염증 유발 암 영상을 위한 효율적인 조영제로서 환경 친화적인 생체접합 금 나노입자

방법/실험

연구 목적

이 연구의 목적은 금 나노 입자의 형광 특성이 IF 및 유세포 분석 기술에서 어떻게 사용될 수 있는지를 입증하는 것입니다. 또한 AuNP로 테스트한 프로토콜을 ALEXA를 사용하는 표준 프로토콜과 비교하여 AuNP를 프로토콜에서 사용할 수 있음을 증명했는데, 이는 표준 프로토콜만큼 빠르지만 안정적인 프로토콜입니다.

화학물질 및 시약

삼염화금(HCl 중 30 wt%), 폴리비닐피롤리돈(PVP, MW =10.000), 수산화나트륨, 투석 튜브 셀룰로오스 막 및 글리세롤은 Sigma-Aldrich Chemical Co(Saint Louis, USA)의 제품입니다. 황산과 과산화수소는 Vetec(브라질 리우데자네이루)에서 구입했습니다. 인산완충식염수(PBS) 용액과 소혈청알부민(BSA, 5%)은 Life Technologies Corporation©(California, USA)에서 구입했습니다. 항-COX-2(시클로옥시게나제-2) 및 항-MIF(대식세포 이동 억제 인자) 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology(브라질 상파울루)에서 구입한 반면, 염소 항-쥐 IgG H&L Alexa Fluor® 488 2차 항체는 ABCAM®(Cambridge, UK)에서 구입했습니다. ABCAM®(Cambridge, UK)의 Fluoroshield Mounting Medium with DAPI(20 ml)는 DNA 대조염색에 사용되었습니다.

AuNP 및 형광 분광법의 생산 및 특성화

구형 AuNP(7.1nm)는 Gasparotto et al.의 연구에 따라 생성 및 특성화되었습니다. [12]. 간단히 말해서, 모든 유리 제품은 KMnO₄에 보관되었습니다. 밤새 + NaOH 용액, 탈이온수로 헹구고 H₂에 보관 O₂ + H₂ SO₄ 솔루션(1:1 v /v ) 10분 동안 탈이온수로 다시 헹구고 사용 전에 건조합니다. PVP(0.20 g) 및 금 염화물(6.80 mg)을 10 ml의 물에 용해시켰다. 별도의 비이커에 글리세롤(0.18 g)과 NaOH(0.080 g)를 물 10 ml에 녹였습니다. 그런 다음 글리세롤-NaOH 용액을 AuCl₃에 첨가했습니다. -PVP 용액은 다음과 같은 최종 농도를 생성합니다. 1.0 mmol/L ⁻¹ Au ³⁺ , 0.10 M NaOH, 0.10 M 글리세롤 및 10 g/L ⁻¹ PVP. 최종 혼합물은 AuNP의 형성으로 인해 짙은 붉은색을 띠었습니다. AuNP의 콜로이드 자외선 가시 흡수 스펙트럼은 Evolution 60S UV 가시 분광 광도계(Thermo Scientific, MA, USA)로 획득했습니다. 형광 분광법은 RF-5301 PC 분광 형광 광도계(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 수행되었습니다.

실험 디자인

3가지 프로토콜 모두 2가지 만성 염증 모델, 아세트산 유발 궤양성 대장염(UC)[7] 및 알코올 유발 지방간염[8, 9] 쥐의 대조군에서 테스트되었습니다.

아세트산 유도 UC는 Biotechnology Center/Universidade Federal da Paraiba에서 얻은 암컷 Wistar 쥐(BW ​​220 ± 20 g)에서 수행되었습니다. 동물을 두 그룹(n =그룹당 5):아세트산 대조군 및 비대장균 쥐. 동물을 밤새 금식시키고 케타민(70 mg/kg, 10%) 및 자일라진(10 mg/kg, 2%)으로 마취시켰다. UC는 원래 MacPherson과 Pfeiffer[13]에 의해 기술되고 Millar et al.에 의해 수정된 방법에 따라 유도되었습니다. [14]. 카테터를 결장에 조심스럽게 삽입했습니다. 그런 다음, 0.9% 식염수에 녹인 10% 아세트산(0.5 ml)을 결장의 내강에 주입했습니다. 비-대장균 그룹은 0.5 ml의 0.9% 식염수를 결장내로 투여받았다. 래트는 결장내 점적액의 누출을 방지하기 위해 30 동안 앙와위 Trendelenburg 자세를 유지했습니다.

