생분해성 다공성 생체 재료 지지체는 뼈 재생에 중요한 역할을 합니다. 본 연구에서는 GO의 함량이 다른 다공성 나노수산화인회석/콜라겐/폴리(락트산-코-글리콜산)/그래핀옥사이드(nHAC/PLGA/GO) 복합 지지체를 동결건조법으로 제작하였다. 결과는 합성 스캐폴드가 3차원 다공성 구조를 가지고 있음을 보여줍니다. GO는 지지체의 친수성을 약간 향상시키고 기계적 강도를 강화합니다. 1.5wt% GO가 포함된 스캐폴드의 영률은 대조 샘플에 비해 크게 증가했습니다. 시험관 내 실험은 nHAC/PLGA/GO(1.5wt%) 스캐폴드가 조골 세포(MC3T3-E1)의 세포 부착 및 증식을 유의하게 함을 보여줍니다. 본 연구는 nHAC/PLGA/GO 스캐폴드가 우수한 세포적합성 및 골 재생 능력을 갖고 있어 골조직 공학 분야에서 스캐폴드로 사용될 가능성이 높다는 것을 나타낸다.
<섹션 데이터-제목="배경">3차원 다공성 지지체와 뼈 세포를 결합한 뼈 조직 공학은 오작동하거나 손실된 조직의 치료에서 매력적인 접근 방식으로 널리 연구되었습니다[1]. 뼈의 성질을 모방한 생분해성 지지체는 세포를 수용하고 세포의 부착과 증식을 조절하며 뼈의 재생을 촉진하는 중요한 역할을 합니다[2]. 지금까지 전기방사, CTD(Computational Topology Design) 및 SFF(Solid Free-Form Fabrication)의 통합, 동결건조를 포함한 다양한 방법을 적용하여 다양한 3차원(3D) 다공성 구조를 제작했습니다[3,4,5 ,6,7]. 전기방사는 복잡한 구조(정렬된 스프링 같은 섬유)와 구성을 가진 나노섬유 또는 미세섬유 스캐폴드를 만들 수 있습니다[7]. 그러나 생산 효율은 다소 낮습니다. CTD와 SFF의 통합으로 다공성 구조와 더 나은 기계적 특성을 가진 3D 해부학적 지지체를 설계할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 강력한 전문 지식이 필요합니다[4]. 이 두 방법에 비해 동결건조법은 동결된 액체상을 진공하에서 승화시켜 다공성 구조를 제작함으로써 훨씬 간단한 공정으로 다공성 구조를 제작할 수 있다[8].
자연 뼈는 콜라겐과 수산화인회석이라는 두 가지 주요 구성 요소로 구성된 복잡한 계층 구조를 가지고 있습니다[9,10,11]. 골 조직 공학에서 기능 장애 치료를 위한 세포 부착 및 증식을 수용하는 골 세포외 기질의 이상적인 생체 모방을 제작하는 것은 여전히 어려운 과제입니다[12]. 천연 뼈를 모방한 nHAC(Nano-hydroxyapatite/collagen) 기반 생분해성 지지체는 더 나은 생체 적합성, 세포 친화성 및 생체 흡수성을 제공할 수 있습니다[13]. 그러나 열악한 기계적 특성과 빠른 분해 특성을 포함한 콜라겐의 단점은 뼈 조직 공학에 적용하는 데 여전히 걸림돌로 남아 있습니다[14]. 높은 기계적 강도, 뛰어난 생체적합성, 생분해성 및 유기 용매에 대한 용해도가 우수한 PLGA(poly(lactic-co-glycolic) acid)와 같은 생분해성 지방족 고분자는 뼈 조직 공학을 위한 3D 다공성 지지체를 구성하는 이상적인 보상 재료입니다[15 , 16]. 콜라겐과 합성고분자를 함유한 하이브리드 다공성 지지체는 콜라겐과 고분자의 장점을 결합하고 단점을 보완하여 골 수복 및 재생에 널리 사용된다[17,18,19]. 예를 들어, Liao et al. 그들은 뼈 재생을 촉진하기 위해 nHAC와 poly(lactic acid)(PLA)에 의해 준비된 뼈 지지체를 개발했습니다[17]. Niu et al. 조골세포 증식을 향상시키기 위해 nHAC/폴리(L-락트산)/키토산 미소구체 복합 지지체를 제작했습니다[19].
