녹차 추출물을 사용하여 합성된 금 나노입자의 형태 의존적 세포독성 및 세포 흡수

결과 및 토론

자외선 가시 스펙트럼

UV 가시 스펙트럼은 일반적으로 AuNP의 합성을 확인하기 위해 획득됩니다. AuNP의 특징적인 SPR은 가시-근적외선 파장 범위에서 관찰될 수 있습니다. 더욱이, AuNPs의 캡핑은 일반적으로 bathochromic(또는 red) 또는 hypsochromic(또는 blue) 이동을 유도합니다. 또한, 일반적으로 적색 및 청색 이동과 함께 저변색성 이동이 유도된다. 도 1b에 도시된 바와 같이, UV-가시광선 스펙트럼은 300~800 nm 범위에서 모니터링되었다. Nanospheres는 532 nm의 특징적인 SPR과 짙은 버건디 색상을 나타냅니다. 나노구의 키토산 캡핑 후, 최대 SPR은 저변색성 이동과 함께 537 nm로 적색 이동되었습니다(그림 1b). 짙은 파란색 용액과 함께 광범위한 SPR 파장(600~800 nm)이 나노별에서 관찰되었습니다(그림 2b). 나노별의 키토산 캡핑은 저변색성 이동을 나타내었고, 여기서 흡광도는 키토산 캡핑이 없는 AuNP의 흡광도보다 낮았습니다(그림 2b). Nanorods는 514 nm와 815 nm의 두 가지 별개의 SPR 파장을 보여 옅은 분홍색 용액을 형성했습니다(그림 3b). 나노로드의 키토산 캡핑은 저변색성 이동과 함께 797 nm로의 청색 이동을 유도했습니다(그림 3b). 이러한 모든 결과를 고려할 때 키토산으로 AuNP를 캡핑하면 SPR 파장이 변경되고 이동이 유도됩니다. UV 가시광선 스펙트럼을 주의 깊게 조사한 결과 세 가지 유형의 AuNP가 키토산으로 성공적으로 덮인 것으로 나타났습니다.

유체역학적 크기 및 제타 전위

다음으로, 유체역학적 크기와 제타 전위가 측정되었습니다. 결과는 표 1에 나와 있습니다. 키토산 캡핑 없이 나노구 및 나노스타의 유체역학적 크기는 각각 28.4 및 97.8 nm였습니다. 나노로드의 유체역학적 크기는 나노입자의 구형에 잘 맞게 조정되었기 때문에 측정하지 않았다. 키토산 캡핑으로 유체역학적 크기는 나노구체의 경우 190.7 nm, 나노스타의 경우 123.9 nm로 증가했습니다. 키토산 캡핑은 유체역학적 크기의 증가로 확인되었습니다. 제타 전위의 변화는 또한 AuNP 표면의 키토산 캡핑을 반영했습니다. 키토산은 양전하를 띤 다당류입니다. 따라서 키토산 캡핑은 세 가지 유형의 AuNP 모두에 대해 긍정적인 제타 전위를 초래했습니다. 나노구의 경우 제타 전위가 - 12.73에서 42.28 mV로 변경되었습니다. 나노별의 제타 전위는 - 42.46에서 47.44 nm로 변경되었습니다. 나노로드의 경우 합성에 CTAB(양이온성 계면활성제)를 사용하였다. 따라서 원래의 제타 전위는 캡핑 없이 27.96 mV였습니다. 나노로드의 키토산 캡핑은 제타 전위를 33.23 nm로 증가시켰습니다. 따라서 나노구체 및 나노스타에 대한 제타 전위의 음수에서 양수 값으로의 변화는 키토산으로 성공적으로 캡핑되었음을 분명히 나타냅니다. 또한, 나노로드의 제타 전위가 증가하여 표면이 키토산으로 덮여 있음을 시사합니다.

