다중 모드 영상 및 치료 기능을 통합하는 표적 치료 플랫폼은 암의 조기 발견 및 정확한 치료를 위한 유망한 전략으로 부상하고 있습니다. 여기에서 우리는 이중 모드 초음파(미국)를 위한 항인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2) 항체(Her2-GPH NPs)를 운반하는 표적 금 나노쉘 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 자기 하이브리드 나노입자를 설계했습니다. /자기 공명(MR) 이미징 및 유방암의 광열 요법. 에이전트는 퍼플루오로옥틸 브로마이드(PFOB) 및 초상자성 산화철 나노입자(SPIO)가 함께 로드된 PLGA 나노입자 주위에 금 나노쉘을 코팅한 다음 항-Her2 항체와 접합하여 제조되었습니다. 세포 표적 연구는 Her2 양성 인간 유방암 SKBR3 세포에 대한 제제의 수용체 매개 특이적 결합을 입증했으며, 결합률은 Her2 음성 세포보다 유의하게 더 높았다(P <0.001). 시험관 내에서 에이전트는 T 뿐만 아니라 조영제 강화 미국 영상을 위한 기능을 가지고 있었습니다. 2 - 비교적 높은 이완성을 가진 가중 MR 영상(r 2 =441.47 mM −1 s −1 ). 또한, 에이전트의 Her2 기능화는 세포 특이적 결합에 의해 표적 세포의 US/MR 분자 영상 효과를 현저하게 향상시켰다. 살아있는/죽은 세포 분석 및 표적화된 광열 세포독성 실험은 Her2-GPH NP가 근적외선 레이저 조사 시 SKBR3 세포 사멸을 특이적으로 유도하는 효과적인 광흡수제 역할을 할 수 있음을 확인했습니다. 요약하면, Her2-GPH NP는 유방암의 조기 비침습적 진단 및 보조 요법을 용이하게 할 수 있는 큰 잠재력을 지닌 새로운 표적 치료학적 제제임이 입증되었습니다.
유방암은 전 세계 여성의 암 관련 사망의 주요 원인입니다[1]. 유방암으로 인한 사망을 효과적으로 줄이는 열쇠는 조기에 정확한 진단이다[2]. 최근 수십 년간의 발전에도 불구하고 현재의 진단 및 치료 전략은 유방암의 조기 발견과 정확한 치료에 여전히 한계가 있습니다[3]. 따라서 초기 단계와 무증상 단계에서 유방암에 대한 창의적이고 새로운 전략을 모색하는 것이 필요합니다.
하나의 플랫폼 내에서 진단 및 치료 접근법의 조합을 포함하는 진단학은 개인화 의료 발전에 중요한 역할을 할 것으로 예상됩니다[4]. 일반적으로, 치료학적 제제는 세포 또는 분자 수준에서 유방암을 동시에 모니터링하고 치료할 수 있는 가능성을 감안할 때 분자 영상화 및 치료 기능을 단일 나노입자에 통합합니다[5]. 임상에서 초음파(US)와 자기공명영상(MRI)은 유방암의 진단 및 병기결정에 일반적으로 사용되는 두 가지 방법입니다[6]. US 영상은 높은 안전성, 실시간 측정, 용이한 가용성의 장점을 보여주며, 조영증강초음파(CEUS)는 유방 병변의 감지에 있어 민감도와 특이도를 향상시켰다[7]. 그러나 미국 영상의 적용은 여전히 상대적으로 제한된 공간 및 해부학적 해상도에 국한되어 있습니다. MRI는 상대적으로 긴 영상 시간과 제한된 감도를 가지고 있으면서도 우수한 공간 해상도와 연조직 대비를 가진 영상을 제공할 수 있습니다[8, 9]. 따라서 초음파와 MRI의 기능을 결합하여 유방암에 대한 보다 보완적이고 시너지 효과적이고 정확한 정보를 제공하는 것은 의미가 있습니다[10]. 또한 수술과 보조 화학요법이 유방암의 일차적 치료법이지만 심각한 합병증과 다제내성 증가 등의 단점도 갖고 있다. 근적외선(NIR) 레이저와 광흡수체를 이용한 광열 치료(PTT)는 최소 침습성과 우수한 제어성으로 인해 기존 치료에 대한 효과적인 대안으로 최근 광범위한 관심을 불러일으켰습니다[11, 12]. 따라서 US/MR 영상과 PTT를 하나의 플랫폼으로 결합하여 이중 모드 영상 유도 및 모니터링되는 유방암 광열 절제를 달성하는 것은 큰 가치가 있을 것입니다.
최근에, 나노 물질의 준비는 암 진단학의 잠재적 응용 분야에서 상당한 발전을 이루었습니다. 우리 모두가 알고 있듯이, 뛰어난 생체 적합성과 생분해성으로 인해 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)) 기반 나노 구조는 약물 전달 시스템 및 분자 이미징에 사용하기 위해 널리 조사되었습니다[13, 14]. 액체 퍼플루오로카본(PFC)인 퍼플루오로옥틸 브로마이드(PFOB)는 높은 산소 용해도, 소수성 및 소수성으로 인해 새로운 초음파 조영제(UCA)를 개발하기 위해 PLGA와 같은 고분자 쉘 내에 캡슐화되었습니다[15, 16]. 또한 초상자성 산화철 나노입자(SPIO)는 생체적합성이 우수하고 명암비 향상이 우수하여 생물체의 해부학적 정보를 얻기 위한 MR 분자 프로브로 큰 주목을 받고 있습니다[17,18,19].
또 다른 유망한 나노플랫폼은 금(Au) 나노구조로, 우수한 생체적합성과 독특한 광학 및 전기적 특성으로 인해 생물학 및 의학 연구에 널리 사용됩니다[20]. 구형 금 나노물질의 한 종류인 금 나노쉘은 근적외선 영역에서 상당한 표면 플라즈마 공명(SPR) 흡수를 나타내어 PTT에서 주변의 건강한 세포에 영향을 미치지 않고 암세포를 선택적으로 죽일 수 있도록 합니다[21]. 또한 Au 나노쉘로 코팅된 PLGA 마이크로캡슐이 미국 분자 이미징에 사용될 수 있다고 보고되었습니다[22]. 암의 진단학을 위한 "쉘 코어 구조"로서 Au 나노쉘과 폴리머의 조합에 많은 연구가 집중되었습니다. Keet al. Au-nanoshelled 폴리(락트산) 마이크로캡슐을 기반으로 다중 모드 영상 및 PTT를 위한 일련의 검사학 제제를 개발했습니다[23, 24]. Luet al. 암의 형광 이미징 및 광열화학 요법을 위해 독소루비신이 로딩된 고분자 금 나노쉘을 준비했습니다[25]. 그러나 이러한 NP가 직면한 일반적인 문제는 표면에 고친화성 결합 리간드가 부족하여 진단 및 치료 효과를 최대화하기 위해 높은 특이도로 특정 표적 세포를 인식하거나 결합할 수 없다는 것입니다. 또한, 우리가 아는 한, 이중 모드 공동 진단 및 유방암의 PTT를 위한 표적화된 Au-나노쉘 PLGA 하이브리드 나노플랫폼을 조사하는 데 전념한 연구는 거의 없습니다.