최근 1원자 두께의 새로운 탄소 시트인 산화 그래핀(GO)이 우수한 생체적합성을 가지고 있어 생물학 분야에서 큰 관심을 받고 있다. GO 하이브리드 스캐폴드는 스캐폴드의 기계적 특성과 세포 확산 및 증식과 같은 세포 행동을 모두 풍부하게 할 수 있습니다[22, 23]. Luo et al. 는 PLGA 나노섬유에 GO를 도입하면 중간엽 줄기세포(MSC)의 증식 및 골형성 분화가 향상된다고 보고했습니다[20]. Jing et al. 는 열가소성 폴리우레탄에 1.0wt% GO를 추가하면 스위스 마우스 섬유아세포 세포 증식을 촉진할 수 있다고 보고했습니다[24]. 화학적 가교제(제니핀, 글루타르알데히드, 카르보디이미드 등. ) [25, 26] 특정 세포 독성을 갖는 복합 지지체의 기계적 특성을 개선하기 위해 소량의 GO 혼성화 지지체가 우수한 생체 적합성을 나타냅니다. 따라서 GO와 nHAC/PLGA의 혼성화는 뼈 조직을 위한 새로운 인공 스캐폴드가 될 수 있습니다.
이 연구에서 다공성 나노-하이드록시아파타이트/콜라겐/폴리(락트산-코-글리콜산)/그래핀 옥사이드(nHAC/PLGA/GO) 지지체는 GO(0.0, 0.5, 1.0, 1.5wt)의 다른 중량비를 포함합니다. %)는 조작되고 특성화되었습니다. 하이브리드화 스캐폴드는 다공성 구조를 보여줍니다. GO의 추가는 혼성화 스캐폴드의 친수성 및 기계적 특성을 수정합니다. 뼈 조직 공학에 대한 nHAC/PLGA/GO 스캐폴드의 효과를 조사하기 위해 MC3T3-E1 세포를 다공성 혼성화 스캐폴드에서 배양했습니다. 결과는 1.5wt% GO 도핑된 혼성화 스캐폴드가 세포 접착, 성장 및 증식을 촉진하여 nHAC/PLGA/GO 스캐폴드가 뼈 조직 공학에서 유망한 후보로 간주될 수 있음을 나타냅니다.
그림 1은 nHAC/PLGA/GO 스캐폴드의 제작 과정을 보여줍니다. 제작 과정의 세부 사항은 실험 섹션에 나와 있습니다. nHAC/PLGA/GO 복합 지지체를 제작하기 전에 nHAC를 합성했습니다. nHAC 분말의 주사전자현미경(SEM) 이미지는 나노구조를 보여줍니다. nHAC의 해당 에너지 분산 X선 분광법(EDS) 스펙트럼도 표시되어 있으며(추가 파일 1:그림 S1) Ca, Cu, P, C 및 O의 존재를 나타냅니다. 구리 신호는 지원 샘플. 따라서 nHAC는 Ca, P, C, O로 구성되며 nHAC 분말의 Ca:P 몰비는 1.41로 수산화인회석(HA)(1.66)보다 낮다. 이것은 합성된 HA가 칼슘 결핍 유형[27]이며, 이는 nHAC의 경도, 탄성 계수 및 인성의 감소로 이어질 것임을 나타냅니다. 복합 지지체의 기계적 특성을 증가시키기 위해 PLGA와 GO를 nHAC 분말에 추가했습니다. GO의 양이 다른 제작된 nHAC/PLGA/GO 스캐폴드의 광학적 개요는 그림 2a에 나와 있습니다. 샘플은 직경이 14mm인 실린더입니다. GO가 없는 합성 지지체는 흰색임이 분명합니다. GO가 증가함에 따라 복합 지지체는 점점 더 어두워집니다. 다양한 nHAC/PLGA/GO 스캐폴드의 상세한 형태는 SEM에 의해 드러납니다(그림 2b-e). 모든 스캐폴드가 다공성 구조를 형성하고 4가지 다른 스캐폴드의 표면이 상당히 거칠다는 것을 유의미하게 보여줍니다. 이러한 구멍의 정보를 특성화하기 위해 자동 표면적 및 다공성 테스터를 사용하여 평가했습니다. 구멍 분포의 결과는 그림 2f에 나와 있습니다. 4개의 스캐폴드 구멍 크기는 0~200nm입니다. 그리고 4개의 지지체에 수십 나노미터의 구멍이 수백 나노미터의 구멍보다 많습니다. 생체 재료 지지체의 다공성은 시험관 내 및 생체 내에서 뼈 형성에 중요하지 않은 것으로 보고되었습니다[28]. 주변 조직으로의 통합을 최적화하기 위해 골형성을 위한 스캐폴드는 뼈의 형태, 구조 및 기능을 모방해야 합니다[4]. 따라서 nHAC/PLGA/GO 복합 지지체의 3D 다공성 구조는 뼈 재생에 중요합니다. 4개의 합성 스캐폴드의 대규모 SEM 이미지도 표시되며(추가 파일 1:그림 S2) 다양한 표면의 개요 구조를 보여줍니다.
