이 논문에서 우리는 살아있는 내피 세포와 다기능 나노 입자의 상호 작용에 대해보고합니다. 나노입자는 산화철과 합금된 산화아연 나노입자에 질화갈륨을 직접 성장시킨 후 고온의 수소 흐름에서 코어 분해를 사용하여 합성되었습니다. 투과 전자 현미경을 사용하여 돼지 대동맥 내피 세포가 성장 배지에 부유된 GaN 기반 나노입자를 흡수한다는 것을 보여줍니다. 나노 입자는 소포에 침착되고 내피 세포는 세포 손상의 징후를 보이지 않습니다. 세포 내 불활성 나노 입자는 외부 자기장에서 세포의 제어된 수송 또는 설계된 공간 분포를 위한 안내 요소로 사용됩니다.
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배경
최근 몇 년 동안 나노기술을 사용하여 암 및 관련 질병을 퇴치하기 위한 많은 노력이 수행되었습니다. 가장 일반적인 접근 방식 중 하나는 약물 운반체로 활용될 수 있는 나노입자를 기반으로 하는 것입니다[1, 2]. 그러나 이러한 접근 방식은 약물 흡착 및 공유 결합을 위한 인식 리간드로 나노입자를 코팅해야 하는 필요성과 관련되거나 나노입자 내에 약물을 캡슐화해야 하는 필요성과 관련된 제한이 있습니다. 대안적인 치료 접근법은 직접적인 세포 치료, 즉 질병을 생물학적으로 치료할 목적으로 표적 부위에 나노입자를 활용하는 것입니다[3]. 예를 들어, 자성 나노입자가 적재된 내피 세포는 적용된 자기장에 의해 동맥 손상 부위로 안내될 수 있습니다. 치료적 응용 외에도 나노입자 보조 세포 유도는 시험관 내 세포 분리 및 3차원 구조의 세포 코팅에도 유용할 수 있습니다[4]. 이 논문에서 우리는 내피 세포가 GaN/Fe 기반 나노 입자를 차지하고 이 현상이 시험관 내 세포의 공간 분포를 제어하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.
방법
나노입자 합성
Fe2와 합금된 ZnO 나노입자 위에 GaN의 얇은 층을 성장시켰습니다. O3 두 단계로 HVPE에 의해. 초기에 핵형성층은 600°C에서 5분 동안 증착되었습니다. 이어서, 온도를 800℃로 상승시키고 이 온도에서 10분 동안 유지하였다. ZnO 코어 분해 및 GaN 결정질 품질 향상을 위해서는 두 번째 온도 영역이 필요합니다. GaN 성장은 이전에 우리 그룹에서 자세히 설명했습니다[5, 6]. 간단히 말해서, 우리는 금속 갈륨, 암모니아(NH3 ) 가스, 염화수소(HCl) 가스 및 수소(H2 ) 캐리어 가스로. GaN 성장 과정에서 HCl, NH3 , 및 H2 유속은 각각 20, 600 및 3500sccm였습니다.
세포 배양
돼지 대동맥 내피 세포는 메스로 내피 세포 층을 부드럽게 긁어서 대동맥으로부터 분리하였다. 세포는 37°C, 5% CO2의 표준 인큐베이터에서 배양되었습니다. EGM™-2(내피 성장 인자 배지 2, Lonza). 세포 분할은 TrypLE™Select(1X)(Gibco®)로 수행되었습니다. 모든 실험에 대해 계대 3과 8 사이의 세포가 사용되었습니다. 세포는 다른 곳에서 설명한 대로 렌티바이러스 형질도입에 의해 녹색 형광 단백질(GFP)로 표지되었습니다[7].
XTT 분석
XTT 분석은 나노입자가 보충된 새로운 배지가 추가되었을 때 배지 교체 24시간 후에 시작되었습니다. 그런 다음 배양 배지를 2:1 비율의 XTT 시약이 포함된 새로운 EGM2 배지로 교체했습니다. XTT 시약은 5ml의 XTT에 0.1ml의 전자 커플링 시약으로 구성되어 있습니다. 37°C, 5% CO2에서 4시간 배양 후 , 흡광도는 Paradigm 다중 모드 플레이트 리더에서 측정되었습니다.
셀 카운팅
다른 농도의 나노입자로 세포를 2일 동안 배양한 후, 세포를 4% 파라포름알데히드에 10분 동안 고정하고, PBS로 세척하고, DAPI(PBS에 1:7500 희석)로 10분 동안 염색하였다. 임의의 시야는 형광 현미경(Zeiss)에 설치된 고해상도 카메라로 6개의 독립적인 우물에서 촬영되었습니다. 컴퓨터 지원 소프트웨어 DotCount v1.2[8]는 모든 웰의 상대적인 세포 수를 정량화하고 대조군과 비교하는 데 사용되었습니다.