동물을 밤새 금식시키고 유도 후 48시간에 티오펜탈 과량 투여로 안락사시켰다. 다음으로 결장을 무균적으로 제거하고 PBS로 헹구고 얼음처럼 차가운 접시에 놓았다. 결장은 지방과 장간막을 청소했습니다. 그런 다음 각 시편의 무게를 측정하고 일정한 하중(2 g)에서 길이를 측정했습니다. 그 후, 결장은 세로로 열렸고 Bell et al. [15].

리오그란데도노르테연방대학교(UFRN) 생물물리학 및 약리학과에서 얻은 수컷 Wistar 쥐(BW ​​290 ± 10 g)에서 알코올 지방간염이 유발되었습니다. 동물을 두 그룹(n =5/그룹):알코올 및 비알코올 쥐. 에탄올 용액(30% v의 7 g/kg 체중 /v )은 알코올 그룹의 만성 용량으로 사용되었습니다. 비알코올 그룹의 동물은 위관 영양법으로 동량의 식염수 용액(0.9% NaCl)을 경구 투여했습니다. 위관 영양 절차는 28 일 동안 두 그룹에서 하루에 한 번 수행되었습니다.

29일째에 7.5 ml/kg 케타민(50 mg/ml)과 2.5 ml/kg 자일라진(20 mg/ml)을 복강내 주사하여 안락사를 시행하였다. 안락사 전에 모든 동물 그룹은 12 시간 동안 금식했습니다. 일단 의식을 잃은 동물은 심장에 구멍을 내고 간을 제거했습니다. 조직병리학적 분석을 위해 간 조각을 10% 완충 포름알데히드에 담그었습니다.

아세트산 유도 UC 및 알코올 유도 지방간염의 동물은 자유롭게 표준 조건(12시간 명암 주기, 22 ± 0.1 °C 및 50–55% 습도)에서 사육되었습니다. 음식과 물에 대한 접근. 동물 실험에 대한 윤리적 원칙에 따라 동물을 취급했습니다.

조직학

각 염증 모델의 양성 대조군(아세트산 대조군 및 알코올 대조군)의 5개 파라핀 블록을 간접 IF 염색에 사용했습니다. 1차 항체인 anti-COX-2와 anti-MIF는 각각 아세트산으로 유발된 UC와 알코올로 유발된 지방간염에서 좋은 염증 마커로 밝혀졌습니다. 프로토콜.

조직을 10% 완충 포름알데히드에 고정하고 에틸 알코올(70%, 80%, 90%, 95% 및 P.A.)로 탈수하고 Xylol에서 정화하고 표준 프로토콜에 따라 파라핀에 함침시켰다[8]. 간접 IF 염색을 위한 절편을 준비하기 전에 슬라이드를 24시간 동안 60°C의 오븐에 보관했습니다.