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nHAC/PLGA/GO 스캐폴드 제조 공정의 개략도
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아 GO의 양이 다른 합성된 nHAC/PLGA/GO 스캐폴드의 광학 이미지. ㄴ –이 b의 SEM 이미지 nHAC/PLGA, c nHAC/PLGA/GO(0.5중량%), d nHAC/PLGA/GO(1.0중량%) 및 e nHAC/PLGA/GO(1.5wt%) 스캐폴드. 에 nHAC/PLGA/GO의 구멍 분포(0, 0.5, 1.0, 1.5wt%)
합성 과정의 메커니즘은 다양한 단일 물질 및 복합 재료의 X선 회절(XRD) 및 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR) 스펙트럼에 의해 밝혀질 수 있습니다(그림 3). 그림 3a에 표시된 것처럼 무기상은 XRD 패턴에 다른 Ca-P 물질의 피크가 없었기 때문에 분말 회절 파일(PDF 카드 번호 09-0432)에 따라 HA로 결정되었습니다. nHA와 비교하여 nHAC의 넓은 회절 피크는 작은 입자 크기와 낮은 결정성을 의미합니다. nHAC와 유사하게, GO의 양이 다른 nHAC/PLGA/GO의 패턴도 낮은 결정성을 가졌다. 그러나 nHAC/PLGA/GO 복합 재료에서는 GO의 피크가 나타나지 않았으며, 이는 벌크에 비해 GO의 양이 적기 때문일 수 있습니다. 그림 3b는 다양한 단일 물질 및 복합물의 FT-IR 스펙트럼을 보여줍니다. 그림 3b에서 3336cm −1 에서 N-H 스트레칭과 같은 콜라겐의 일반적인 밴드를 관찰할 수 있습니다. 아미드 A의 경우; 3079cm −1 에서 C–H 스트레칭 아미드 B의 경우; C=O 1656cm에서 스트레칭 −1 아미드 I의 경우; 1548cm −1 에서 N–H 변형 1238cm −1 에서 아미드 II 및 흡수 피크의 경우 아미드 III의 경우. nHAC가 형성됨에 따라 아미드 A는 3336cm −1 에서 이동합니다. 약 3411cm −1 까지 , 아미드 B는 약화되었고, 아미드 I, 아미드 II, 아미드 III는 1656, 1548 및 1238cm -1 에서 이동했습니다. ~ 1654, 1542, 1240cm −1 , 각각. 따라서 콜라겐과 HA의 화학 반응을 확인합니다. 또한 1033, 601, 563cm의 피크 −1 (PO4) 3− 의 일반적인 피크입니다. 그룹은 (PO4) 3- 의 특징적인 피크만을 갖는 상품화된 HA로 인해 콜라겐에 HA가 새로 형성되었음을 나타냅니다. 1033, 603, 565cm −1 에서 . 2996 및 2944cm −1 부근에서 특성화된 PLGA 피크 -CH2에 할당되었습니다. , 1752cm −1 C=O, 1183 및 1093cm −1 에 할당되었습니다. C-O에 할당되어 명확하게 보입니다. PLGA 스캐폴드와 비교하여 nHAC/PLGA 스캐폴드의 피크는 1752 및 1183cm −1 에서 이동합니다. ~ 1760 및 1187cm −1 , 각각 PLGA와 nHAC 전력 사이의 화학 반응을 보여줍니다. nHAC/PLGA 스캐폴드와 비교하여 GO 도핑된 nHAC/PLGA 스캐폴드의 피크는 1760에서 1762cm로 이동했습니다. −1 ; GO와 nHAC/PLGA 사이의 화학 반응을 나타내는 적색 이동이 발생했습니다.