지금까지 유방암에 대해 고려된 분자 표적 중 세포막 표면 결합 수용체 티로신 키나아제인 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2)는 유방암의 위치 및 식별을 위한 중요한 바이오마커로 가장 일반적으로 사용된다[26, 27 ]. 이는 종양 공격성, 높은 재발률 및 불량한 예후와 관련된 인간 원발성 유방암의 약 25-30%에서 과발현됩니다[28, 29]. 따라서 Her2를 표적으로 하는 치료학적 제제를 제조하는 것은 유방암의 조기 발견 및 치료를 개선하는 분야에서 번창하고 있습니다.
우리 연구에서 기본 아이디어는 유방암의 조기 진단과 정확한 치료에 전념하는 이중 모드 US/MR 영상과 PTT를 통합한 Her2 기능화된 금-나노쉘 자기 하이브리드 나노입자(Her2-GPH NP)를 개발하는 것입니다. 에이전트는 PFOB 및 SPIO를 PLGA NP로 캡슐화한 다음 표면에 금 나노쉘을 코팅한 다음 항-Her2 항체와 접합하여 구성되었습니다(그림 1). Her2-양성 유방암 SKBR3 세포에서 제제의 충분한 축적은 제제의 항체-매개 표적 특이성 및 나노스케일 크기에 의해 달성될 수 있을 것으로 예상된다. 본 연구는 또한 시험관 내 US/MR 조영증강 영상과 NIR 흡수 Au에 의해 유도된 유방암 세포의 표적 PTT 효과를 제공하기 위한 이중 모드 분자 프로브로 제제를 사용하는 가능성을 검증하기 위해 설계되었습니다. 나노쉘.
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Her2-GPH NP의 제조 절차의 개략도
폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA, 카르복실산 말단, 락타이드:글리콜리드 50:50, Mw 24,000–38,000), 폴리알릴아민 염산염(PAH, Mw 17,500), 사염화금(III) 산 삼수화물(HAuCl 4 ·3H2 O) Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 입수했습니다. 평균 직경이 10 nm인 올레산 코팅된 초상자성 산화철 나노입자(OA-SPIO)는 Shanghai So-Fe Biomedicine Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 구입했습니다. 퍼플루오로옥틸 브로마이드(PFOB), 폴리비닐 알코올(PVA, 가수분해된 87-89%, 저분자량), 1-(3-다임-틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 염산염(EDC) 및 N -히드록시숙신이미드(NHS)는 Aladdin Chemistry Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 입수했습니다. 카르복실 말단 폴리(에틸렌 글리콜)(SH-PEG-COOH, Mw 2000) 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 항-Her2 항체는 Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd.(Xi'an, 중국)에서 입수했습니다. ) 및 Abcam(미국 매사추세츠주 케임브리지). 사용된 다른 모든 시약은 분석 등급이었습니다.
PFOB/SPIOs@PLGA NPs는 적응된 오일/물 에멀젼 용매 증발 방법을 사용하여 제작되었습니다[24, 30]. 간단히 말해서, 헥산(0.5 mL, 20 mg/mL) 중 올레산 코팅된 SPIO를 PLGA(100 mg) 및 PFOB(60 μL)를 용해하는 메틸렌 클로라이드(3.6 mL)에 첨가했습니다. 생성된 유기상을 미리 냉각된 PVA 수용액(20 mL, 2%, w /v ). 그 후, 시스템은 80% 출력 진폭 설정에서 빙수조에서 프로브 초음파 처리를 사용하여 2분 동안 유화되었습니다. 그 후, 에멀젼을 실온에서 5시간 동안 교반한 다음 원심분리(16,000rpm, 5분, 15°C, Avanti J-25, Beckman Coulter)하고 탈이온수(DI water)로 두 번 세척하여 PFOB/SPIO를 얻었다. PLGA NP.
첫째, 평균 직경이 5 nm인 구연산염으로 안정화된 금 나노입자가 이전에 보고된 대로 준비되었습니다[21]. 한편, PFOB/SPIOs@PLGA NPs 현탁액(1 mL)을 PAH 용액(0.5 mol/L NaCl 수용액에 1.0 mg/mL)에 30분 동안 혼합한 후 원심분리(15,000 rpm, 10 min, 15 )하였다. ) 및 탈이온수로 2회 세척하였다. 그런 다음, 혼합물을 시트레이트로 안정화된 금 나노입자 현탁액(100ml)에 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 원심분리/세척 단계를 반복한 후 Au NP 코팅된 PFOB/SPIOs@PLGA NP를 HAuCl4에 재분산했습니다. 용액(2 mL, 1% w /v ) 자기 교반하에. 다음으로, 새로 준비된 히드록실아민 염산염 용액(NH2 OH·HCl, 0.3 mL, 0.5 mol/L)을 첨가하여 HAuCl4을 감소시켰습니다. PFOB/SPIOs@PLGA NPs의 표면에 Au 나노쉘을 형성합니다.
제조된 PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs 수용액(1 mL, 1 mg/mL)을 SH-PEG-COOH(5 mg)와 혼합하고 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 원심분리(16,000 rpm, 20 min, 15 °C) 및 2회 세척 후 침전물을 인산완충식염수(PBS)에 분산시켰다. 다음으로 EDC(10 mg)와 NHS(10 mg)를 넣고 상온에서 2시간 동안 교반하여 pegylated NPs의 carboxyl acid group을 활성화시킨 후, 원심분리/세척을 반복하여 활성화된 NPs(GPH NPs)를 얻었다. 단계. 그 후, FITC로 표지된 항-Her2 항체(10 μL, 0.38 mg/mL)를 활성화된 NP 분산액에 첨가하고 등온 진탕기에서 90분 동안 배양했습니다. 마지막으로, Her2 기능화된 PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs(Her2-GPH NPs)를 얻기 위해 원심분리/세척 단계에 의해 유리 항체를 제거했습니다.
Her2-GPH NP의 표면 구조와 형태는 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM, Hitachi S-4800, Tokyo, Japan)으로 특성화되었다. 고해상도 투과 전자 현미경(TEM, JEM-2100; JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 탄소 코팅된 Cu 그리드에 샘플을 담가 내부 구조를 확인했습니다. 샘플의 해당 에너지 분산 X선 분광법(EDS)(금 스퍼터링 공정 없음)을 TEM에 부착하여 생성된 NP의 원소 조성을 분석했습니다. Her2-GPH NP의 유체역학적 크기와 제타 전위는 동적 레이저 산란(DLS) 기기(Zetasizer Nano ZS3690; Malvern Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 측정되었습니다. UV-가시광 분광광도계(Beckman Coulter DU 730, USA)를 사용하여 다양한 준비 단계에서 제제의 UV-가시광 흡수 스펙트럼을 얻었다. Her2-GPH NP의 Au 및 Fe 원소의 양은 유도 결합 플라즈마 원자 방출 분광법(ICP-AES, Vistampxicp Varian, USA)에 의해 평가되었습니다.