HR-TEM 이미지

현미경은 나노입자의 크기와 모양에 대한 필수 정보를 제공하는 나노입자 연구에 매우 중요합니다. 현미경 도구는 분산 상태, 2차원 및 3차원 형태 및 지형, 재료의 상대적인 부드러움/경도와 같은 다양한 세부 정보를 제공합니다. 나노구체는 HR-TEM 이미지에서 무작위로 선택된 75개의 개별 나노입자의 평균을 기반으로 8.7 ± 1.7 nm로 측정되었습니다(그림 4). 크기는 8~9 nm(29.3%)가 가장 많았고, 9~10 nm(12.0%)가 그 뒤를 이었습니다. 키토산 캡핑으로 나노구의 모양은 모양의 변화 없이 보존되었습니다(그림 4c, d). 입자의 결정질 특성은 그림 4d에 표시된 격자 구조에 의해 명확하게 표시되었습니다. 인접한 격자 사이의 거리는 0.24 nm로 측정되었습니다(그림 4d). 또한, 그림 4d의 빨간색 화살표로 표시된 것처럼 키토산 층도 시각화되었습니다. 나노별은 그림 5와 같이 HR-TEM에 의해 시각화되었습니다. 나노별은 99.0 ± 47.0 nm로 측정되었으며, 이는 19개의 개별 나노입자의 평균을 나타냅니다. 격자 구조는 확대된 이미지로 표시됩니다(그림 5c). 도시된 바와 같이 인접한 격자 사이의 거리는 0.24 nm로 측정되었습니다(그림 5c). 그림 5c의 빨간색 화살표는 키토산 층을 나타냅니다. Nanorod는 그림 6과 같이 시각화되었습니다. 28개의 입자에 대한 측정에 따르면 평균 입자 길이와 너비는 각각 60.4 nm 및 16.4 nm였습니다. 입자 길이를 입자 폭으로 나눈 것으로 정의되는 종횡비는 3.7이었다. 격자 구조는 그림 6c와 같이 나노로드의 결정 구조를 확인합니다. 인접한 격자 사이의 거리는 0.23 nm로 측정되었습니다(그림 6c). 빨간색 화살표는 키토산 층을 나타냅니다(그림 6c).

금 나노구의 HR-TEM 이미지. 눈금 막대는 a를 나타냅니다. 5nm, b 20nm, c 20nm 및 d 5나노. 이미지 a 그리고 b 키토산 캡핑 없이 얻은 c 그리고 d 키토산 캡핑으로 얻었다. 인접한 격자 사이의 거리는 0.24nm로 측정되었습니다. 빨간색 화살표는 캡핑 후 키토산 층을 나타냅니다.

금 나노별의 HR-TEM 이미지. 눈금 막대는 a를 나타냅니다. 200nm, b 50nm 및 c 5나노. d 평균 크기가 99.0 ± 47.0 nm인 나노별의 개략도. 이미지 a 키토산 캡핑 없이 얻은 b 및 c 키토산 캡핑으로 얻었다. 인접한 격자 사이의 거리는 0.24nm로 측정되었습니다. 빨간색 화살표는 캡핑 후 키토산 층을 나타냅니다.

금 나노로드의 HR-TEM 이미지. 눈금 막대는 a를 나타냅니다. 100nm, b 200nm 및 c 5나노. d 평균 길이와 너비가 각각 60.4nm 및 16.4nm인 나노로드의 개략도입니다. 이미지 a 키토산 캡핑 없이 얻은 b 및 c 키토산 캡핑으로 얻었다. 인접한 격자 사이의 거리는 0.23nm로 측정되었습니다. 빨간색 화살표는 캡핑 후 키토산 층을 나타냅니다.

FT-IR 스펙트럼

녹차에는 다양한 1차 및 2차 대사산물이 포함되어 있습니다. 구체적으로 녹차의 주성분은 에피갈로카테킨-3-갈레이트, (-)-에피카테킨-3-갈레이트, (-)-에피갈로카테킨, (-)-에피카테킨 등의 폴리페놀이다[28]. FT-IR 스펙트럼은 AuNP의 합성에 기여한 작용기에 대한 정보를 얻기 위해 획득되었습니다. 나노스피어의 FT-IR 스펙트럼을 추출물의 스펙트럼과 비교했습니다(그림 7). Au 염의 환원 반응에 가장 관여할 가능성이 있는 주요 작용기는 -OH였다. 추출물에서 -OH 작용기는 3255 cm ⁻¹ 에서 나타났습니다. (그림 7a). 합성 시 이 피크는 3300~3341 cm ^-1 에서 더 높은 파수로 이동했습니다. . 이 결과는 -OH 작용기가 Au 염을 AuNP로 환원시키면서 C=O로 산화된 폴리페놀에서 유래함을 보여주었다. 놀랍게도, 1716 cm ^-1 에서 C=O 작용기의 출현 나노구체에서 합성 중 –OH 작용기의 산화를 분명히 지원했습니다(그림 7b).