면역형광 및 프로토콜 설계

각 동물의 3개 조직 섹션(4 μm)을 자일렌에서 탈파라핀화하고 99% 에탄올에서 50% 에탄올로 감소하는 일련의 에탄올 농도로 세척했습니다. 마지막으로 조직 절편을 dH₂로 두 번 세척했습니다. O 및 PBS로 1회 세척합니다. 항원 검색은 섹션을 95°C에서 30분 동안 30분 동안 실온(RT)에서 20분 동안 0.05% Tween 20이 포함된 10mM 시트르산나트륨에 배치하여 수행되었습니다. 배경 소음/신호는 섹션을 실온에서 20분 동안 70% 알코올에서 인큐베이션한 후 0.02% PBS-Tween 20에서 3회 세척하여 감소되었습니다. 샘플은 0.2% Triton-X-100에서 투과화되었습니다. PBS(3회 세척, 각각 5분), PBS로 세척한 다음 PBS, 5% BSA, dH₂로 차단 O, 그리고 Triton-X-100. 슬라이드를 2 시간 동안 습도 챔버에서 블록 용액과 함께 인큐베이션했습니다. 표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, 항-COX-2 및 항-MIF 1차 항체의 인큐베이션은 3가지 상이한 프로토콜(NP1, NP2 및 NP3)에 따라 수행되었다. 이 프로토콜은 1차 항체의 배양 시간이 다른 두 가지 ALEXA 기반 프로토콜, 즉 우리 연구 그룹에서 대부분의 절차(A1)에 대한 표준 프로토콜로 채택한 ALEXA 표준 프로토콜(야간 배양)과 ALEXA 수정 프로토콜(A2)과 비교되었습니다.; 30 분 인큐베이션). NP1은 1차 배양을 위해 30 분의 나노입자 의존 면역형광 염색법입니다. 1차 항체를 1% BSA에 1:500(anti-COX-2) 및 1:400(anti-MIF)의 비율로 희석하고, 각 샘플을 RT(20 °C)의 습도 챔버에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. . 다음으로, 100–150 μl의 AuNPs를 샘플에 첨가하고, 이를 RT(20 °C)에서 추가로 30분 동안 배양했습니다. 두 번째 나노입자 의존 프로토콜(NP2)에서는 1차 항체를 1% BSA에 희석하고 슬라이드에 직접 적용한 후 냉장고에 밤새 방치했습니다. 따라서 A2와 NP1은 모두 30분 배양 프로토콜이지만 A2는 2차 형광 항체(ALEXA)로 수행되는 반면 NP1은 AuNP를 형광단으로 사용합니다. 이것은 밤새 배양 프로토콜 A1 및 NP2에도 적용됩니다. 각각의 인큐베이션 시간 후, 각 프로토콜의 슬라이드를 PBS로 3회 세척하여 과량의 1차 항체를 제거하였다. 그런 다음 NP2의 각 슬라이드에 100-150 μl의 나노 입자를 첨가한 반면 A1에는 ALEXA(1:400)를 첨가했습니다. AuNP(NP2) 및 ALEXA(A1)로 1 시간 배양한 후 모든 슬라이드를 PBS로 3회 세척했습니다.

아세트산 유발 UC 및 알코올 유발 지방간염 대조군의 헤마톡실린 및 에오신 염색 이미지. 아 UC 모델의 음성 대조군(× 100; 눈금 막대 =100 μm). ㄴ 아세트산 유발 UC. 빨간색 화살표는 점막 영역의 백혈구 침윤을 나타냅니다(× 100, 눈금 막대 =100 μm). ㄷ 지방간염의 음성 대조군(× 200; 눈금 막대 =50 μm). d 알코올성 지방간염. 검은색 화살표는 백혈구 침윤을 나타냅니다(× 200, 눈금 막대 =50 μm)

세 번째 프로토콜(NP3)은 형광 시스템에서 AuNP의 증폭 특성을 탐색하도록 설계되었습니다. NP3에서 AuNP는 1% BSA에서 ALEXA를 희석하는 동안 적용되었습니다. AuNPs가 포함된 BSA에서 이차 항체의 세 가지 희석액(1:200, 1:400 및 1:800)을 테스트하여 각 희석액의 형광 강도를 A1에 비교했습니다. AuNP의 부피가 BSA의 부피에 비례하도록 희석액을 준비했습니다. 예를 들어 1:200 희석의 경우 ALEXA 2 ㎕를 AuNP 199㎕ + BSA 199㎕에 희석했습니다. A1 및 NP3에서 1차 항체의 배양 시간은 약 18시간(밤새)인 반면, ALEXA + AuNPs 현탁액의 배양 시간은 1시간이었습니다.

마지막으로 DAPI와 함께 Fluoroshield Mounting Medium을 사용하여 샘플을 장착했습니다. 슬라이드는 빛이 차단된 상자에 보관하고 현미경으로 분석할 때까지 4 °C에서 보관했습니다. AxioCam MRc를 사용하여 형광 및 명시야 이미징(x 20 및 x 10 대물렌즈, Carl Zeiss, Jena, Germany)을 위한 Zeiss Observer z.1 직립 현미경으로 형광 이미지를 얻었습니다. Zeiss ZEN 라이트 블루 에디션 소프트웨어(Carl Zeiss)의 산술 평균 매개변수를 사용하여 ALEXA 채널의 각 사진에 대해 픽셀 단위로 형광 강도를 정량적으로 평가했습니다. 각 동물의 최소 3개 샘플(그룹당 5마리)을 분석하고 × 10 대물렌즈로 각 조각에서 5개의 사진을 촬영했습니다.