Her2-GPH 나노입자의 광열 성능은 근적외선 레이저 조사 시 온도 상승을 모니터링하여 평가되었습니다. 다양한 농도의 Her2-GPH NPs 수용액(50, 100, 150, 200 μg/mL)에 808 nm 레이저(1 W/cm2 ) 석영 큐벳(총 부피 1 mL)에서 10분 동안 용액의 온도를 FLIR A300 열화상 카메라로 10초마다 측정했습니다. 물질의 광열 안정성을 평가하기 위해 조사 전과 후에 물질의 흡수 스펙트럼을 획득하였다. DI water는 비교를 위해 동일한 조건에서 조사되었습니다.
Her2를 과발현하는 인간 유방암 SKBR3 세포주(SKBR3 세포)와 Her2를 저발현하는 인간 유방암 MDA-MB-231 세포주(MDA-MB-231 세포)는 Institute of Biochemistry and Cell Biology(중국 상하이)에서 가져온 것입니다. 그들은 20% 소태아혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 둘베코의 변형된 독수리 배지(DMEM, Gibco Life Technologies, Grand Island, NY, USA)에서 배양되었습니다. 모든 세포는 37 °C 및 5% CO2 환경에서 성장했습니다. .
Her2-GPH NP의 시험관내 세포독성은 SKBR3 및 MDA-MB-231 세포에 대한 세포 계수 키트-8 분석법(CCK-8, Dojindo Molecular Technologies Inc., 일본)에 의해 평가되었다. 두 종류의 세포를 각각 96웰 플레이트에 1 × 10 4 의 밀도로 시딩했습니다. 웰당 24 시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 제거한 후, 세포에 다른 농도(0, 10, 20, 50, 100, 200 μg/mL)의 Her2-GPH 나노입자를 처리하고 12시간 또는 24시간 동안 추가로 배양하였다. 그런 다음, CCK-8 용액(100 μL DMEM 중 10 μL CCK-8)을 첨가하고 추가 2 시간 동안 인큐베이션했습니다. 마지막으로 각 웰의 광학 밀도(OD)는 450 nm의 파장에서 마이크로플레이트 리더(Thermo science Multiskan MK3)를 사용하여 측정되었습니다.
SKBR3 및 MDA-MB-231 세포를 유리 바닥 세포 배양 접시(Φ =20 mm) 밀도 2 × 10 4 세포/웰을 24시간 동안 유지한 다음, 비표적 그룹, 표적 그룹 및 표적 억제 그룹을 포함하여 각각 3개의 그룹으로 나누었습니다. 비표적군으로 두 종류의 세포는 100 μL GPH NP로 처리하였고, 표적군의 세포는 100 μL Her2-GPH NP로 처리하였다. 표적 억제 그룹에서 세포는 Her2-GPH NP로 처리되기 전에 30분 동안 유리 항-Her2 항체(20 μL)와 함께 배양되었습니다. 각각 30분의 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 그런 다음 세포를 핵 염색제(DAPI; Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China)로 10분 동안 염색하고 PBS로 다시 세척하였다. 마지막으로 LSCM(Laser Scanning Confocal Microscopy)을 사용하여 세포를 관찰했습니다(Leica TCS SP5 II, Leica Microsystems Ltd., Mannheim, Germany).
SKBR3 및 MDA-MB-231 세포를 상기 기재된 바와 같이 배양 및 처리하였고, 그룹화는 LSCM 분석과 일치하였다. 모든 세포를 트립신으로 분해한 다음 2 × 10 5 의 밀도로 유세포 분석(FCM) 전에 PBS에 재현탁했습니다. 튜브당 세포. 세포의 형광 강도는 유세포 분석기(FC500MCL, Beckman Coulter, Fullerton, CA)로 측정했습니다. SKBR3 및 MDA-MB-231 셀은 게이트를 설정하기 위한 블랭크 컨트롤로 사용되었습니다. 그런 다음 FL1의 전압 및 형광 보상을 조정하여 세포의 자발적 형광이 10 1 이내가 되도록 했습니다. 형광 히스토그램의 세포를 NP와 함께 배양한 후, 블랭크 그룹으로부터의 형광 강도의 편차는 세포에 대한 NP의 결합 속도를 반영하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행되었습니다.
Her2-GPH NP의 시험관내 용액 초음파 영상화는 Mylab Twice 초음파 시스템 장치(Esaote SpA, Genova, Italy)를 사용하여 수행되었습니다. Her2-GPH 나노입자를 탈기된 탈이온수에 다양한 농도(0.1, 0.5, 1, 1.5, 2 mg/mL)로 분산시키고 Eppendorf 튜브(2 mL)에 주입한 다음 튜브를 초순수 탱크에 담그었습니다. 초음파 검사는 기계적 지수(MI) =0.01이고 주파수 범위는 3–9 MHz인 2차원(2D) 회색조 모드와 대비 강화 모드에서 LA522 변환기를 사용하여 수행되었습니다. 이미지는 튜브의 세로 단면에서 획득하고 QontraXt V3.06 소프트웨어를 사용하여 시간-강도 곡선(TIC)의 정량적 분석을 위해 기록되었습니다.
SKBR3 세포 및 MDA-MB-231 세포를 6웰 플레이트에서 2 × 10 6 의 밀도로 배양했습니다. 24 시간 동안 /well, 대조군, 비표적군, 표적군 3개 군으로 나누었다. 비표적군과 표적군의 세포에 각각 GPH NP(100 μg/mL) 및 Her2-GPH NP(100 μg/mL)를 30분 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 PBS로 세척하고, 소화시키고, PBS(0.5 mL)로 시험관에 재분산시켰다. 아가로스 젤(1%)을 20mL 유리 접시에 준비했습니다. 세포 표면에 대한 나노입자의 표적 초음파 영상 효과를 시뮬레이션하기 위해 6개 그룹의 시험관에서 세포 현탁액을 1mL 주사기로 개별적으로 추출하고 한천 겔에 천천히 주입했습니다. 그레이 스케일 모드(이득 =70%, 중심 주파수 =22 MHz, MI =0.06)에서 SL3116 변환기를 사용하여 이미징을 수행했습니다. 스캔 후 초음파 이미지의 각 그룹에서 관심 영역(ROI)을 그렸습니다. 각 ROI의 회색조 값은 Her2-GPH NP의 표적 초음파 영상 효과를 평가하기 위해 이미지 분석 소프트웨어(DigSubAna; Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China)를 사용하여 정량적으로 분석되었습니다.
