금 나노입자-약물 상호작용이 쥐에서 크기 의존적 급성 신장 손상 유발

초록

나노물질은 많은 유용한 특성을 지닌 혁신적인 소재지만, 생체에 미치는 알려지지 않은 영향에 대한 우려가 존재합니다. 금 나노입자는 우수한 특성 덕분에 산업 소재로 널리 사용되지만, 그 잠재적 생물학적 위해성은 아직 명확히 밝혀지지 않았습니다. 본 연구에서는 직경 10, 50, 100 nm의 금 나노입자(GnP10, GnP50, GnP100)와 약물과의 상호작용이 쥐에서 나타내는 생체 내 영향을 조사하여 포유류에서의 안전성을 평가했습니다.

시스플라틴, 파라콰트, 5-아미노살리실산은 쥐에서 간과 신장에 부작용 손상을 유발하는 것으로 알려져 있습니다. 금 나노입자 단독으로 꼬리 정맥 투여 시 어떤 크기에서도 간독성이나 신독성이 관찰되지 않았습니다. 그러나 GnP10을 시스플라틴, 파라콰트, 또는 5-아미노살리실산과 병용 투여했을 때 신장 부작용 손상이 발생했습니다. 이는 직경 10 nm의 금 나노입자가 약물과의 상호작용으로 인해 잠재적으로 신독성을 가질 수 있음을 시사합니다.

서론

나노기술은 21세기에 점점 더 중요한 역할을 하고 있으며, 나노물질은 나노기술 발전의 기반이 됩니다. 최근 나노입자 제조 기술의 발전으로 혁신적인 나노물질이 전 세계적으로 활용되고 있습니다. 나노물질은 직경 100 nm 이하로, 금, 은, 실리카, 백금, 이산화 티타늄 나노입자, 풀러렌, 탄소 나노튜브 등이 포함됩니다. 이들은 전자 저장 기술, 유전자/재생 의학, 전자 소자 등에 응용되어 21세기 신산업의 토대가 되고 있습니다.

그러나 PM2.5 같은 나노입자는 심각한 환경 오염, 천식 같은 호흡기 질환, 허혈성 심장병을 유발합니다. 자동차 배출 디젤 입자는 뇌와 생식 기관에 침투해 생물학적 영향을 미치며, 석면 같은 섬유성 미세입자는 중피종을 유발하고, 탄소 나노튜브 같은 산업용 섬유 나노물질도 인체 건강에 악영향을 줄 수 있습니다. 따라서 나노입자의 생물학적 영향에 대해서는 여전히 많은 미지수가 남아 있습니다.

금(Au)은 이온화 경향이 낮고 안정성이 높아 고대부터 귀금속 장식용으로 사용되었습니다. 최근 개발된 금 나노입자는 고유한 광학적 특성 덕분에 의료 및 공학 분야에서 널리 활용되고 있으며, 우수한 광전자 특성으로 유기 태양전지, 센서 프로브, 전도성 소재에도 쓰입니다. 화학 산업에서는 아크릴 수지 합성 촉매로, 저온에서 백금 나노입자보다 우수한 CO 산화 촉매 활성을 보여 배기가스 정화 촉매로도 사용됩니다. 금 나노입자의 추가 응용이 기대되지만, 금 나노입자의 독성과 약물과의 상호작용 가능성에 대한 연구는 부족한 실정입니다.

나노기술 분야는 나노입자의 안전성, 약리학, 약동학 연구로 확장되고 있습니다. 실리카 나노입자는 세포독성, 간독성, 태반 손상을 유발하고, 탄소 나노튜브는 폐 중피종을 유도할 수 있습니다. 그러나 나노입자와 약물 간 상호작용으로 인한 약리학적 효과는 거의 알려져 있지 않습니다. 본 연구에서는 직경 10, 50, 100 nm 금 입자(GnP10, GnP50, GnP100)의 쥐 독성을 조사하여 포유류 안전성을 규명하고, 간신 독성 물질인 파라콰트(PQ), 널리 쓰이는 항암제 시스플라틴(CDDP), 흔한 항염증제 5-아미노살리실산(5-ASA)과의 병용 시 독성 변화를 살펴보았습니다.