a의 FT-IR 스펙트럼 합성에 사용되는 녹차 추출물 및 b 금 나노구

다양한 솔루션에서 콜로이드 안정성 평가

나노 입자의 콜로이드 안정성은 진단 및 치료 응용 분야에서 중요한 관심사입니다. 콜로이드 안정성에 대해 (i) 탈이온수, (ii) NaCl(5%), (iii) PBS(pH 7.4), (iv) BSA(5%), (v) DMEM 및 (vi) 6가지 다른 용액을 콜로이드 안정성에 대해 테스트했습니다. ) 전체 배지(10% FBS를 포함하는 DMEM). 각 유형의 AuNP를 테스트 용액과 혼합한 후 UV 가시 스펙트럼을 얻었습니다. 결과는 표 2 및 그림 8에 나와 있습니다. UV 가시 스펙트럼에서 세 가지 유형의 AuNP 모두에 대해 약간의 적색 또는 청색 이동과 함께 저변색성 이동이 관찰되었습니다(그림 8a, c 및 e). 스펙트럼의 모양은 유지되었고 콜로이드 용액의 응집은 관찰되지 않았습니다(그림 8b, d, f). 이 결과는 위에서 언급한 테스트 솔루션에서 콜로이드 안정성이 상당히 잘 유지되었음을 보여줍니다.

콜로이드 안정성 평가. 아 그리고 b 키토산 캡핑이 있는 나노스피어, c 그리고 d 키토산 캡핑이 있는 나노스타, e 및 f 키토산 캡핑이 있는 나노로드, g 그리고 h 키토산 캡핑이 없는 나노스피어. DW는 탈이온수를 나타냅니다.

표 2에서 저변색성 이동은 원래 용액의 흡광도를 100%로 설정한 상태에서 유지 흡광도의 백분율로 표시됩니다. 세 AuNP 모두에서 콜로이드 안정성은 전체 배지에서 가장 잘 유지되었으며, 이는 후속 세포독성 실험에 사용되었습니다:나노구체(65.3%), 나노스타(93.4%) 및 나노막대(80.2%). 단백질 용액인 BSA(5%)도 합리적인 콜로이드 안정성을 제공했습니다:나노구체(61.8%), 나노스타(70.2%) 및 나노막대(72.0%). 이러한 결과는 나노입자를 덮는 단백질이 키토산 캡핑과 함께 AuNP의 콜로이드 안정성에 더 유익한 효과가 있음을 나타냅니다. 키토산 캡핑이 없는 나노스피어의 콜로이드 안정성도 평가되었습니다(그림 8g, h). 모든 솔루션은 hypochromic shift를 유도했습니다. 실험한 용액 중 NaCl(5%) 용액만이 저변색성 이동과 함께 큰 적색 편이를 보였다.

세포독성

AGS, HeLa, HepG2 및 HT29의 4가지 암세포 유형(그림 9)에 대한 세포독성을 측정하기 위해 MTT 분석을 수행했습니다. 세 가지 유형의 AuNP 모두의 세포독성은 Au 농도에 의존적이었다. Among the four cell types, the highest cytotoxicity was observed for HepG2 cells. Furthermore, nanorods showed the highest toxicity against the four cell types, followed by nanostars and finally by nanospheres. Specifically, nanorods showed a very high toxicity; thus, the cytotoxicity of nanorods containing a low range of Au concentrations was also evaluated (Fig. 9e). At concentrations as low as 8 μM Au, nanorods showed concentration-dependent cytotoxicity. Against HepG2 cells, the IC₅₀ value was 127.1 μM Au for nanospheres, 81.8 μM Au for nanostars, and 22.7 μM Au for nanorods. Thus, nanorods were the most cytotoxic, followed by nanostars, and nanospheres were the least cytotoxic against HepG2 cells.

Cytotoxicity assessed by MTT assay (31.25~500 μM Au concentration). 아 AGS, b HeLa, c HepG2, and d HT29. 이 Low Au concentrations (8~125 μM) were evaluated on HepG2 cells