Her2-GPH NP의 MR 영상화 및 이완성 측정은 0.5 T 시스템(Shanghai Niumag Corporation NM120-Analyst)을 사용하여 수행되었습니다. Her2-GPH NP는 다양한 Fe 농도(0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08 mM) 및 T의 탈이온수에 현탁되었습니다. 2 - 샘플의 가중 MR 이미지는 스핀 에코 시퀀스를 사용하여 획득했습니다(TR =2000 ms; TE =100 ms; 슬라이스 두께 =3 mm; FOV =3 × 3 cm). 가로 이완 시간(T 2 ) NPs 수용액의 물 양성자도 측정되었고, 횡이완도(r 2 )는 1/T의 곡선 맞춤을 통해 결정되었습니다. 2 (s −1 ) 대 Fe 농도(mM).
SKBR3 및 MDA-MB-231 세포의 그룹화 및 처리는 표적화된 US 영상 분석과 일치했습니다. 비표적 GPH NP(100 μg/mL) 또는 표적 Her2-GPH NP(100 μg/mL)와 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 PBS로 세척하고, 소화하고, 크산탄 검(1 mg/mL)에 분산시켰습니다. . 모든 샘플은 위에서 설명한 것과 동일한 매개변수로 스핀 에코 시퀀스를 사용하여 스캔되었습니다. 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 신호 강도의 정량적 분석을 위해 각 이미지의 ROI를 정의했습니다.
Her2-GPH NP의 표적화된 PTT 효과를 시각화하기 위해 SKBR3 세포를 유리 바닥 세포 배양 접시(Φ =20 mm) 1 × 10 5 밀도 세포/웰을 24시간 동안 24시간 동안 처리하고, 레이저 조사가 있거나 없는 DMEM 대조군, 레이저 조사가 있거나 없는 표적 물질 그룹 및 레이저 조사가 있는 비표적 물질을 포함하여 각각 5개 그룹으로 나누었다. 표적 그룹은 Her2-GPH NP(100 μg/mL)를 포함하는 DMEM 분산액으로 30분 동안 처리하고 비표적 그룹은 동일한 조건에서 GPH NP(100 μg/mL)로 처리했습니다. 레이저 조사 그룹의 세포에 NIR 레이저(808 nm, 1 W/cm 2 )를 조사했습니다. ) 10 분 동안 37 °C에서 2 시간 동안 추가로 배양합니다. 그런 다음, 살아있는/죽은 세포 분석 키트(Life Technologies, Grand Island, NY)를 사용하여 세포 생존력을 평가했습니다. 마지막으로 LSCM을 사용하여 염색된 세포의 이미지를 획득했습니다. 광열 세포독성을 정량화하기 위해 SKBR3 세포(1 × 10 4 웰당)을 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그룹화는 상기와 일치하였고, 세포 생존력은 CCK-8 분석에 의해 시험되었다. 다양한 농도 및 레이저 조사에서 Her2-GPH NP의 광열 세포 독성을 추가로 정량적으로 평가합니다. 세포를 다양한 농도(0, 50, 100, 150, 200μg/mL)의 Her2-GPH NP를 함유하는 DMEM 분산액과 함께 인큐베이션하였다. PBS(10 mM, pH 7.0)로 세척한 후 NIR 레이저(808 nm, 1 W/cm2 )로 세포를 조사했습니다. ) 10 분 동안 그리고 2 시간 동안 추가로 배양합니다. 그런 다음 세포 생존율도 CCK-8 분석에 의해 결정되었습니다. 결과는 평균 ± 표준편차(n =4).
유방 종양 조직에서 Her2의 이종 발현을 시뮬레이션하기 위해 SKBR3 세포와 MDA-MB-231 세포를 서로 다른 비율(0:100%, 25:75%, 50:50%, 75:25%, 100)로 공동 배양했습니다. :0%). 모든 세포에 Her2-GPH NP(200 μg/mL)를 30분 동안 처리하고 NIR 레이저(808 nm, 1 W/cm2 )를 조사했습니다. ) 10 분 동안. 2 시간 더 배양한 후, 세포 생존율을 CCK-8 분석으로 분석했습니다. 결과는 평균 ± 표준편차(n =4).
정량적 데이터는 평균 ± 표준편차(mean ± SD)로 표현하였다. 여러 그룹 간의 통계적 차이는 분산 분석(ANOVA)에 의해 결정되었으며 두 개의 독립적인 샘플의 데이터는 Student's t를 사용하여 비교되었습니다. 테스트. 피 <0.05는 통계적으로 유의한 차이로 간주되었습니다. 통계 분석은 SPSS v17.0(IBM, Armonk, NY, USA)을 사용하여 수행되었습니다.
PFOB/SPIOs@PLGA NP는 오일/물 에멀젼 용매 증발 공정을 통해 제조되었습니다. SEM 이미지(그림 2a)는 PFOB/SPIOs@PLGA NP가 균일한 구형 형태와 매끄러운 표면을 가지고 있음을 보여줍니다. TEM(그림 2b)에서 볼 수 있듯이 PFOB/SPIO@PLGA NP의 코어와 쉘 사이에 전자 밀도의 명백한 차이가 있었는데, 이는 NP 내부에 PFOB가 캡슐화되었음을 시사합니다. 게다가, 더 높은 배율의 삽입 이미지에 묘사된 바와 같이, SPIO의 존재는 PFOB/SPIO@PLGA NP의 쉘 및 액체 PFOB 코어 영역에서 깊은 회색 반점으로 입증되었습니다. PFOB/SPIOs@PLGA NPs의 평균 직경은 약 248.3 nm이었고 다분산 지수는 0.037이었고 제타 전위는 DLS 측정에 따라 약 - 14.7 mV였습니다. 따라서 PFOB/SPIOs@PLGA NPs는 양전하 PAH를 쉽게 흡수하여 평균 크기가 5-7 nm인 음전하 Au 나노 입자를 후속적으로 부착할 수 있으며, 이는 PFOB 표면 주위에 금 나노쉘의 성장을 핵으로 만드는 종자로 사용되었습니다. /SPIOs@PLGA 시딩 절차를 통한 NPs.
<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-019-3053-4/MediaObjects/ 11671_2019_3053_Fig2_HTML.png?as=webp">
Her2-GPH NP의 특성. 아 SEM(스케일 =2 μm) 및 b PFOB/SPIO@PLGA NP의 TEM(스케일 =200 nm) 이미지; ㄷ SEM(scale =1 μm) 및 d Her2-GPH NP의 TEM(스케일 =100 nm) 이미지; 이 EDS 요소 매핑 이미지는 Her2-GPH NP에서 C, O, Fe, F, Br 및 Au 요소의 분포를 보여줍니다.