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아 XRD 및 b 다양한 구성요소의 FT-IR 스펙트럼
GO 양이 다른 nHAC/PLGA/GO 지지체의 나노구조 및 기계적 특성은 정량적 나노기계적 원자력 현미경(QNM-AFM)[29,30,31,32,33,34]으로 특성화되었으며, 형태와 강성을 자발적으로 제공하며 뼈[30], 치아[35], 각막[36] 등 다양한 재료의 기계적 특성을 감지하는 데 널리 사용됩니다. 그림 4a-d는 4가지 종류의 복합 재료의 단층 촬영을 보여줍니다. 비계. 스캐닝 영역의 제한으로 인해 AFM 이미지는 국부적 표면 구조만 보여줍니다. 따라서 다공성 구조가 명확하지 않습니다. 그러나 AFM 이미지는 SEM 이미지와 유사한 거친 표면 형태를 보여줍니다. 거칠기는 세포 증식과 분화에 중요한 영향을 미칩니다. 거친 표면을 가진 표면은 세포 증식과 분화에 유리했습니다[37,38,39]. 형태(그림 4a-d)에서 파생된 선 프로파일(그림 4e-h)은 다른 선 방향 단독으로 최대 높이 차이를 보여줍니다. 최대 높이 차이가 ~ 200에서 ~ 600nm 범위임을 분명히 알 수 있습니다. 해당 강성 분포(그림 4i)는 4개의 서로 다른 스캐폴드의 영률이 각각 7.53 ± 1.25, 8.34 ± 1.00, 9.15 ± 0.85 및 10.20 ± 1.28GP임을 보여줍니다. 강성 차이를 명확하게 표시하기 위해 해당 막대 차트도 제공됩니다(그림 4j). 약간의 GO 양 차이가 있는 nHAC/PLGA/GO 스캐폴드의 영률은 크게 다르지 않지만, 예를 들어 GO 양이 0.0 및 0.5wt%인 nHAC/PLGA/GO(7.53 ± 1.25 및 8.34 0±0 1. GPa), 0.5 및 1.0wt%(8.34 ± 1.00 및 9.15 ± 0.85GPa), 1.0 및 1.5wt%(9.15 ± 0.85 및 10.20 의 계수를 가진 PLHA/GPa/GO) 약간 큰 GO 양 차이(0.0 wt% 및 1.5 wt%)가 크게 다릅니다(7.53 ± 1.25 및 10.20 ± 1.28 GPa). 이는 nHAC/PLGA/GO 지지체의 기계적 성질이 GO 양이 증가함에 따라 증가함을 나타냅니다.
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a의 AFM 이미지 nHAC/PLGA, b nHAC/PLGA/GO(0.5중량%), c nHAC/PLGA/GO(1.0중량%) 및 d nHAC/PLGA/GO(1.5wt%) 스캐폴드. 이 –h 모폴로지 이미지에서 파생된 라인 프로파일. 나 QNM-AFM으로 측정한 4개의 다른 스캐폴드의 강성 분포. j 영률 대 GO 양의 막대 차트. 케이 sessile drop 방법으로 측정한 4가지 종류의 지지체의 해당 접촉각
스캐폴드의 친수성은 세포와 상호작용하는 데 중요한 역할을 합니다. GO의 첨가는 복합 지지체의 기계적 성질을 증가시킬 뿐만 아니라 4가지 종류의 지지체의 소수성을 변화시킨다. 그림 4f는 다양한 nHAC/PLGA/GO 스캐폴드의 접촉각을 보여줍니다. nHAC/PLGA 지지체의 접촉각은 ~ 125.1°인 반면, nHAC/PLGA/GO의 경우 GO 양(0.5.1.0 및 1.5wt%)이 다른 경우 각각 ~ 113.4°, ~ 103.4°, .4°, .4°1입니다. GO 양이 증가함에 따라 복합 지지체의 접촉각은 수산기와 GO 표면의 카르복실산기와 같은 음으로 하전된 기 모두로 인해 약간 감소합니다[40]. 따라서 GO는 3D nHAC/PLGA 스캐폴드에 놀라운 생리활성을 제공할 수 있습니다.
일반적으로 조직공학용 스캐폴드는 생체적합성의 형태와 특성을 나타낼 뿐만 아니라 다공성 구조와 물리적 강도도 요구한다[41]. 동결 건조된 3D nHAC/PLGA/GO 지지체는 용매의 승화로 인해 다공성 구조를 가지고 있습니다. 스캐폴드 표면의 하이드록실(OH), 에폭시(C-O-C), 카르복실(COOH) 종을 포함하는 작용기는 [40] 좋은 친수성을 유도합니다. PLGA와 GO를 첨가하여 충분한 물리적 강도를 제공합니다. 따라서 3D nHAC/PLGA/GO 스캐폴드는 조직 공학의 유망한 후보가 될 수 있습니다.
뼈 조직에 사용되는 스캐폴드는 생체 적합성, 세포 증식성, 면역 반응 배타적이어야 한다는 것은 잘 알려져 있습니다[21]. nHAC/PLGA/GO는 천연 뼈의 성분(콜라겐 및 HA)을 함유하고 적절한 기계적 특성과 친수성을 보유하고 있어 뼈 조직 공학에 이상적인 후보가 되어야 합니다. 이 스캐폴드의 세포 증식을 조사하기 위해 이 작업에서 MC3T3-E1 조골 세포를 배양했습니다. 그림 5는 세포 계수 키트-8(CCK-8) 분석으로 평가한 세포 생존력 대 배양 시간을 보여줍니다. 세포의 증식은 모든 그룹에서 전체 배양 기간 동안 지속적으로 증가했습니다. 보다 구체적으로, nHAC/PLGA/GO(0.5 및 1.0wt%) 스캐폴드에서 MC3T3-E1의 세포 증식은 1일째에 상당히 감소한 반면, nHAC/PLGA/GO(1.5wt%) 스캐폴드에서와 유사합니다. nHAC/PLGA 스캐폴드. 시간이 증가함에 따라 nHAC/PLGA/GO(1.5wt%) 스캐폴드에서 MC3T3-E1의 세포 증식은 3일, 5일 및 7일에 상당히 증가했습니다. 그러나 nHAC/PLGA/GO에서 MC3T3-E1의 세포 증식 (0.5 및 1.0wt%) 스캐폴드는 nHAC/PLGA 스캐폴드와 크게 다르지 않습니다.