투과 전자 현미경
투과전자현미경은 세포를 나노입자와 함께 1일 동안 배양한 후 수행하였다. 세포가 50% 합류에 도달한 후, 배양 배지를 50㎍/ml GaN/Fe 나노입자가 보충된 배지로 교체하고 세포를 다른 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 PBS로 세척하고 2% 글루타르알데히드 및 2% 포름알데히드에 실온에서 2시간 동안 고정한 다음 4°C에서 밤새 배양했습니다. 샘플을 0.1M 소듐 카코딜레이트로 세척하고 1% OsO4에 후고정했습니다. 0.1M 나트륨 카코딜레이트에서 1시간 동안. 고정 후, 샘플은 등급이 매겨진 아세톤 시리즈에서 탈수되고 EPON에 포매되었습니다. 중합은 60℃에서 2일 동안 수행하였다. ~ 50 nm 두께의 얇은 섹션을 formvar 코팅 구리 슬롯 그리드에서 수집하고 4% 우라닐 아세테이트 및 시트르산 납으로 염색했습니다. 세포 단면은 200kV의 가속 전압에서 투과형 전자 현미경 FEI Tecnai 20을 사용하여 자세히 조사되었습니다.
결과 및 토론
Fe2와 합금된 ZnO의 희생 나노입자 위에 GaN 층을 성장시켜 다기능 자성 나노입자를 제조했습니다. O3 . 수소화물 기상 에피택시(HVPE)를 사용하여 GaN 층을 성장시킨 후, ZnO 코어가 분해된다. 생성된 화학적으로 안정한 나노입자는 주로 증착된 GaN에서 철 원자의 확산과 Fe2와 합금된 ZnO 박막에 Fe 원자의 존재에 기인하는 자기적 특성을 가진 GaN 쉘로 구성됩니다.> O3 GaN 쉘의 내부 표면. 이러한 나노 입자는 전자 현미경을 사용하여 조사되었습니다. GaN의 HVPE 성장 과정 후에 가로 크기가 20~100nm인 단결정 나노입자는 공간적으로 분리된 상태로 유지됩니다(그림 1). GaN 성장 전후의 나노입자의 X선 회절 및 라만 분광기 특성화 결과(그림 1c, d)는 ZnO 코어의 분해와 GaN 나노입자의 형성을 보여줍니다. 에너지 분산 X선 분석(EDX)을 사용하여 수행된 나노 입자의 화학적 분석은 GaN 층의 성장과 ZnO 코어의 분해를 확인합니다(그림 1e, f). 생성된 재료는 초기 나노입자에 비해 상대적으로 높은(약 50%) Fe 농도를 나타냅니다.
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나노 입자 분석. 아 Fe2와 합금된 ZnO의 희생 나노입자에서 성장된 GaN 나노입자의 SEM 사진 O3 . ㄴ 생성된 GaN/Fe 나노입자의 TEM 이미지. ㄷ 초기 ZnFe2의 XRD 패턴 O4 나노 입자 및 결과 GaN/ZnFe2 O4 나노 입자. d GaN 성장 후 초기 및 결과 나노 입자의 라만 스펙트럼. 이 Fe2와 합금된 ZnO의 EDX 분석 O3 나노 입자. 에 GaN층 성장 후 생성된 나노입자의 EDX 분석
GaN/Fe 기반 나노입자는 1차 돼지 대동맥 내피 세포와 함께 배양되었습니다. 이전에 보인 바와 같이 GaN 나노입자는 100μg/ml 미만의 농도에서 내피 세포에 의해 허용됩니다[5]. 배양 과정 동안 내피 세포는 세포 이동 및 증식을 유지하면서 주변 배양 배지에서 대부분의 나노 입자를 차지합니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 배양 배지에서 나노 입자의 농도가 증가함에 따라 생존 가능한 세포 수가 약간 감소하는 것을 발견했습니다. 이러한 경향은 Fig. 2에 제시된 XTT assay 결과로 확인된다.
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세포 생존에 대한 나노 입자의 영향. 농도 의존적 XTT 감소는 세포를 다양한 농도의 나노입자와 함께 배양한 후 1일 후에 측정되었습니다. XTT 분석의 끝에서 계산된 세포의 수는 처리되지 않은 세포에 상대적으로 표현됩니다. 값은 6번의 반복 실험이 있는 2개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다.