Her2-GPH NP는 항-Her2 항체를 SH-PEG-COOH를 통해 PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs에 연결하여 제조되었습니다. 이 과정에서 PEG화된 PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs의 카르복실산 그룹을 활성화하고 항체에 대한 아미노 그룹의 공유 결합을 촉진하기 위해 고전적인 카보디이미드 기술이 사용되었습니다[31]. SEM 및 TEM 이미지(그림 2c, d)에서 볼 수 있듯이 Her2-GPH NP는 표면이 거친 잘 정의된 구형 형태를 유지했으며 직경이 수십 나노미터인 조밀한 Au NP가 표면에서 명확하게 볼 수 있었습니다. 금 나노쉘의 성공적인 제조를 나타내는 NP. Her2-GPH NP의 EDS 요소 매핑(그림 2e) 및 요소 분석 결과(그림 3a)는 많은 양의 Au 요소와 Fe, F 및 Br 요소의 존재를 명확하게 나타내어 SPIO 및 PFOB의 성공적인 캡슐화를 나타냅니다. 및 Au 나노쉘의 형성. 또한, Her2-GPH 나노입자에서 Au 및 Fe 원소의 함량은 ICP-AES에 의해 각각 67.71 ± 7.34% wt.% 및 2.13 ± 0.52% wt.%로 평가되었습니다.
<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-019-3053-4/MediaObjects/ 11671_2019_3053_Fig3_HTML.png?as=webp">
Her2-GPH NP의 특성. 아 Her2-GPH NP의 EDS 요소 분석; ㄴ 다양한 준비 단계에서 Her2-GPH NP의 UV-Vis 흡수 스펙트럼; ㄷ 크기 분포 및 d Her2-GPH NP의 제타 전위
또한 다양한 준비 단계에서 Her2-GPH NP의 UV-Vis 흡수 스펙트럼도 조사했습니다(그림 3b). PFOB/SPIOs@PLGA NPs는 400~800 nm 범위에서 명백한 흡수 피크를 나타내지 않은 반면 Au NPs는 약 520 nm에서 플라즈마 공명 피크를 나타냈습니다. PFOB/SPIO@PLGA@Au NP와 Her2-GPH NP는 모두 600~900 nm(NIR 영역) 범위의 연속적인 넓은 피크를 나타냈는데, 이는 부착된 Au 종자가 씨딩 과정을 통해 클러스터링될 만큼 충분히 크게 성장했기 때문입니다. NIR 영역의 광범위한 흡수 스펙트럼은 Her2-GPH NP가 NIR 광열 치료를 위한 광흡수체로 작동할 수 있음을 보장합니다. 또한, PFOB/SPIOs@PLGA NP와 비교하여 Her2-GPH NP는 0.18의 다분산 지수와 함께 282.3 nm의 증가된 크기 분포를 가졌습니다(그림 3c). 그리고 제타 전위는 − 31.3 mV로(그림 3d) 안정성이 양호함을 의미합니다.
Her2-GPH NPs 용액의 광열변환 효과는 NIR 레이저(808 nm, 1 W/cm 2 조사)를 조사하여 평가되었습니다. ), 온도 변화는 10 s마다 IR 열화상 카메라로 모니터링했습니다. 10분의 레이저 조사 후, Her2-GPH NP의 농도가 증가함에 따라 온도가 상승했음을 의미하는 다양한 농도의 Her2-GPH NP 용액의 열화상 색상이 변경되었습니다(그림 4a). 광열 온도 측정은 이미징 데이터와 일치했습니다. 노출 시간과 농도가 증가함에 따라 나노입자 용액의 온도가 상승함을 관찰할 수 있었습니다(그림 4b). 구체적으로, Her2-GPH 나노입자 용액의 온도 증가는 0.2 mg/mL 농도에서 18.5 °C인 반면, 탈이온수에서는 1.2 °C만 증가했습니다. 암세포를 죽이기 위해서는 기존 연구들에 따르면 온열요법(40~47 °C)까지 온도를 올려야 했다[32]. 그러나 시험관 내 열 손실로 인해 약 10 °C의 온도 상승은 세포 사멸을 유도하기에 충분하지 않습니다[33]. Her2-GPH NP는 상대적으로 낮은 농도에서 온도를 약 18 °C 증가시킬 수 있으므로 고열에 의해 암세포를 죽일 가능성이 있습니다. 또한 Her2-GPH NP의 광열 안정성을 확인하기 위해 레이저 조사 전후에 샘플의 UV 가시 NIR 흡수 스펙트럼을 수집했습니다. 그리고 흡수 스펙트럼은 레이저 노출 전후에 거의 변하지 않으므로(그림 4c) Her2-GPH NP가 암의 PTT에 대한 효율적인 광흡수체 역할을 할 수 있습니다.
<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-019-3053-4/MediaObjects/ 11671_2019_3053_Fig4_HTML.png?as=webp">
Her2-GPH NP의 광열 효과. 아 NIR 열화상 및 b NIR 레이저(808 nm, 1 W/cm 2)로 조사한 후 다양한 농도에서 Her2-GPH NP의 온도 변화 ,10 분); ㄷ 광열 조사 분석 전후의 UV-Vis-NIR 흡수 스펙트럼
나노입자의 생체적합성은 생물의학 응용 분야의 주요 관심사 중 하나이며 먼저 결정되어야 한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 따라서 CCK-8 분석을 사용하여 유방암 MDA-MB-231 및 SKBR3 세포에서 Her2-GPH NP의 세포 독성을 평가했습니다(그림 5a 및 b 참조). 대조군과 비교하여 Her2-GPH NPs 처리된 MDA-MB-231 및 SKBR3 세포의 생존율은 10~200μg/mL 범위의 농도에서 24시간 동안 90% 이상 유지되어 세포 독성이 낮고 생체 적합성이 우수함을 나타냅니다. 결과적으로 NP는 추가 세포 실험 및 임상 연구에 대한 안전성을 보장할 수 있습니다.
<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-019-3053-4/MediaObjects/ 11671_2019_3053_Fig5_HTML.png?as=webp">
a의 세포 생존율 MDA-MB-231 및 b 12 h 및 24 h 동안 Her2-GPH NPs(0, 10, 20, 50, 100, 200 μg/mL)의 다양한 투여량에서 SKBR3 세포(데이터는 평균 ± SD, n로 표시됨) =4)
Fluorescein isothiocyanate(FITC)는 면역 검출을 위한 녹색 형광 프로브로 널리 사용되며 여러 종류의 단일 클론 항체에 쉽게 결합할 수 있습니다. 따라서, 우리는 FITC 표지된 항-Her2 항체를 선택하고, NP와 항체의 연결은 면역형광 분석에 의해 더 시각적으로 관찰될 수 있었습니다. GPH NP에 대한 항-her2 항체의 결합을 확인하기 위해 GPH NP 및 Her2-GPH NP를 접시(Φ =20 mm) CLSM 분석의 경우. 그림 6과 같이 Her2-GPH NP와 GPH NP 모두 명시야에서 명확하게 관찰할 수 있었습니다. GPH NP는 형광 신호를 나타내지 않았지만 Her2-GPH NP는 FITC 및 병합 채널에서 밝은 녹색 형광을 나타내어 항-her2 항체와 GPH NP의 성공적인 접합을 확인했습니다.