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다른 스캐폴드 표면에서 MC3T3-E1 세포의 비교; 이중 별표는 p를 나타냅니다. <0.01, 샘플 수 N =4
세포 성장의 증거, 다른 스캐폴드에서의 증식도 SEM에 의해 포착되었습니다. 그림 6은 각각 1일, 3일, 5일, 7일 동안 배양한 후 4개의 다른 스캐폴드에서 조골 세포의 표면 형태를 보여줍니다. 1일째에 모든 세포가 고르게 분리되고 4개의 다른 스캐폴드에 분산됩니다. 시간이 지남에 따라(3일, 5일, 7일) 모든 세포 그룹이 성장하고 증식하며 다른 스캐폴드에 통합되기 시작하여 큰 세포층을 형성합니다. 다른 스캐폴드의 세포 형태와 비교하여 nHAC/PLGA/GO 스캐폴드 표면의 세포는 nHAC/PLGA 스캐폴드 표면의 세포보다 훨씬 크고 늘어납니다. nHAC/PLGA/GO 상에서는 세포의 퍼짐, 부착 정도가 SEM 이미지에 따라 다른 양(0.5, 1.0, 1.5wt%)의 상황에서 큰 차이가 없습니다.
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아 –p 1, 3, 5, 7일 동안 4개의 다른 스캐폴드에서 배양된 MC3T3-E1 세포의 SEM 이미지. 눈금 막대는 모든 이미지에서 50μm입니다. 흰색 별표는 MC3T3-E1 조골 세포를 나타냅니다.
GO의 세포독성은 생물학 분야에 적용하기 위해 필수적인 관심사입니다. 그래서 우리는 24시간 동안 4개의 스캐폴드의 세포독성을 평가합니다. 결과는 그림 7에 나와 있습니다. nHAC/PLGA에서 섬유아세포(NIH-3T3)의 세포 활력은 0.5,1, 1.5% GO는 99,101.11, 97.86%는 nHAC/PLGA와 관련이 있으며 유의한 차이가 없습니다. nHAC/PLGA보다 그래핀 옥사이드의 증가가 0~1.5%에서 안전함을 나타냅니다.
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nHAC/PLGA(0.5, 1, 1.5wt%)에서 HIH-373 세포의 상대적 활성은 nHAC/PLGA와 관련됨
표 1은 4가지 복합 지지체의 기계적 특성과 세포 배양 특성을 요약한 것이다. GO가 증가함에 따라 비계의 영률도 그에 따라 증가합니다. 그러나 nHAC/PLGA 및 nHAC/PLGA/GO(1.5wt%)의 기계적 특성만 분명히 다릅니다. 4가지 종류의 지지체의 세포 생존율은 기계적 특성과 동일한 경향을 나타냅니다. 즉, 모든 그룹의 OD 값은 세포 배양 시간이 증가함에 따라 증가하지만 nHAC/PLGA 및 nHAC/PLGA/GO(1.5wt %) 그룹은 상당한 차이를 보여줍니다. 이는 지지체의 기계적 특성이 세포 배양 특성과 밀접한 관련이 있음을 나타냅니다. 결과는 조직 세포가 기질의 강성을 느끼고 반응할 수 있기 때문일 수 있습니다[42,43,44,45]. 기질의 기계적 특성을 조정하면 세포 성장 및 생존과 함께 세포 표면 상호 작용에 영향을 미치는 세포 반응을 촉진할 수 있습니다[46,47,48,49]. Haugh et al. 스캐폴드의 강성이 MC3T3-E1 세포의 활성(세포 증식 및 이동)을 향상시킨다는 것을 발견했습니다[50]. Engler et al. 많은 세포 유형의 반응에서 중요한 물리적 요인은 기질 강성임이 입증되었습니다[51]. 그들은 평활근 세포가 다른 고정 의존 세포와 마찬가지로 쥐 대동맥(A7R5 계통)에서 유래하고 '부드러운' 기질보다 '뻣뻣한' 기질에서 더 많이 퍼지고 세포골격과 국소 유착을 훨씬 더 조직한다는 것을 발견했습니다. 기계적 성질은 세포의 행동뿐만 아니라 조직의 활동에도 영향을 미칩니다. Duncan et al. 기계적 변형과 뼈에 대한 기능적 반응의 기계적 변형을 연구했습니다. 그들은 기계적 부하가 뼈 흡수를 억제하고 생체 내에서 뼈 형성을 증가시킬 수 있음을 발견했습니다[52]. 따라서 가장 단단한 nHAC/PLGA/GO(1.5wt%) 스캐폴드는 MC3T3-E1 세포의 증식을 촉진할 수 있습니다.