결과 및 고찰

먼저 제타사이저로 금 나노입자 크기를 측정하고 투과전자현미경으로 관찰했습니다(Fig. 1a-c). GnP10, GnP50, GnP100의 평균 직경은 각각 15.7 ± 7.0, 53.3 ± 14.2, 97.0 ± 27.1 nm였습니다(보충 Fig. 1). 전자현미경에서는 금 나노입자가 응집되지만, 쥐에 투여 시에는 응집되지 않았습니다. ICP-MS로 금 이온 농도를 측정했으나 검출되지 않았습니다(데이터 미표시). 금 나노입자 표면은 구연산으로 개질해 물에 대한 친화성을 높였으나, 다른 기능은 없었습니다.

그림 1. 금 나노입자의 초미세 구조. GnP10(a), GnP50(b), GnP100(c) 나노입자의 전자현미경 사진

최대 용량 4 mg/kg을 꼬리 정맥으로 투여해 간독성과 신독성을 검사했습니다. 금 나노입자 단독 투여 시 간독성이나 신독성이 관찰되지 않았습니다(Fig. 2). GnP10, 50, 100 단독 투여군의 ALT, AST 수치는 대조군과 유사했으며, BUN과 Cr 수치도 마찬가지였습니다. 금 나노입자 단독 투여는 간, 신장, 심장, 폐, 비장 손상을 유발하지 않았으며(보충 Fig. 2), 이는 금 나노입자가 쥐에 단독 투여 시 무독성임을 보여줍니다.

그림 2. 금 나노입자가 시스플라틴 유발 독성에 미치는 영향. 쥐에 시스플라틴(CDDP)을 복강 내 주사(0 또는 100 μmol/kg)하고 금 나노입자(4 mg/kg) 또는 차량을 정맥 주사했습니다. 24시간 후 혈청 ALT(a), AST(b), 혈장 BUN(c), Cr(d)을 상용 키트로 측정했습니다. 데이터는 평균 ± 표준오차(SEM; n=4). 유의한 차이(*P<0.05, **P<0.01)는 차량-시스플라틴 처리군 간 비교.

실리카 나노입자, 나노클레이, 폴리스티렌 나노입자가 약물/화학물질과 병용 시 간신 손상을 유발한다는 보고가 있어, 금 나노입자를 PQ(간신 독성 물질), CDDP, 5-ASA(간신 부작용 유발 약물)와 병용 투여했습니다. Fig. 2는 금 나노입자와 CDDP 상호작용 결과입니다. GnP10 또는 GnP50과 CDDP 병용 시 ALT가 증가해 간 손상이 유도되었고(Fig. 2a), GnP10과 CDDP 병용 시 BUN과 Cr이 증가해 신장 손상이 발생했습니다(Fig. 2c, d).

이어 GnP와 5-ASA 상호작용을 조사했습니다. GnP10 또는 GnP50과 CDDP 병용 시 ALT 증가로 간 손상이 유도되었으나(Fig. 3a), 5-ASA 병용 시에는 BUN과 Cr 증가로 신장 손상이 유도되었습니다(Fig. 3c, d). 다음으로 GnP와 PQ 상호작용을 보았습니다. GnP10과 PQ 병용 시 BUN과 Cr 수치 증가로 신장 손상이 발생했으나(Fig. 4c, d), 간 손상은 없었습니다(Fig. 4a, b). 본 연구에서 테스트한 가장 작은 입자인 GnP10을 CDDP, 5-ASA, PQ와 병용했을 때 가장 높은 ALT, BUN, Cr 수치를 보였습니다. 10배 큰 GnP100은 세 약물 모두와 병용 시 간신 손상을 유발하지 않았습니다. 이는 직경 100 nm 미만 GnP가 CDDP, 5-ASA, PQ와 병용 시 독성을 나타냄을 보여줍니다.

그림 3. 금 나노입자가 5-아미노살리실산 유발 독성에 미치는 영향. 쥐에 5-ASA를 복강 내 주사(0 또는 500 mg/kg)하고 금 나노입자(4 mg/kg) 또는 차량을 정맥 주사했습니다. 24시간 후 혈청 ALT(a), AST(b), 혈장 BUN(c), Cr(d) 측정. 데이터는 평균 ± SEM(n=4). 유의한 차이(*P<0.05, **P<0.01)는 차량-5-ASA 처리군 간 비교.