<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-019-3053-4/MediaObjects/ 11671_2019_3053_Fig6_HTML.png?as=webp">
명시야, FITC 형광 및 병합된 채널에서 Her2-GPH NP 및 GPH NP의 공초점 현미경 이미지(스케일 막대 =5 μm)
우리는 체외에서 Her2-GPH NP의 표적화 특이성을 확인하기 위해 LSCM을 활용했습니다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 표적화되지 않은 그룹(b)과 비교하여 표적화된 Her2-GPH 나노입자와 함께 배양된 SKBR3 세포(a)는 세포막 표면에 밝은 녹색 형광 신호를 나타내어 Her2 항체를 운반하는 나노입자를 나타냅니다. Her2 양성 세포에 효과적으로 결합할 수 있습니다[34]. SKBR3 세포에서 Her2-GPH NP의 분포를 명확하게 관찰하기 위해 밝은 이미지(a1), FITC 형광 이미지(a2), 핵 이미지(a3) 및 오버레이 이미지(a4)를 제공했습니다. NP는 배양 시간이 짧기 때문에 주로 세포막 표면에 분포하고 검은 반점으로 응집됩니다. 경쟁 연구에서 SKBR3 세포를 과량의 유리 항 Her2 항체로 사전 처리한 다음 Her2-GPH NP와 함께 배양했을 때 형광 신호는 무시할 수 있었습니다(그림 7c). 이러한 결과는 Her2-GPH NP의 표적화 행동이 수용체 매개이고 과잉의 유리된 항-Her2 항체에 의해 차단될 수 있음을 입증하였다[26]. 또한 동일한 조건에서 Her2-GPH NP를 처리한 MDA-MB-231 세포에서는 형광이 거의 검출되지 않아(그림 7d), Her2-GPH NP가 Her2 수용체를 과발현하는 SKBR3 세포에 특이적으로 결합함을 확인했습니다.
<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-019-3053-4/MediaObjects/ 11671_2019_3053_Fig7_HTML.png?as=webp">
표적 Her2-GPH NP와 배양된 SKBR3 세포의 공초점 현미경 이미지 및 유세포 분석 결과(a /a1 –a4 , e ) 및 타겟이 아닌 GPH NP(b , f ), Her2-GPH NP와 함께 배양된 유리 Her2 항체 전처리 SKBR3 세포(c , 지 ) 및 Her2-GPH NP와 함께 배양된 MDA-MB-231 세포(d , h ). a1 명시야의 이미지; a2 DAPI 채널의 이미지; a3 FITC 채널의 이미지; 및 a4 병합된 채널의 이미지(스케일 바 =10 μm)
세포에 대한 Her2-GPH NP의 결합 속도는 FCM을 통해 추가로 정량적으로 평가되었다. 도 7에 명확하게 예시된 바와 같이, SKBR3 세포(e)에 대한 표적화된 NP의 결합율은 MDA-MB-231 세포(h)보다 현저히 높았다(86% ± 3.72% vs 2.31% ± 0.36%, 피 <0.001), Her2-GPH NP의 Her2 양성 세포에 대한 특정 표적화 능력을 나타냅니다. 또한, Her2-GPH NP는 과량의 유리 항-Her2 항체로 전처리된 SKBR3 세포에 대한 표적 결합이 거의 없었고(그림 7g), 표적 억제 그룹과 표적 그룹 사이에 상당한 차이가 있었다(3.16% ± 0.41 % 대 86% ± 3.72%, P <0.001). 위의 내용을 기반으로 FCM 결과는 Her2-GPH NP가 Her2 수용체를 과발현하는 SKBR3 세포를 인식하고 결합하는 특이적 표적화 능력을 갖고 표적화 행동이 수용체 매개라는 강력한 증거를 추가로 제공했습니다.
우리 연구에서 Her2-GPH NPs 용액의 미국 영상 효과는 Mylab Twice 초음파 시스템 장치를 사용하여 다양한 모드에서 시험관 내에서 평가되었습니다. 그림 8a에서 관찰할 수 있듯이 Her2-GPH NPs 용액으로 채워진 튜브는 2D 그레이스케일 및 CEUS 모드 모두에서 강한 점선 에코를 나타냅니다. 대조적으로, DI water는 에코로 나타났습니다. 또한, Her2-GPH 나노입자의 농도가 증가함에 따라 초음파 조영증강 신호가 점차 증가하였다. TIC에서 알 수 있듯이 Her2-GPH 나노입자의 평균 신호강도는 나노입자의 농도가 증가함에 따라 점차 증가하였고 CEUS 결과와 일치를 유지하였다. 2 mg/mL 농도의 제제는 0.1 mg/mL 농도의 NP보다 훨씬 더 강한 대조 향상 신호를 보였습니다(82 ± 0.69 dB 대 27 ± 6.7 dB, P <0.01), 더 강한 후방 산란이 NP의 더 높은 농도에 의해 생성됨을 나타냅니다. 위의 결과는 Her2-GPH NP가 시험관 내에서 만족스러운 대조 향상 효과를 가지며 이러한 대조 향상은 농도 의존적임을 나타냅니다. 또한 2 mg/mL 농도에서 Her2-GPH 나노입자의 초음파 영상화 시간의 길이도 조사되었다(그림 8b). Her2-GPH NP는 2 분 이전에 절묘한 대비 강화 신호를 보였고 시간이 지남에 따라 신호 강도가 점차 감소했습니다. 그러나 임상 조영증강 초음파의 요구 사항을 충족할 수 있는 5 분 이내에 여전히 명백한 조영증강 신호가 있었습니다. UCA와 같은 기존의 가스 충전 미세 기포는 초음파에서 비선형 진동에 의해 혈액의 후방 산란 신호를 향상시킬 수 있지만 혈관 내 영상의 한계와 낮은 안정성으로 인해 조직 분자 평가에는 적합하지 않습니다[35]. 가스 충전제와 비교하여 액체 탄화불소 충전 PLGA 나노캡슐은 순환 반감기가 길어 음향 안정성이 있습니다[16]. 게다가, 우리의 이전 연구는 Au 나노쉘이 높은 원자 번호와 밀도로 인해 좋은 반사 특성을 갖는다는 것을 발견했습니다[36]. 따라서 우리는 PFOB로 채워진 PLGA 나노캡슐의 초음파 공명 특성과 Au 나노쉘의 뛰어난 에코 발생성을 결합하여 시험관 내에서 Her2-GPH NP의 후방 산란 신호를 현저하게 향상시켰습니다.