GO의 세포독성은 생물학 분야에서의 적용에 있어 필수적인 관심사입니다. 지금까지 두 가지 주장이 제기되었습니다. 한 주장은 GO가 세포독성을 유발할 것이며 그 효과는 농도 의존적이라고 주장합니다. 예를 들어, Chatterjee, et al. GO에 대한 차등 용량 의존성과 함께 독성 반응을 보고했습니다[53]. Pinto, et al. 낮은 농도의 GO만이 PLA에 안전하게 통합되어 세포 접착 및 증식을 촉진할 수 있다고 보고했습니다[6]. 다른 사람들은 더 많은 양의 GO가 우수한 생체적합성을 가지며 기질의 기계적 특성과 세포 거동을 모두 향상시킬 것이라고 말합니다. Shin, et al. C2C12 골격 근아세포가 PLGA, PLGA 콜라겐 매트릭스보다 PLGA-GO 콜라겐 하이브리드 매트릭스에서 강화되었음을 연구했습니다[54]. 및 Luo, et al. GO가 도핑된 PLGA 나노섬유 스캐폴드는 MSC의 골형성 분화를 향상시킬 수 있다고 보고했습니다[22]. 본 연구에서는 첫 번째 주장을 바탕으로 GO를 선택하였다. 제한된 양은 비 세포 독성 및 향상된 기계적 특성을 위해 복합 지지체에 추가됩니다. nHAC/PLGA 스캐폴드에 GO의 접합은 세포 성장, 증식을 상당히 향상시켰습니다. 소량의 GO(예:nHAC/PLGA/GO(0.5wt%))가 있는 nHAC/PLGA 및 nHAC/PLGA의 세포 수는 다소 동일하지만 nHAC/PLGA/GO의 세포 수 (1.5wt%) 스캐폴드는 nHAC/PLGA 스캐폴드보다 높았습니다. 이러한 결과는 nHAC/PLGA/GO 스캐폴드가 MC3T3-E1 세포의 성장 및 증식을 향상시키는 능력과 함께 생체 기능적임을 나타냅니다. 따라서 nHAC/PLGA/GO는 우수한 생체 적합성과 생체 기능을 통해 뼈 재생을 위한 효과적인 스캐폴드로 사용할 수 있습니다.
생체 재료의 특성과 제조 공정은 지지체 특성에 매우 중요합니다[28]. 지금까지 생체 재료는 금속[55], 세라믹[56], 유리[57], 화학적 합성 고분자[58], 천연 고분자[59] 및 복합 재료를 형성하기 위한 이들 재료의 조합[60]을 포함하여 광범위하게 연구되었습니다. . 복합 스캐폴드의 구성 요소를 변경하면 스캐폴드 속성이 유도됩니다. 예를 들어, 자연 뼈의 생체 모방 지지체를 제작하기 위해 이 연구에서는 유형 I 콜라겐이 사용되었습니다. 현재 콜라겐 패밀리는 피부, 뼈, 연골 등에 존재하는 20가지 이상의 서로 다른 유형의 콜라겐을 포함합니다. 유형 I 콜라겐을 다른 유형으로 대체하면 다른 목적에 따라 다른 복합 지지체를 제작할 수 있습니다. 예를 들어, 콜라겐 유형 II는 섬유소 형성 콜라겐 중 하나이며 연골에서 우세한 유형의 콜라겐입니다. 콜라겐 유형 II를 지지체로 조정하면 연골 뼈 재생을 촉진할 수 있습니다[61]. 또한 적절한 어닐링을 한 콜라겐은 스캐폴드를 더욱 강화시켜 기능적 구조의 새로운 복합 재료를 유도할 수 있습니다. 생체 재료의 특성 외에도 처리는 다양한 처리 방법과 같은 스캐폴드의 기능을 결정합니다. 재료 화학 및 처리는 세포가 스캐폴드와 상호 작용하는 방식뿐만 아니라 최대 기능 특성을 결정합니다. 뼈 조직 공학의 특성 및 요구 사항에 대한 스캐폴드는 분해[62], 기계적 특성[63], 사이토카인 전달[64], 스캐폴드와 세포의 조합[65]을 포함하여 광범위하게 조사되었습니다.