시험관 내 M2 극성 TAM 유도

M2 대식세포, RAW 264.7 세포(5 × 10 ⁵ 12웰 플레이트의 세포/웰)을 20 ng/ml IL-4가 보충된 10% 소 태아 혈청이 포함된 완전 배지에서 24시간 동안 배양했습니다. IL-4 처리 후 세포를 무혈청 DMEM으로 3회 세척한 후 동일한 배지에서 48시간 동안 배양하였다. Telaval 31 광학현미경(ZEISS, Oberkochen, Germany)을 사용하여 세포를 분석했습니다.

유세포분석

48시간 동안 IL-4 배양 후, RAW 264.7 세포 및 M2 대식세포(1.5 × 10 ⁴ 12웰 플레이트의 세포/웰)을 스크레이퍼로 수집하고 45분 동안 100 ml PBS(PBA) 중 0.5g BSA로 차단한 다음 PerCP-접합된 항-마우스 CD163(1:1000) 및 FITC와 함께 인큐베이션했습니다. -60 분 동안 4°C에서 접합된 항-마우스 CD86(1:1000). 게다가, M2 대식세포는 COX-2 및 MIF 1차 항체로 표지되어 AuNP에 접합되었다. M2-편광된 TAM을 수집하고 PBS 중 2% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정한 다음 항-COX-2 및 항-MIF 1차(1:100)와 함께 4°C에서 60분 동안 배양하고; 그 후, 세포는 Alexa 표준 프로토콜[16]에 설명된 대로 실온에서 60분 동안 인큐베이션 용액(1:100)에서 염소 항토끼 Alexa® Fluor 488-접합 이차 항체(Thermo Fisher Scientific)로 표지되었습니다. AuNP가 염소 항토끼 Alexa® Fluor 488 접합 이차 항체를 대체하는 프로토콜(N1)에 따라 M2 대식세포를 수확하고 PBS로 세척하고 항-COX-2 및 항-MIF 일차 항체(1:100 ) 30 분 동안 실온에서 인큐베이션 용액에서. 그런 다음, 세포를 4°C에서 30분 동안 AuNP(1:5)와 함께 인큐베이션했습니다(520 nm에서 AuNP 여기). 최종 세척 단계 후, 표지된 세포를 BD FACSCanto II(BD Biosciences, 네덜란드) 및 FlowJo 소프트웨어(버전 10.1; Tree Star Inc., UK)에서 분석했습니다. 모든 유세포 분석은 샘플로 3회 수행하고 3회 반복했습니다. 표준 ALEXA와 AuNPs 프로토콜 간의 비교는 표 2에 나와 있습니다.

통계 분석

분산 분석(ANOVA) 및 Bonferroni의 사후 면역형광 분석을 위한 테스트를 수행했습니다. 유세포 분석의 경우 표시된 대로 ANOVA 및 Dunn의 테스트를 사용하여 그룹 간의 유의한 차이를 계산했습니다. p <0.05는 수행된 모든 분석에 대해 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

현미경 분석

그림 1a의 단면은 헤마톡실린과 에오신으로 염색된 조직 단면을 보여줍니다(음성 대조군). 아세트산에 의해 유도된 만성 염증 과정은 그림 1b에 나타나 있으며, 이는 조직 구조의 손실로 인한 상피 파괴, 잔 세포 감소, 손상 부위 근처에 출혈 및 백혈구의 존재를 나타냅니다. 그림에서 지방 방울 축적과 염증성 침윤물(호중구 및 림프구)이 만성 알코올 노출에 노출된 쥐의 간에서 관찰되었습니다.

형광 강도 측면에서 AuNP는 IF 염색을 위한 기존 형광단인 ALEXA와 유사하게 보였습니다. 간 및 결장 샘플 모두에서 NP1 및 NP2의 형광 강도 차이는 A1과 비교할 때 최소이거나 존재하지 않았습니다. 그림 2에는 항-COX-2 및 항-MIF 1차 항체를 사용하여 테스트한 IF 프로토콜 간의 다중 비교가 나와 있습니다. 그림 2a 및 d는 A2, NP1 및 NP2의 형광 강도가 A1 프로토콜과 크게 다르지 않음을 보여줍니다( ^# 피> 0.05), 30분 배양 프로토콜(ALEXA 또는 AuNP 사용)이 진단 맥락에서 적용될 수 있음을 시사합니다.