그림 4. 금 나노입자가 파라콰트 유발 독성에 미치는 영향. 쥐에 PQ를 복강 내 주사(0 또는 50 mg/kg)하고 금 나노입자(4 mg/kg) 또는 차량을 정맥 주사했습니다. 24시간 후 혈청 ALT(a), AST(b), 혈장 BUN(c), Cr(d) 측정. 데이터는 평균 ± SEM(n=4). 유의한 차이(*P<0.05, **P<0.01)는 차량-PQ 처리군 간 비교.

GnP10을 CDDP, 5-ASA, PQ와 병용 투여 후 신장 조직을 헤마톡실린-에오신 염색으로 관찰한 결과(Fig. 5), 세뇨관 손상이 확인되어 급성 신장 손상 유발을 시사했습니다. 이어 혈청 IL-6와 TNF-α를 측정해 GnP10 유발 급성 신장 손상의 기전을 탐색했습니다. Fig. 6은 GnP10을 CDDP, 5-ASA, PQ와 병용 투여 3시간 후 혈청 IL-6 수치입니다. GnP10 단독군에서는 IL-6가 검출되지 않았으나, 세 약물과 병용 시 IL-6 증가가 관찰되었습니다. TNF-α는 어떤 군에서도 검출되지 않았습니다(데이터 미표시). 이는 IL-6가 GnP10과 CDDP, 5-ASA, PQ 병용에 의한 급성 신장 손상에 관여함을 시사합니다.

그림 5. 금 나노입자 처리 쥐의 신장 조직 병리 분석. 정맥 투여 24시간 후 GnP10 단독(a), GnP10+CDDP(b), GnP10+5-ASA(c), GnP10+PQ(d) 조직을 수집, 4% 파라포름알데히드 고정, 절편 제작, H&E 염색. 화살표는 신장 손상 부위 표시.

그림 6. ELISA로 측정한 혈청 IL-6 수치. 쥐에 GnP10을 CDDP, 5-ASA, PQ와 정맥 주사하고 3시간 후 사이토카인 측정. 값은 평균 ± 표준오차(SE; n=4).

금 나노입자와 약물 병용이 부작용(간신 손상)에 미치는 영향을 조사했습니다. 가장 작은 입자인 GnP10은 CDDP, 5-ASA, PQ와 병용 시 신장 및 간 손상을 유도했습니다. 반면 GnP10을 아세트아미노펜, 스트렙토마이신, 테트라사이클린과 병용 시 간신 손상이 없었습니다(데이터 미표시). 앞서 실리카 나노입자가 입자 크기에 따라 간 손상을 유도하고, 폴리스티렌 나노입자가 약물과 병용 시 입자 크기 의존적으로 간 손상을 유발할 수 있음을 보고했습니다. Xia 등은 더 작은 금 나노입자가 체외에서 더 강한 유전독성을 보임을 보고했습니다. 종합하면 금 나노입자는 입자 크기가 작아질수록 약물과의 상호작용으로 독성이 강해집니다.

GnP10을 시스플라틴, 5-ASA, PQ와 병용 시 IL-6 수치가 증가했습니다(Fig. 6). GnP10 단독 투여(Fig. 6)나 CDDP, PQ, 5-ASA 단독 투여(데이터 미표시)에서는 IL-6 증가가 없었습니다. IL-6는 간 손상과 급성 신장 손상 유도에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. GnP10이 IL-6를 유도해 간신 손상을 일으키는 것으로 보이나, 세부 기전은 불명확합니다. Bauza 등은 IL-6가 간세포 전사 인자를 유도해 간 손상을 일으킨다고 보고했습니다. 금 나노입자 세포독성 기전에서 IL-6 유도 간신 손상에 관여하는 세포 특이적 전사 인자를 규명하려면 추가 연구가 필요합니다.

최근 금 나노입자는 약물 전달 시스템용 기능성 생체소재로 주목받고 있으며, 암 치료 연구도 활발합니다. Anselmo 등은 PEG 코팅 실리카-금 나노입자가 빛을 흡수해 국소 온도를 높여 고형 종양을 열적으로 용해시킴을 보고해 금 나노입자가 암 치료 유망 소재임을 보였습니다. 그러나 본 연구에서 항암제 시스플라틴과 금 나노입자 상호작용이 신장 손상을 유도함(Fig. 2)을 확인했으므로, 금 나노입자를 암 치료에 활용할 때 약물과의 병용 안전성 연구가 필수적입니다.