<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-019-3053-4/MediaObjects/ 11671_2019_3053_Fig8_HTML.png?as=webp">
아 서로 다른 농도(0, 0.1, 1, 1.5, 2 mg/mL). ㄴ 시간 경과에 따른 Her2-GPH NP(2 mg/mL)의 시험관 내 미국 이미지
유방암 세포에 대한 Her2-GPH NP의 표적 초음파 영상 능력은 Mylab Twice 초음파 시스템 장치를 사용하여 2D 그레이 스케일 모드에서 평가되었습니다. 도 9a에 도시된 바와 같이, 나노입자 처리 세포와 대조군 세포 모두 명확한 경계를 갖는 겔에서 균일한 고에코 밴드를 나타냈다. Her2-GPH 나노입자로 처리된 SKBR3 세포의 에코 발생 밴드는 비표적 및 대조군 SKBR3 세포의 에코 발생 밴드보다 밝고 밀도가 높음을 분명히 관찰할 수 있었습니다. 그러나 표적 또는 비표적 NP로 처리된 MDA-MB-231 세포에서는 유의미한 에코 신호 차이가 관찰되지 않았습니다. 정의된 ROI를 기반으로 이미지의 평균 회색조 값을 추가로 정량화했으며 그 결과를 그림 9b에 표시했습니다. 표적화된 Her2-GPH NP로 처리된 SKBR3 세포의 회색조 값은 SKBR3 비표적 및 대조군보다 유의하게 높았다(P <0.01). 더욱이, 표적화된 Her2-GPH NP로 처리된 SKBR3 세포는 동일한 NP로 처리된 MDA-MB-231 세포에 비해 더 높은 회색조 값을 보였습니다(P <0.05). 이러한 결과는 Her2-GPH NP가 Her2 양성 SKBR3 세포에 특이적으로 결합할 수 있고 표적 세포의 초음파 분자 영상 효과를 향상시킬 가능성이 있음을 보여주었습니다.
<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-019-3053-4/MediaObjects/ 11671_2019_3053_Fig9_HTML.png?as=webp">
아 체외 초음파 영상 및 b 표적 Her2-GPH NP 또는 비표적 GPH NP로 처리된 MDA-MB-231 및 SKBR3 세포의 회색조 값 분석. MDA-MB-231 및 SKBR3 세포가 대조군으로 사용되었습니다(데이터는 평균 ± SD, *P로 표시됨 <0.05, **P <0.01, n =3)
SPIO는 T에서 집중적으로 조사되었습니다. 2 - 가중 MR 영상은 주변 물 양성자의 가로 이완 시간을 단축하는 능력으로 인해 MR 신호 강도를 감소시키고 표적 병변의 음성 대비 향상을 제공할 수 있습니다[37, 38]. 티 2 다양한 Fe 농도를 갖는 Her2-GPH NP의 대비 영상 능력을 0.5 T 자기장에서 평가하였다. 그림 10은 가로 이완율을 표시합니다(1/T 2 ) Her2-GPH NPs 수용액에서 철 농도의 함수로서의 물 양성자. 그리고 여유로움(r 2 )는 441.47 mM −1 로 기울기를 기준으로 계산되었습니다. s −1 , 이는 상용 SPIO 기반 MR 영상 조영제 페리덱스(152 mM −1 )의 2배 이상입니다. s −1 ) 동일한 자기장 강도에서 [39]. T가 높을수록 2 이완성은 폴리머 매트릭스 내부의 SPIO의 응집으로 인해 자기 NP의 크기가 상대적으로 커지고 자기 상호 작용이 향상되기 때문일 수 있습니다[37, 40]. 또한 T의 신호 강도는 2 - 가중 MR 영상은 철 농도가 증가함에 따라 점차 감소하여(그림 10b), Her2-GPH NP가 T에 대한 능력이 있음을 추가로 확인했습니다. 2 -가중 MR 조영제 영상.
<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-019-3053-4/MediaObjects/ 11671_2019_3053_Fig10_HTML.png?as=webp">
체외 MR 영상. 아 가로 이완율(1/T 2 ) 0.5 T 자기장에서 철 농도의 함수로서의 Her2-GPH NPs 수용액. ㄴ 티 2 - 스핀 에코 시퀀스를 사용하여 얻은 다양한 철 농도를 가진 Her2-GPH NP의 가중 MR 이미지. ㄷ 티 2 -가중 MR 이미지 및 d MDA-MB-231 및 SKBR3 세포와 함께 배양된 Her2-GPH NP(100 μg/mL) 및 GPH NP(100 μg/mL)의 신호 강도. MDA-MB-231 및 SKBR3 세포가 대조군으로 사용되었습니다(데이터는 평균 ± SD, *P로 표시됨 <0.05, **P <0.01, ***P <0.001, n =3)
SKBR3 및 MDA-MB-231 세포에 대한 Her2-GPH NP의 표적 MR 영상 효과는 시험관 내 T에 의해 확인되었습니다. 2 - 가중 MR 영상. 그림 10 c와 d에서 볼 수 있듯이, 표적화된 Her2-GPH NP로 처리된 SKBR3 세포는 현저한 음성 대비 향상을 보였고, 대조군 세포에 비해 신호 강도가 48% 감소했습니다(P <0.001). 그러나 비표적 GPH 나노입자 처리 SKBR3 세포의 MR 신호 강도는 거의 감소하지 않았다. 또한 Her2-GPH NP 또는 GPH NP로 표지된 MDA-MB-231 세포의 신호 강도는 대조군에 비해 유의하게 변화하지 않았습니다(P> 0.05). 또한 Her2-GPH NPs 처리된 SKBR3 세포는 MDA-MB-231 세포보다 더 높은 정도의 신호 강도 감소를 보였다(P <0.001), 두 셀을 서로 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 위의 결과는 함께 Her2-GPH NP가 T를 향상시킬 수 있음을 나타냅니다. 2 -수용체 매개 세포 특이적 흡수를 통한 가중 MR 영상 [41].
처음에 칼세인-AM/요오드화프로피디움(PI) 염색을 사용하여 시험관 내 표적 광열 세포독성을 시각적으로 평가했습니다. 비형광성 살아있는 세포 염색약인 Calcein AM은 세포막을 투과하고 가수분해하여 살아있는 세포에서 녹색 형광성 칼세인 염료를 생성할 수 있습니다. Propidium iodide(PI)는 죽은 세포의 DNA에 결합하여 적색 형광을 생성하는 죽은 세포 염색입니다[33]. 도 11a에 도시된 바와 같이, NIR 레이저 조사 또는 Her2-GPH NP를 별도로 사용했을 때 명백한 죽은 세포가 없었으며, 이는 레이저 조사 또는 NP 자체가 세포독성이 아님을 나타낸다. 마찬가지로, NIR 레이저와 함께 비표적 GPH NP로 처리한 세포는 세포 사멸을 거의 나타내지 않았습니다. 이에 반해 Her2-GPH 나노입자에 레이저를 조사할 경우 많은 수의 죽은 세포가 관찰될 수 있어 광열 효과를 표적으로 하여 온열 세포 사멸을 유도할 수 있음을 시사한다. 세포 생존력을 CCK-8 분석에 의해 추가로 정량적으로 평가하였다. 도 11b에 도시된 바와 같이, Her2-GPH 나노입자 및 레이저 조사로 처리된 SKBR3 세포는 대조군에 비해 세포 생존율에서 (62 ± 4.56%) 감소를 나타냈다(P <0.001). 또한, 10분 동안의 레이저 조사에서 표적 Her2-GPH NPs 그룹의 세포 생존율은 비표적 그룹보다 현저히 낮았습니다(38 ± 4.56% vs 87.6 ± 4.06%, P <0.05).