그룹 간의 형광 강도 비교. 아 A1 단독 아세트산 유도 UC(항 COX-2 항체)와 비교한 A2, NP1 및 NP2에서 AuNP의 형광 강도. ㄴ A1(1:400) 단독 아세트산 유도 UC(항-COX-2 항체)의 형광 강도와 비교한 NP3(1:200, 1:400 및 1:800)의 모든 희석. ㄷ 단시간(A2 및 NP1) 및 밤새 배양(A1 및 NP2) 후 아세트산 유도 동물과 음성 대조군 간의 형광 강도 비교. d A1 단독 알코올 유발 지방간염(항MIF 항체)과 비교하여 A2, NP1 및 NP2에서 AuNP의 형광 강도. 이 NP3의 모든 희석액(1:200, 1:400, 1:800)은 A1(1:400)-단독 알코올-유도 지방간염(항-MIF 항체)의 형광 강도와 비교됩니다. 에 30분 배양(A2 및 NP1) 및 밤새 배양(A1 및 NP2) 후 알코올로 유도된 지방간염 동물과 음성 대조군 간의 형광 강도 비교. 통계:ANOVA 및 Bonferroni의 사후 테스트, ^# 피 ≥ 0.05, **p <0.01,***p <0.001 및 ****p <0.0001

또한 NP3 프로토콜(그림 2b, e)은 AuNP를 ALEXA에 결합하여 검출된 형광 강도를 증가시킬 수 있음을 보여주었습니다(***p <0.001), A1에서 원래 테스트한 1:400 희석에 비해 형광 감소 없이 ALEXA 희석의 두 배까지 허용( ^# 피> 0.05).

마지막으로, 우리는 ALEXA 또는 AuNP로 테스트한 모든 프로토콜이 항원 COX-2 및 MIF를 특징으로 하는 염증 과정의 시작을 감지하는 데 효과적임을 입증하기 위해 질병에 걸린 그룹을 건강한 그룹과 비교했습니다(그림 2f). 그림 3과 4는 그림 2에 그래프로 표시된 데이터를 뒷받침합니다. ALEXA와 AuNP는 모두 녹색 염색으로 표시되며, 분포는 백혈구 침윤 및 조직 손상이 증가한 부위에 해당합니다.

녹색 형광 화합물(ALEXA, AuNPs 또는 둘 다) 및 핵에 대한 DAPI(파란색)로 염색된 염수(음성 대조군) 및 아세트산 유도 UC 그룹의 결장 샘플의 항-COX-2 IF 이미지. 아 항-COX-2 및 ALEXA(녹색)가 포함된 ALEXA 표준 프로토콜(A1)로 염색된 음성 대조군. ㄴ 항-COX-2 및 ALEXA로 변형된 ALEXA 프로토콜(A2)로 염색된 음성 대조군. ㄷ ALEXA 대신 항-COX-2 및 AuNP(녹색)로 나노입자 프로토콜 1(NP1)로 염색된 음성 대조군. d ALEXA 대신 항-COX-2 및 AuNP로 나노입자 프로토콜 2(NP2)로 염색된 음성 대조군. 이 A1으로 염색된 양성 대조군. 에 A2로 염색된 양성 대조군. 지 NP1으로 염색된 양성 대조군. 아 NP2로 염색된 양성 대조군. 나 1:200 ALEXA로 항-COX-2 + AuNP로 나노입자 프로토콜(NP3)로 염색된 양성 대조군. j NP3로 염색된 양성 대조군(ALEXA의 1:400 희석). 케이 NP3로 염색된 UC 양성 대조군(ALEXA의 1:800 희석). 배율, × 200. 스케일 바 =50 μm

핵에 대한 녹색 형광 화합물(ALEXA, AuNP 또는 둘 다) 및 DAPI(파란색)로 염색된 염수(음성 대조군) 및 알코올 유발 지방간염 그룹의 간 샘플의 항 MIF IF 이미지. 아 안티 MIF 및 ALEXA(녹색)가 포함된 ALEXA 표준 프로토콜(A1)로 염색된 음성 대조군. ㄴ 항MIF 및 ALEXA가 포함된 ALEXA 수정 프로토콜(A2)로 염색된 음성 대조군. ㄷ ALEXA 대신 anti-MIF 및 AuNP(녹색)가 있는 나노입자 프로토콜 1(NP1)로 염색된 음성 대조군. d ALEXA 대신에 항-MIF 및 AuNP로 나노입자 프로토콜 2(NP2)로 염색된 음성 대조군. 이 A1으로 염색된 양성 대조군. 에 A2로 염색된 양성 대조군. 지 NP1으로 염색된 양성 대조군. 아 NP2로 염색된 양성 대조군. 나 1:200 ALEXA가 포함된 항-MIF + AuNP로 나노입자 프로토콜 3(NP3)으로 염색된 양성 대조군. j ALEXA를 1:400으로 희석하여 NP3로 염색한 양성 대조군. 케이 ALEXA를 1:800으로 희석하여 NP3로 염색한 양성 대조군. 배율, × 200. 스케일 바 =50 μm

임상 적용 측면에서 NP1 프로토콜이 가장 유망한 것으로 판명되었습니다. 표준 A1 프로토콜과 비교할 때 18 h를 절약할 수 있기 때문입니다.