결론

요약하면, GnP10은 CDDP, PQ, 5-ASA와 병용 시 신장 손상을 유발했습니다. GnP50은 5-ASA와 병용 시에만 신장 손상을 보였고, GnP100은 그렇지 않았습니다. 금 나노입자가 신장 손상을 일으킬 수 있으며, 이 효과는 화학물질이나 약물과의 상호작용으로 상승적으로 악화될 수 있음을 입증했습니다. 진단 또는 치료용으로 제안된 나노입자의 독성학적 프로파일을 완전히 규명하려면 본 데이터를 기반으로 한 추가 연구가 필요합니다.

재료 및 방법

재료

직경 10, 50, 100 nm 구연산 리간드 캡핑 금 입자 현탁액을 NANOCOMPOSIX, INC.(미국 샌디에이고)에서 구입했습니다. 입자 크기 분포는 제타사이저(Sysmex, 일본 고베)와 TEM JEOL JEM-1011 투과전자현미경으로 분석했습니다. 평균 직경은 각각 15.7 ± 7.0, 53.3 ± 14.2, 87.0 ± 27.1 nm였습니다(Fig. 1, 보충 Fig. 1). 수성 현탁액(1 mg/mL)을 초음파로 충분히 분산시킨 후 물로 희석해 사용했습니다. 금 나노입자 현탁액 내 이온화 금 존재 여부는 ICP-MS로 확인했으나 검출되지 않았습니다. 각 실험마다 동일 부피의 현탁액을 쥐에 주입했습니다. 입자 기하학적 크기는 TEM으로 특성화했습니다. 파라콰트(Sigma-Aldrich, 미국 세인트루이스), 시스플라틴, 5-아미노살리실산(와코 순수 화학, 일본 오사카)을 생리식염수에 녹여 -20°C 보관했습니다. 모든 시약은 연구용 등급입니다.

동물

8주령 BALB/c 수컷 쥐를 후나바시 팜(일본 지바)에서 구입했습니다. 항온 환경(23 ± 1.5°C, 12시간 명암 주기)에서 표준 사료와 물을 자유 섭취하게 했습니다. 실험 전 1주일 순응 기간을 가졌습니다. 실험 프로토콜은 데이쿄 헤이세이 대학 대학원 약학부 윤리 지침(일본 실험동물학회 동물실험 가이드라인 기반)을 준수했습니다.

생화학 분석

혈청 알라닌 아미노전달효소(ALT), 아스파르트산 아미노전달효소(AST), 혈중 요소질소(BUN), 크레아티닌(Cr)은 상용 키트(와코 순수 화학)로 제조사 프로토콜대로 측정했습니다. 간단히, 채취한 혈청(10 mL)에 색소 A 시약(우레아제 함유) 1 mL를 섞고 37°C에서 15분 반응시켰습니다. 색소 B 시약 1 mL를 추가해 37°C에서 10분 더 반응시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정했습니다. 인터루킨(IL)-6와 TNF-α는 ELISA 키트(BioSource International, 미국 캘리포니아)로 제조사 지침대로 분석했습니다. 모든 분석은 제조사 지침을 엄격히 따랐습니다.

조직학적 분석

약물 투여 24시간 후 쥐를 희생시키고 간을 적출해 4% 파라포름알데히드로 고정했습니다. 처리 및 절편 제작 후 헤마톡실린-에오신 염색으로 조직학적 관찰을 수행했습니다.

통계 분석

통계 분석은 Statcel 애드인(제3판 Excel 소프트웨어, EMS 출판, 일본 사이타마)으로 수행했습니다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차(SEM)로 표시했습니다. 대조군과 실험군 간 유의한 차이는 던넷 검정으로 판단했으며, P<0.05를 유의수준으로 삼았습니다.

데이터 및 재료 가용성

해당 없음.

약어

ALT:

알라닌 아미노전달효소

AST:

아스파르트산 아미노전달효소

BUN:

혈중 요소질소

PQ:

파라콰트

Cr:

크레아티닌