It has been reported that the cytotoxicity of AuNPs is affected by size, shape, and surface charge [29, 30]. Favi and co-workers investigated the cytotoxicity of Au nanospheres (61 nm) and Au nanostars (34 nm) against two types of cells (human skin fibroblasts and rat fat pad endothelial cells) [31]. In both cell types, a lethal concentration was observed at 40 μg/mL for nanospheres and at 400 μg/mL for nanostars. Their results suggested that nanospheres were more cytotoxic than nanostars, suggesting that size, shape, and surface chemistry are most likely influential to the cytotoxicity of AuNPs. Woźniak and co-workers reported the cytotoxicity of AuNPs with diverse shapes against both HeLa and HEK293T (human embryonic kidney cells), namely, nanospheres (~ 10 nm), nanoflowers (~ 370 nm), nanorods (~ 41 nm), nanoprisms (~ 160 nm), and nanostars (~ 240 nm) [30]. Interestingly, nanospheres and nanorods were more cytotoxic than nanoflowers, nanoprisms, and nanostars. The authors explained that the small size of the nanoparticles and the aggregation process were the main driving forces for the cytotoxicity of nanospheres and nanorods in their work. Indeed, many studies have addressed the size effect of AuNPs on cytotoxicity [32, 33]. As AuNPs become smaller, their uptake by cells increases. This higher uptake results in a higher concentration of AuNPs in the cell, which leads to higher cytotoxicity against cells. However, a low concentration of AuNPs in the cell also shows high cytotoxicity [34]. The concentration of AuNPs in the cell affects cytotoxicity; however, it is vital to consider and understand the characteristics of AuNPs. The cytotoxicity of AuNPs of two different shapes (nanospheres 43 nm, nanorods 38 × 17 nm) was evaluated in epithelial cells by Tarantola and co-workers [35]. Nanospheres were determined to be more cytotoxic than nanorods. Furthermore, nanospheres induced a dysfunction in epithelial cell membranes, which was measured by electric-cell substrate impedance sensing [35]. As previously discussed, many studies are currently investigating the cytotoxicity of different shapes of AuNPs in various cells. Although the shapes of AuNPs may remain the same, many factors still affect the cytotoxicity of AuNPs. When assessing cytotoxicity, factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type should also be considered [34, 36,37,38]. In addition to the characteristics of AuNPs, cytotoxic mechanisms including disruption of the cell membrane, oxidative stress, destruction of the cytoskeleton, and loss of mitochondrial function are also important [38, 39]. Currently, autophagy and lysosomal dysfunction are emerging as explanations of the cytotoxicity of nanomaterials [40]. In lysosomes, nanomaterials induce cytotoxicity by lysosomal-iron-mediated oxidative stress and the release of cathepsins and other associated lysosomal hydrolases, which causes mitochondrial dysfunction and cell death. In the current report, nanorods were the most cytotoxic against the four types of cancer cells tested. Thus, our future work will examine the detailed mechanisms of cytotoxicity.

Cellular uptake on HepG2 cells

HepG2 cells showed the highest cytotoxicity among the four types of cancer cells; accordingly, we selected this cell type for evaluating cellular uptake. Two instruments, ICP-OES and LA-ICP-MS, were used to quantitatively analyze the concentration of Au in cells, and the results are shown in Fig. 10. A Au concentration of 5 μM was used for evaluating cellular uptake because no toxicity was observed at this concentration among the four types of cancer cells. The uptake was the highest for nanospheres (58.0 %), followed by nanorods (52.7 %) and nanostars (41.5 %). As indicated in the previous section, the cytotoxicity was dependent on particle shape (nanorods> nanostars> nanospheres). However, the order of cellular uptake (nanospheres> nanorods> nanostars) did not match the order of cytotoxicity. The cellular uptake of nanospheres was the highest; however, the cytotoxicity of these particles was the lowest. These results suggest that high cellular uptake does not always induce high cytotoxicity. As mentioned previously, diverse factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type are important in influencing cytotoxicity.

Cellular uptake by HepG2 cells

The different degrees of uptake of the three types of AuNPs (41.5~58.0 %) possibly depend on the competition between wrapping (i.e., how a membrane encloses a nanoparticle) under a thermodynamic driving force and receptor diffusion kinetics [41, 42]. Chithrani and Chan compared the cellular uptake of transferrin-coated Au nanospheres and Au nanorods by HeLa cells [42]. At the same size (i.e., the same value for the nanosphere diameter and nanorod width), nanospheres showed higher uptake than did nanorods. This result is consistent with our observations in the current report of higher uptake of nanospheres compared with nanorods. For nanorod uptake, width is more important than length, and an increasing aspect ratio decreases the uptake rate [42]. The size of the nanostars was 99.0 ± 47.0 nm, making them the largest particles among the three types of AuNPs. For large nanoparticles (> 50 nm), slow receptor diffusion kinetics lead to short wrapping times [42]. Thus, the cellular uptake of large nanoparticles is low, i.e., nanostars in the current report. Chitosan was used for capping the AuNPs to increase their colloidal stability and biocompatibility. Chitosan capping can also play a role in the cellular uptake of AuNPs by interacting with receptors on the cell surface. A detailed mechanistic study is necessary to elucidate this issue.