유세포분석:1차 항체-접합 금 나노입자(AuNP)-표지 M2 대식세포

M2 대식세포를 추가로 특성화하기 위해 IL-4로 자극된 RAW 264.7 세포에서 M1(CD86) 및 M2(CD163) 관련 제작자의 발현을 유세포 분석에서 분석했습니다. 유세포 분석 결과 CD163 수용체와 같은 M2 관련 마커가 기본 세포보다 유의하게 높았습니다(그림 5a, c, p <0.001) CD86 수용체 발현은 M2 대식세포와 나이브 세포 사이에 어떤 차이도 나타내지 않았습니다(그림 5b, c, p> 0.05). 결과는 IL-4(20 ng/ml)가 고전적 대식세포를 M2 대식세포로 성공적으로 유도함을 시사하였다. 이 단계 후, M2 대식세포를 COX-2 및 MIF 1차 항체와 함께 배양한 다음 AuNP로 표지하여 1차 항체-결합 금 나노입자(AuNP)의 효율성을 표준 프로토콜(ALEXA)과 비교했습니다. 결과는 COX-2와 MIF 항체가 결합된 금 나노입자(그림 5d, f, p <0.001) 또는 ALEXA(그림 5e, f, p <0.001)은 염색되지 않은 샘플과 비교할 때 M2 대식세포에서 더 높은 형광 강도를 나타냈습니다.

COX-2와 MIF 항체 결합 금 나노 입자(AuNPs)는 M2 대식세포 표면에 높은 친화력을 가지고 있습니다. 아 –ㄷ RAW 264.7 세포를 IL-4(20 ng/ml)로 24시간 동안 자극한 후 유세포 분석을 통해 M2 대식세포 마커인 CD163과 M1 마커인 CD86의 양을 정량화했습니다. d , f COX-2 및 MIF 항체 결합 금 나노입자 또는 e , f ALEXA 488은 염색되지 않은 샘플과 비교할 때 M2 대식세포에서 더 높은 형광 강도를 보였습니다. 데이터는 mean ± SD, ^# 으로 표시됩니다. 피> 0.05, ***p <0.001, p <0.0001. 표시된 대표적인 흐름 데이터는 독립적으로 최소 3번 수행한 실험에서 나온 것입니다.

형광 분광기

anti-COX-2(Fig. 6a), anti-MIF(Fig. 6b), ALEXA(Fig. 6c)가 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 정제된 AuNPs의 형광 발광 스펙트럼을 측정하기 위해 여기 파장을 고정하였다. 320 nm에서 방출은 650에서 900 nm 범위에서 기록되었습니다. 여기 파장의 증가는 입자의 방출 범위를 변경하지 않았으므로 산란 과정의 가능성을 배제했습니다. 형광 방출은 항-COX-2 흡수(가장 높은 항체 농도에 대해 11.93 흡광도 단위(au) 증가), 항-MIF(최고 항체 농도에 대해 12.15 au 증가) 및 ALEXA(항체 농도에 대해 3.18 au 증가)로 약간 증가했습니다. 최고 항체 농도) AuNPs와 함께 사용.

