서, 마우스 항-HSP27(BF0624)과 토끼 항-HSP27(AF6082)은 미국 Affinity에서, 염소 항마우스 IgG(bs0296G)는 중국 Bioss에서 구입했습니다. EDC와 sulfo-NHS는 Thermo Fisher에서, DMEM과 태아우혈청은 Gibco에서, PVDF 막(0.2 μm)은 Millipore에서 구입했습니다. 기타 모든 시약은 분석용 등급을 사용했습니다.

N-PAMAM-IgG(염소 항토끼) 제조

1. a)

   N-PAMAM(중성 PAMAM) 제조: PAMAM(G5 아미노 말단, 평균 분자량 28826) 60 mg(2.081 mM)을 DMSO 2 ml에 용해하고 숙신산 무수물(디히드로-2,5-디케토테트라하이드로푸란) 0.266 g(2.66 mM)을 첨가해 아미노기를 중화했습니다. G5 PAMAM 1몰당 128몰의 아미노기를 가지므로 60 mg PAMAM에는 0.266 mM 아미노기가 포함되며, PAMAM 아미노기와 숙신산 무수물의 몰비는 약 1:10입니다. 혼합물을 100 rpm 교반기에서 4시간 교반한 후, 3500 MWCO 투석막으로 24시간 투석하고 동결건조해 N-PAMAM을 얻었습니다.

2. b)

   N-PAMAM-IgG(염소 항토끼) 제조: MES 완충액(100 mM, pH 6.0)을 제조한 후 100 μl를 튜브에 담고 20 μM EDC, 20 μM sulfo-NHS를 첨가해 저속 볼텍스로 교반했습니다. 35.7 μl IgG(pH, 0.5 μM)를 첨가하고 볼텍스 교반한 후 19 μg N-PAMAM을 첨가해 4°C에서 하룻밤 배양했습니다. 이후 3500 MWCO와 8000 MWCO 투석막으로 3일간 투석하고 동결건조해 N-PAMAM-IgG를 얻었습니다.

QDs-IgG(염소 항마우스) 제조

1. a)

   BS 완충액 제조:

1. 1.

   붕사 완충액(50 mM): 붕사 19.07 g을 초순수 1 L에 용해.

2. 2.

   붕산 완충액(50 mM): 붕산 3.09 g을 초순수 1 L에 용해.

3. 3.

   pH 8.0 BS 완충액과 pH 7.2 BS 완충액을 위 두 용액 혼합으로 제조.

4. 4.

   세척 완충액(보존 완충액 겸용): pH 8.0 BS 완충액을 5 mM으로 희석하고 0.1% Tween 20 첨가.

5. 5.

   활성화 용액: pH 7.2 BS 완충액을 5 mM으로 희석하고 0.1% Tween 20 첨가.

6. 6.

   EDC 완충액: EDC 0.27 g을 활성화 용액 5 ml에 용해. sulfo-NHS 완충액: sulfo-NHS 0.378 g을 활성화 용액 5 ml에 용해.

1. b)

   QDs-IgG(염소 항마우스) 제조:

먼저 QDs(CdSe/ZnS, 5 mg/ml) 450 μl를 활성화 용액 2.25 ml에 용해한 후 EDC 완충액 150 μl와 sulfo-NHS 완충액 150 μl를 첨가하고 얼음 위에서 5분간 초음파 처리했습니다. 이후 12,000 rpm으로 5분간 원심분리해 상등액을 제거하고 침전물을 세척 완충액 1.2 ml에 용해했습니다. 30분간 초음파 혼합 후 100 μg IgG 항체를 첨가하고 4°C에서 하룻밤 교반 배양했습니다. 10% BSA 150 μl를 첨가하고 30°C에서 30분간 배양한 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리해 상등액을 제거했습니다. 침전물을 세척 완충액 1 ml에 재용해하고 12,000 rpm으로 2분간 원심분리하는 과정을 반복한 후 최종적으로 침전물을 보존 완충액 1 ml에 용해했습니다. 마지막으로 10% BSA를 첨가하고 충분한 초음파 혼합 후 820 g/min으로 원심분리해 상등액에 QDs-IgG를 얻었습니다. QDs-IgG는 4°C 암소에서 3개월간 보관해야 합니다. 주의할 점은 시료를 4°C에서만 보관할 수 있으며, 글리세린이 있어도 냉동하면 안 됩니다. 그렇지 않으면 다량의 양자점이 뭉쳐 침전되어 PBST로 씻어낼 수 없어 심각한 배경 형광을 유발합니다.