요약하면, GO의 양이 다른 nHAC/PLGA/GO 지지체(0.0, 0.5, 1.0, 1.5wt%)는 동결 건조 방법으로 제작되었습니다. 제작된 nHAC/PLGA/GO 스캐폴드는 다공성 구조를 보여줍니다. 또한, PLGA와 GO의 첨가로 지지체의 기계적 물성과 친수성이 향상되었습니다. 시험관 내 연구는 다공성 스캐폴드가 세포 흡착, 성장 및 증식을 촉진한다는 것을 보여줍니다. 이러한 nHAC/PLGA/GO 스캐폴드는 뼈 조직 적용을 위한 유망한 후보가 될 수 있습니다.
정제된 동결 건조된 유형 1 콜라겐은 Tianjin Saining Biological Engineering Technology Co., Ltd. PLGA에서 락티드:글리콜라이드 비율이 75:25이고 Mw가 95,000g/mol인 Shandong Medical Appliance Factory(중국)에서 구입했습니다. GO는 Shanghai Aladdin 생화학 Polytron Technologies Inc.에서 구입했습니다. MC3T3-E1 조골 세포는 Shanghai Chinese Academy of Sciences의 세포 은행에서 제공했습니다. 소태아혈청(FBS), 항생제-항진균제, CCK-8 및 둘베코 변형 독수리 배지(DMEM)는 Tianjin Nobuo Letter Technology Co., Ltd.에서 액세스했습니다. 1,4-디옥산, 인산염 완충 식염수(PBS, 0.1M, PH 7.4) 및 기타 모든 화학 물질은 분석 등급이었고 추가 정제 없이 받은 그대로 사용되었습니다.
nHAC 분말을 합성하는 방법은 이전에 보고된 바 있다[66,67,68]. 간단히 말해서, 콜라겐은 아세트산(0.5mol/L)에 용해되어 농도가 4g/L인 용액을 형성했습니다. CaCl2 및 H3 PO4 (Ca/P =1.66) 용액을 별도로 한 방울씩 첨가하였다. 낙하 속도는 분당 100방울입니다. 용액을 부드럽게 교반하고 암모니아 용액을 사용하여 pH 9로 37°C에서 적정했습니다. 24시간 후, nHAC 침전물을 원심분리 및 동결 건조에 의해 수확했습니다. nHAC/PLGA/GO 복합 지지체 제조를 위해 초음파 셀 크러셔를 사용하여 GO를 다이옥산에 고르게 분산시켜 최종 농도가 각각 0.0, 0.5, 1.0, 1.5 g/L이 되도록 하였다. 그런 다음 PLGA를 GO 용액에 첨가하여 10%(m/v)의 최종 농도를 형성했습니다. 그런 다음 GO/PLGA 용액을 실온에서 12시간 동안 부드럽게 교반했습니다. 최종 용액은 nHAC 전력을 1:1 nHAC:PLGA 중량비로 GO/PLGA 용액에 추가하여 형성되었습니다. 그런 다음 형성된 nHAC/PLGA/GO 용액을 교반하고 4시간 동안 초음파 처리했습니다. - 20°C에서 밤새 동결한 후, nHAC/PLGA/GO 복합 지지체를 동결건조하여 다이옥산을 제거하여 얻었다.
복합 지지체를 금으로 코팅하고 SEM(JSM-7100F)으로 관찰하였다. 전자 현미경 샘플을 준비하기 위해 20분 동안 금을 뿌립니다. 매트릭스의 지형과 기계적 특성은 공기 중에서 원자력 현미경(AFM, Multimode VIII, Bruker, Germany)으로 특성화되었습니다. 이미지 분석은 Gwyddion 및 Nanoscope Analysis Software를 사용하여 수행되었습니다. nHAC/PLGA/GO 복합 지지체의 조성 분석은 FT-IR 분광 광도계(VECTOR22, Bruker, Germany)로 수행되었습니다. 모든 스펙트럼은 1000–2200cm −1 파장 범위의 흡수 모드로 기록되었습니다. 해상도 4.0cm −1 및 16회 스캐닝. 시료의 접촉각은 sessile drop method(EasyDrop, model DAS30, kruss, Germany)에 의한 접촉각 측정 시스템을 사용하여 측정하였다. XRD 패턴은 X선 회절계(D8 DISCOVER)를 사용하여 측정되었습니다. Cu-Kα 방사선(λ =0.154nm)은 40kV 및 30mA입니다. 측정의 스캔 속도는 8°min −1 입니다. RT에서 5–80°의 2θ 범위 이상. 지지체의 다공성은 자동 표면적 및 다공성 분석기(ASAP 2460, Micromeritics, GA, USA)로 측정되었습니다.