항-COX-2 존재 하에 320 nm에서 여기된 AuNP의 형광 방출 스펙트럼(a ), 안티 MIF(b ) 및 ALEXA(c ). 이 연구에 사용된 구형 나노입자의 크기와 분포를 보여주는 TEM 이미지(d ). 여기 및 방출 슬릿은 10 nm이었다. AuNPs의 농도는 29.6 ng/ml ^-1 로 일정하게 유지되었습니다. . 항체 농도는 100 ng/ml ⁻¹ 입니다. (파란색 곡선), 150 ng/ml ⁻¹ (빨간색 곡선) 및 200 ng/ml ⁻¹ (녹색 곡선)

토론

AuNP는 화학 구조와 크기로 인해 형광 특성을 가지며 형광 신호의 증폭 분자로 작용할 수 있음이 밝혀졌습니다. 보다 구체적으로, AuNP 형광 ​​자체는 금 원자 표면의 친호기성 상호작용에서 비롯된다[17, 18]. 그림 6의 데이터는 은 나노 입자에 대한 연구 결과와 유사하며, 이는 흡착제 종과 용액에 용해된 분자 산소 간의 경쟁으로 인해 형광 방출이 증가했기 때문입니다. 따라서 금 나노 입자의 형광 방출 증가는 BSA가 표면에 흡착되어 있다는 사실에 기인할 수 있습니다[19].

형광 신호는 표면 플라즈몬 공명 현상(SPR)의 함수입니다. 따라서 SPR은 자유 전자의 집합적 진동이기 때문에 자유 전자의 양이 증가하면 더 강한 SPR 신호가 발생합니다. 흡착된 BSA는 표면 자유 전자가 산소 분자에 결합하는 것을 방지하여 형광 신호를 증가시킵니다[20, 21]. Anti-COX-2, anti-MIF 및 ALEXA가 AuNP에 흡착되어 O₂를 방지할 수 있습니다. 나노 입자의 표면에 도달하는 것에서. 이것은 형광 신호의 증가가 서로 다른 항체의 매우 낮은 농도에서 발생한 그림 6에 의해 뒷받침됩니다. 그러나 ALEXA가 O₂ AuNPs 표면의 격리.

만성 염증 과정은 각 모델에서 아세트산 또는 에탄올로 인한 손상 부위에서 면역 세포, 주로 대식세포의 침윤을 특징으로 합니다. 염증은 또한 병원체 또는 스트레스 상태에 대한 반응으로 여러 사이토카인 및 매개체의 백혈구 의존적 방출을 특징으로 합니다. 이들 사이토카인 중 COX-2와 MIF는 염증성 사이토카인이기 때문에 여러 염증 과정의 표지자로 알려져 있다. The green staining observed in Fig. 3 and Fig. 4 is due to the release of COX-2 and MIF cytokines, respectively.

In chronic UC and liver steatohepatitis, macrophages are the main cells found which can be classified into two major types:M1 macrophages and M2 macrophages. The classically activated macrophages (M1 macrophages) are proinflammatory and play a pivotal role in host defense against infection which is associated with iNOS and IL-23 production and their cell surface-expressed CD86 or HLA-DR that attract killer cells like neutrophils and/or direct Th1 (cytotoxic) responses and stimulate further M1-type responses [22]. Meanwhile, the alternatively activated macrophages (M2 macrophages) are associated with the responses to anti-inflammatory reactions as well as tissue remodeling [23]. In the tumor context, it has been documented that M2-polarized macrophages promote pro-tumor functions by production of a large array of growth factors such as COX-2 and MIF for tumor cells, which are essential for tumor proliferation [24].

It is well established that UC is an important risk factor for colonic epithelial dysplasia and adenocarcinoma [25, 26]. According to Agoff et al. [25], increased malondialdehyde (MDA) levels and upregulation of Bcl-2 during UC are potential mechanisms to explain the relationship between COX-2 overexpression and neoplastic progression. In UC, the inflammation boosts COX-2 activity, leading to genetic damage through increased production of MDA. MDA is a by-product of COX-mediated prostaglandin synthesis and lipid peroxidation, and it is also constitutively produced by COX-1. Since COX-2 upregulates Bcl-2 expression, it leads to resistance to apoptosis in UC-associated neoplasia [27].

MIF is a multipotent cytokine in the innate immune responses that contributes to hepatic injury driven by alcohol-induced steatohepatitis [28]. When steatohepatitis has developed, the liver morphology rarely goes back to normal, even after cessation. In addition, there is a higher risk of the development of cirrhosis, which is the last stage of alcoholic liver disease (ALD) before hepatocellular carcinoma (HCC) [29].

Studies show MIF presence in the sera after hepatic resection or expression in the course of liver cancer progression [30]. MIF is involved in COX-2 and PGE2 upregulation and directly promotes tumorigenesis by inhibition of p53 accumulation, which is a classic tumor suppressor gene that can promote cell cycle arrest and apoptosis in response to DNA damage [31].