GaN/Fe 나노입자가 세포와 어떻게 상호작용하는지 이해하고 세포 내 위치를 식별하기 위해 투과전자현미경(TEM)을 사용하여 철저한 형태학적 분석을 수행했습니다. 돼지 대동맥 내피 세포를 50μg/ml 나노 입자와 함께 1일 동안 배양한 후 나노 입자는 세포 내부의 소포에 국한된 것으로 나타났습니다(그림 3a). 세포질이나 세포핵에서는 나노입자가 발견되지 않았다. 나노 입자의 흡수 과정은 그림 3b-d에 나와 있습니다. 대부분의 나노입자는 고전적 흡수 경로 중 하나, 즉 미세음세포작용, 클라트린 매개 엔도사이토시스 또는 카베올린 매개 엔도사이토시스를 통해 세포에 흡수됩니다[9]. 내재화 과정은 입자 자체의 물리화학적 특성(예:크기, 모양, 표면 전하)뿐만 아니라 세포 유형 및 국소 세포 환경에 따라 다릅니다. 내피 세포의 경우, 카베올린 매개 엔도사이토시스는 이 세포 유형에 카베올린이 풍부하기 때문에 다른 메커니즘보다 나노입자 흡수에 더 큰 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다[10, 11].
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GaN/Fe 나노입자와 함께 배양된 단일 내피 세포에서 촬영한 TEM 사진. 아 세포 소포 내 나노 입자 분포. ㄴ –d 나노 입자가 소포로 흡수되는 과정. 빨간색 화살표 생물학적 매체에 비해 높은 원자 밀도로 인해 TEM에서 더 어둡게 나타나는 나노입자를 나타냅니다.
앞서 언급한 다량의 Fe 혼입으로 인해 생성된 나노 입자는 GaN 반도체 재료에 고유한 압전성과 함께 강자성을 나타냅니다[12, 13]. 이 두 가지 기본 속성은 나노 입자의 일부 프로세스의 원격 활성화 및/또는 관련 매체의 제어된 안내 및 공간 분포에 사용할 수 있습니다. 압전 특성은 예를 들어 적용된 초음파 장에 의해 GaN 나노입자에서 전기 분극을 유도하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 방식으로 세포에 전기 신호를 전송하여 특정 세포 과정을 활성화하거나 억제할 수 있습니다. Fe 함량에 의해 부여되는 자기적 특성은 동적 시각화에 도달하고 세포의 공간적 위치를 제어할 수 있습니다. 후자의 가능성을 실험적으로 입증하기 위해 내피 세포를 50μg/ml의 GaN/Fe 나노입자가 보충된 EGM™-2 배지에서 3일 동안(70-80% 세포 합류까지) 배양했습니다. 이어서, 세포를 표면에서 분리하고 EGM™-2에 재현탁시켰다. TrypLE™ Select 및 원심분리를 사용한 세포 분리는 세포 생존율에 영향을 미치지 않았으며 세포에서 나노입자가 방출되지도 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 파종 직후, 세포를 37°C, 5% CO2의 표준 인큐베이터에서 배양했습니다. , 배양 플레이트가 영구 자석에 놓였습니다. 도 4는 자기장의 존재 및 부재하에 나노입자를 함유한 내피 세포의 분포를 나타낸다. 도 4a는 자기장이 없는 상태에서 배양된 나노입자를 함유한 세포를 도시한 반면, 도 4b에서 나노입자가 없는 내피 세포는 자기장에서 배양된다. 이 그림은 두 경우 모두에서 세포의 무작위 분포를 보여줍니다. 자기장 구배에서 나노입자가 실린 세포의 배양은 자기장 지도에 따라 특정 영역에서 미리 설계된 세포 분포로 이어집니다. 그림 4c는 직경이 5mm이고 두께가 1mm인 7개의 희토류 네오디뮴 원형 자석에 의해 생성된 자기장에서 배양 1일 후 배양 플레이트의 세포를 보여줍니다. 그림 4d는 직경 7mm, 두께 1mm의 단일 고리 모양 자석에 의해 생성된 자기장에서 배양 후 세포 분포를 보여줍니다. 두 경우 모두 자석을 배양 접시 아래에 배치했습니다.
<그림>
자기장을 이용한 나노입자 함유 내피세포 유도 대조군은 a의 공간 분포를 보여줍니다. 나노입자로 표적화되고 자기장이 없는 상태에서 배양된 내피 세포 및 b 자기장에서 배양된 나노입자가 없는 내피 세포. ㄷ , d 자기장에서 1일 배양 후 나노입자를 표적으로 하는 내피세포의 분포
결론
우리는 자기 특성을 나타내는 GaN/Fe 기반 나노입자가 내피 세포에 의해 흡수되어 소포 내에 저장된다는 것을 처음으로 입증했습니다. GaN/Fe 나노입자를 함유한 내피 세포는 적용된 자기장을 사용하여 제어된 방식으로 유도될 수 있습니다. 이러한 결과는 시험관 내에서 3차원 조직을 조작하거나 생체 내에서 조직 손상 부위로 세포를 표적화하기 위한 새로운 가능성을 열어줍니다. 이와 함께 고유한 압전 특성을 갖는 GaN 나노 입자의 세포 존재는 세포 생물학적 과정의 원격 전기 자극을 위한 길을 열어줍니다. 이 유망한 접근 방식은 우리 연구실에서 조사 중입니다.