MC3T3-E1 조골 세포를 37°C 및 5% CO2에서 10% FBS 및 3% 항생제-항진균 용액이 보충된 DMEM에서 배양했습니다. 세포 배양기에서. 초기 부착 및 증식은 제조사의 지침에 따라 CCK-8을 사용하여 테스트되었으며, 생존 세포의 수는 CCK-8 분석에서 얻은 대사 반응 산물에 정비례했습니다[69]. 간단히 말해서, MC3T3-E1 조골 세포는 2.5 × 10 4 의 밀도로 시딩되었습니다. 48웰 세포 배양에 포함된 nHAC/PLGA, nHAC/PLGA/GO(0.5wt%), nHAC/PLGA/GO(1.0wt%) 및 nHAC/PLGA/GO(1.5wt%) 매트릭스의 웰당 세포 그릇. 세포는 암실에서 37°C에서 증식을 위해 배양 기간(1, 3, 5, 7일)의 마지막 2시간 동안 CCK-8 용액과 함께 배양되었습니다. ELISA 리더(DNM-9602)를 사용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정했습니다.
SEM 측정을 위한 세포 샘플을 포름알데히드로 고정한 후, 샘플을 각 농도에서 15분 동안 단계별 에탄올(30, 50, 75, 95, 100%) 시리즈를 통해 탈수했습니다. Then, the samples were drying by critical point drying was allowed to occur with a carbon dioxide analyzer (Hitachi, HCP-2). Finally, the samples with gold coating were observed by SEM.
The fibroblasts cells concentration was adjusted to 1 × 10 4 /ml and was inoculated into 96-well plates at 200 ul per well. Then, the well plates were incubated at 37 °C in a 5% CO2 incubator for 24 h. The samples (nHAC/PLGA, nHAC/PLGA/GO (0.5 wt%), nHAC/PLGA/GO (1.0 wt%) and nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%)) were powdered to make a 100 mg/ml suspension. The experiment group with 100 ul suspension and control group with equal volume of DMEM complete medium were incubated for 24 h and were further incubated for 4 h after the CCK-8 was added to the incubator. The cell viability was obtained by measuring the absorbance at the wavelength of 450 nm using an ELISA reader. The cell viability was calculated by using the following formula,
$$ \mathrm{Cell}\ \mathrm{viability}\ \left(\%\right)=\left[\mathrm{A}\ \left(\mathrm{experiment}\right)-\mathrm{A}\ \left(\mathrm{blank}\right)\right]/\left[\mathrm{A}\ \left(\mathrm{control}\right)-\mathrm{A}\ \left(\mathrm{blank}\right)\right]\times 100\% $$Where A (experiment) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution and power samples solution; A (blank) represents absorbance of wells with medium and CCK-8 solution without cells and A (control) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution without power samples solution.
Quantitative results were expressed as the mean value from at least triplicate samples ± standard deviation (SD). 학생의 t test was used to the statistical analysis. A value of p < 0.05 was considered statistically significant. Data are marked ** to indicate p < <0.01.
3차원
원자력 현미경
Cell counting kit-8
Computational topology design
Dulbecco’s modified Eagle media
X-ray spectroscopy
Fetal bovine serum
푸리에 변환 적외선 분광기
산화 그래핀
Hydroxyapatite
Osteoblast cells
Mesenchymal stem cells
Nano-hydroxyapatite/collagen
Fibroblast cells
Phosphate-buffered saline
Poly(lactic acid)
poly(lactic-co-glycolic acid)
Quantitative nano-mechanical atomic force microscope
Standard deviation
주사 전자 현미경
Olid free-form fabrication
X선 회절
나노물질
초록 Nanobiosensors는 화학적 및 생물학적 작용제를 감지하고 그 결과를 생물학적 활성 분자와 이화학적 검출기에 의해 신호 변환기 표면에 고정된 인식 요소 사이의 의미 있는 데이터로 변환하는 편리하고 실용적이며 민감한 분석기입니다. 빠르고 정확하며 신뢰할 수 있는 작동 특성으로 인해 나노바이오센서는 임상 및 비임상 응용, 병상 시험, 의료 섬유 산업, 환경 모니터링, 식품 안전 등에 널리 사용됩니다. 이러한 중요한 응용 분야에서 중요한 역할을 합니다. 따라서 바이오센서 인터페이스의 설계는 나노바이오센서의 성능을 결정하는데
초록 산화물/금속/산화물(OMO) 레이어 스택은 박막 태양 전지의 전면 접촉으로 투명 전도성 산화물을 대체하는 데 사용됩니다. 이러한 다층 구조는 접점의 전체 두께를 줄일 뿐만 아니라 간섭 효과를 사용하여 셀을 착색하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 금속층에 크게 의존하는 면저항과 기생흡수는 태양전지에서 더 높은 효율을 달성하기 위해 더욱 감소되어야 한다. 이 간행물에서 AgOX Cu(In,Ga)Se2의 성능을 향상시키기 위해 OMO 전극에 습윤층이 적용되었습니다. (CIGS) 박막 태양 전지. AgOX 습윤층은 다층 전극