In a previous study [6], we have demonstrated that AuNPs can be easily conjugated with the antibodies anti-β-catenin and anti-E-cadherin to specifically target colorectal carcinoma cells, whose clinical value can be found in an early diagnosis of cancer through non-invasive methods in body fluids such as saliva and urine. In addition, we developed a new protocol to decrease the 27 h that are usually needed for the standard protocol to about 1 h needed for our improved protocol, which makes this method eligible for a clinical colorectal cancer diagnostic.

In this study, we took advantage of the properties of AuNPs conjugated with primary antibodies and applied them for the indirect IF staining method of tissue sections. At this point, we cannot affirm whether the interaction of the antibody with the nanoparticle is purely physical or if there is a chemical bond, since the amount of antibodies used in this method are far too small to produce discernible signals in Fourier-transform infrared spectroscopy. Thus, we rely only on fluorescence data that suggest that conjugation was achieved by direct adsorption of antibodies on the AuNPs surface. Such enhancement has been rationalized in terms of competition between adsorbing species and molecular oxygen dissolved in solution, as explained before by Lima et al. [6]. We found that the replacement of ALEXA by the AuNPs in NP1 saves about 18 h (similar to A2), when compared to standard protocol and NP2 that require about 24 h, each, from the antigenic retrieval to the assembling of the slides for microscopic analysis (Fig. 7 and Table 1). The time for incubation with the primary antibody was 30 min for A2 and NP1, but overnight (18 h) for A1, NP2, and NP3 (Fig. 7a and Table 1).

Comparative schemes illustrating the immunofluorescence (a ) and flow cytometry protocols used in this study (b ). In immunofluorescence, AuNPs may be applied in 30-min incubation protocols as fluorescence-enhancing agents, providing faster results with comparable fluorescence levels to the traditional ALEXA protocol, which makes NP1 a suitable protocol for cancer diagnose. Time was counted from the antigen retrieval to the end of the second incubation. In flow cytometry, although the ALEXA marking was higher than that of the AuNPs, the N1 protocol with AuNPs allowed a greater saving of reagents as well as reduced the time required for the technique from 4 to 1 h

Moreover, we demonstrated MIF and COX-2 primary antibody-conjugated gold nanoparticles can be arranged on the surface of M2 macrophage as a fast alternative to analyze the immune profile of inflammation-induced cancer tissues by flow cytometry. Although the standard protocol is laborious, the intensity of marking to both the primary antibodies was higher than primary antibody-conjugated gold nanoparticles. However, the primary antibody-conjugated gold nanoparticles needed less reagents and the time saving was higher as seen in the standard protocol (4 h) and in primary antibody-conjugated gold nanoparticles N1 protocol (1 h) (Fig. 7b). These results suggest that M2 macrophages can be targeted with primary antibody-conjugated gold nanoparticles either to diagnosis or therapy.

The time saving, the specificity, and the low cost provided by NP1 are especially important in cancer diagnosis, when fast and accurate results are highly required. It is important to highlight that, although the models adopted for this work were based on inflammation diseases, the inflammation markers used in this study are highly cancer-correlated and AuNPs provide multiple possibilities for application in clinical research and diagnosis.

결론

All nanoparticle protocols tested showed similar fluorescent intensities to those observed in standard IF, extending the application of AuNPs, not only in research, but also in clinical diagnostics. When diluted with ALEXA, AuNPs allow greater dilutions with acceptable fluorescence intensity. More importantly, AuNPs can be used in faster protocols (e.g., 30-min incubation protocols), completely substituting ALEXA and providing a way to develop further technologies that will improve cancer diagnose and other diseases. We believe that these findings will contribute to advance research and diagnostic procedures that utilize IF methods as well as widen the applications of AuNPs in biotechnology.

약어

A1:

ALEXA standard protocol

A2:

ALEXA modified protocol

ALD:

Alcoholic liver disease

ALEXA:

Alexa Fluor® 488®

AuNP:

Gold nanoparticles

BSA:

소 혈청 알부민

COX-2:

Cyclooxygenase-2

FC:

Flow cytometry

FI:

Fluorescence imaging

IF:

Immunofluorescence

MDA:

Malondialdehyde

MIF:

Macrophage migration inhibitory factor

NP1:

Nanoparticles protocol 1

NP2

Nanoparticles protocol 2

NP3:

Nanoparticles protocol 3

SPR:

표면 플라즈몬 공명

UC:

Ulcerative colitis

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