HSP27 단백질 FCM 분석

HSP27은 세포질에 위치하며 종양 세포에서 대량 분비됩니다. 본 실험에서는 MCF-7(인간 유방암 세포)을 실험군, L02(정상 인간 간세포)를 대조군으로 했습니다. 두 세포 그룹을 10 cm 배양 접시에 파종하고 10% 태아우혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37°C 배양했습니다. 세포가 접시의 80%를 덮으면 트립신으로 소화하고 PBS로 두 번 세척했습니다. 이후 세포를 1 ml PBS에 재현탁하고 혈구계산기로 세포 수를 센 후, 세포 농도에 따라 T-PER 세포 용해 완충액을 첨가해 세포내 단백질을 추출했습니다. 세포 용해액을 14000 rpm으로 10분간 원심분리해 상등액을 수집하고 BCA법으로 단백질 농도를 측정했습니다. 단백질 농도에 따라 토끼 항-HSP27과 마우스 항-HSP27을 첨가해 37°C에서 50분간 배양했습니다. 본 실험에서 L02 단백질 농도는 약 0.2 mg/ml, MCF-7은 0.25 mg/ml였으며 양쪽 모두 500 μl였습니다. 두 항체(토끼 항-HSP27, 마우스 항-HSP27)를 세포에 첨가했습니다(MCF-7에 0.625 μl, L02에 0.5 μl).

이후 1 mg/ml N-PAMAM-IgG를 혼합물에 첨가하고 37°C에서 30분간 배양했습니다(MCF-7군에 6.25 μl, L02군에 5 μl). 배양 후 생성물을 실험군과 PAMAM군 두 그룹으로 균등 분할했습니다. 마지막으로 실험군에 QDs-IgG를 첨가하고 37°C 암소에서 30분간 배양했습니다. 이후 두 세포 그룹을 유세포분석기로 분석했습니다.

β-actin 단백질 FCM 분석

β-actin은 세포골격의 주요 구성 성분으로 세포 내에 존재하며 진핵세포에 널리 분포합니다. HeLa 세포를 10 cm 배양 접시에 파종하고 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 37°C로 2일간 배양했습니다. 상등액을 제거하고 PBS로 두 번 세척한 후 트립신으로 소화했습니다. 이후 800 rpm으로 3분간 원심분리해 상등액을 제거하고 차가운 메탄올 1 ml로 세포를 재현탁했습니다. 5분 후 800 rpm으로 3분간 원심분리해 상등액을 제거하고 PBS 1 ml로 재현탁했습니다. 이 과정을 반복한 후 HeLa 세포를 두 그룹으로 균등 분할했습니다. 실험군은 마우스 항-β-actin으로 37°C에서 30분간 배양하고, 대조군은 BSA(우혈청알부민)로 배양했습니다. 본 실험에서 마우스 항-β-actin을 PBST(1% BSA, 5 μg/ml)에 용해했고, 실험군 300 μl에 100 μl IgG를 첨가했으며 대조군에는 동량의 BSA를 첨가했습니다. 30분 배양 후 두 그룹 모두 QDs-IgG(염소 항마우스)로 37°C에서 30분간 배양했습니다. PBS로 두 번 세척 후 두 그룹 모두 FCM으로 분석했습니다.

β-actin 단백질 ICC 분석

HeLa 세포를 10 cm 배양 접시에 파종하고 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 37°C로 1일간 배양했습니다. 이후 여러 멸균 커버슬립을 세포 접시에 넣고 2일간 추가 배양했습니다. 커버슬립을 꺼내 PBS로 두 번 세척한 후 400 μl 메탄올에 20분간 실온에서 배양했습니다. 커버슬립을 PBS로 3회 세척했습니다. 차단 완충액을 PBST(0.1% Tween 20), 22.52 mg/ml 글리신, 10% BSA로 제조했습니다. 커버슬립을 차단 완충액에 넣고 실온에서 30분간 배양했습니다. 차단 완충액을 제거하고 마우스 항-β-actin(PBS, 1% BSA)으로 37°C에서 1시간 배양한 후 PBST로 두 번 세척하고 QDs-IgG(염소 항마우스)로 37°C 암소에서 1시간 배양했습니다. PBST로 두 번 세척하고 DAPI로 세포핵을 2분간 염색한 후 커버슬립을 PBS로 한 번, 물로 한 번 헹구고 형광현미경으로 관찰했습니다.