<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-019-3053-4/MediaObjects/ 11671_2019_3053_Fig11_HTML.png?as=webp">
시험관 내 표적 광열 분석. 아 다른 치료 그룹(Her2-GPH NP 그룹, 레이저 그룹, GPH NP + 레이저 그룹, Her2-GPH NP + 레이저 그룹)에서 칼세인-AM/PI로 염색된 SKBR3 세포의 공초점 현미경 이미지(스케일 막대 =100 μm). SKBR3 세포가 대조군으로 사용되었습니다. ㄴ 그림 11 a와 같이 처리 후 5개 그룹의 SKBR3 세포의 상대적인 세포 생존율 (평균 ± SD, *P로 표현된 데이터 <0.05, ***P <0.001, n =4); ㄷ NIR 레이저 조사(808 nm, 1 W/cm2 유무에 관계없이 다양한 농도(0, 50, 100, 150, 200 μg/mL)에서 Her2-GPH NP와 함께 배양된 SKBR3 세포의 세포 생존율 , 10 min) (mean ± SD로 표현된 데이터, *P <0.05, ***P <0.001, n =4)
또한 CCK-8 분석을 사용하여 다양한 농도에서 Her2-GPH NP의 광열 세포 독성을 추가로 정량적으로 평가했습니다. 도 11c에 도시된 바와 같이, NIR 레이저 조사 없이 Her2-GPH 나노입자로 처리된 SKBR3 세포의 생존율은 90% 이상을 유지한 반면, 레이저 조사 세포의 생존율은 Her2-GPH 나노입자의 농도가 증가함에 따라 유의하게 감소하였다. 동일한 농도에서 레이저를 조사하지 않은 세포와 비교하여 레이저 조사된 세포의 20% 미만만이 200 μg/mL 농도에서 생존할 수 있었습니다(P <0.001). 이러한 결과는 상대적으로 낮은 농도의 Her2-GPH NP가 SKBR3 세포를 죽이기에 충분한 온도 상승을 제공하기에 충분하다는 것을 추가로 확인시켜 주었습니다.
또한, 우리는 유방 종양 조직에서 Her2의 이종 발현을 시뮬레이션하기 위해 SKBR3 및 MDA-MB-231 세포를 다른 비율로 공동 배양했습니다. 그 결과, Her2-GPH 나노입자의 광열 유도 후 총 세포 생존율은 SKBR3 세포의 비율이 증가함에 따라 감소했으며, 다른 비율 그룹의 총 세포 생존율은 100% SKBR3 세포 그룹보다 유의하게 높았다( 피 <0.05) (추가 파일 1:그림 S1). 또한 Her2-GPH NP가 30분 동안 존재하는 경우 NIR 레이저로 유도한 후 총 세포 생존율이 비레이저 조사 세포보다 현저히 낮았습니다(P <0.05), 100% MDA-MB-231 세포 그룹 제외. 종합하면, Her2-GPH NP는 SKBR3 세포에 특이적으로 결합할 수 있고 광열 효과에 의해 암세포를 사멸시키도록 유도할 수 있는 큰 잠재력을 가졌다. SKBR3 세포에 대한 광열 온열 요법의 가능한 기전은 주로 암세포가 더 높은 온도에 노출되어 세포 내 단백질을 변성시켜 정상적인 세포 성장과 증식을 억제하는 데 기인해야 합니다[42].
이중 모드 US/MR 영상 및 표적화된 PTT를 통합한 Her2 기능화된 치료학적 제제인 Her2-GPH NP는 시험관 내에서 성공적으로 설계, 제작 및 조사되었습니다. 항-Her2 항체와의 접합에 의해, 제제는 높은 특이성과 민감도로 Her2를 과발현하는 유방암 SKBR3 세포를 인식하거나 결합할 수 있다. 또한, PFOB 및 SPIO의 공동 로딩 및 Au-나노쉘 PLGA "쉘 코어 구조"의 구성을 통해 생성된 Her2-GPH NP는 시험관 내 US 및 T에서 우수한 대비 향상을 제공합니다. 2 - 가중 MR 영상. 또한, Au 나노쉘의 형성은 제제가 유방암 세포에서 표적 NIR PTT를 위한 효율적인 광흡수제 역할을 할 수 있도록 합니다. 우리의 결과는 유방암의 공동 진단과 보조 요법의 통합을 위한 예비 탐색 연구를 제공하며 생체 내 추가 연구가 여전히 필요합니다.
현재 연구 중에 생성 및 분석된 데이터 세트가 이 문서에 포함되어 있습니다.
금 나노 입자
세포 계수 키트-8
4',6-디아미디노-2-페닐인돌
탈이온
동적 레이저 산란
Dulbecco의 수정된 Eagle 배지
에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드
에너지 분산 X선 분광기
유세포 분석
식품의약국
전계 방출 주사 전자 현미경
플루오레세인 이소티오시아네이트
금 나노쉘 자기 하이브리드 나노입자
인간 표피 성장 인자 수용체 2
고해상도 투과 전자 현미경
인간 제대 정맥 내피 세포
유도 결합 플라즈마 원자 방출 분광법
레이저 스캐닝 공초점 현미경
자기공명영상
근적외선
폴리알릴아민염산염
퍼플루오로옥틸 브로마이드
폴리 락트산-코-글리콜산
광열 요법
폴리비닐알코올
초상자성 산화철 나노입자
시간-강도 곡선
초음파 조영제
초음파 영상
나노물질
초록 암 사망률에 가장 큰 기여를 하는 것은 전이와 그 치료의 결과입니다. 여기에서 우리는 광열 요법과 표적 단층 탄소 나노튜브(SWCNT) 및 면역 자극과 체크포인트 억제제를 결합한 전이성 유방암의 새로운 치료법을 제시합니다. 우리는 annexin A5(ANXA5) 기능화된 SWCNT 생체 접합체를 사용하여 동계 BALB/cJ 마우스에서 원발성 동소성 EMT6 유방 종양의 선택적 근적외선 광열 절제가 항-세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(항-CTLA- 4) 의존적 복근 반응으로 종양 접종 후 100일에 생존율(55%)이 증가했
초록 유방암의 전이는 예후에 부정적인 영향을 미치는 것으로 여겨집니다. 현저한 깊숙이 침투하고 비침습적인 특성의 이점을 누리는 소노다이나믹 요법(SDT)은 암 치료로 이어지는 전체 시리즈의 잠재력을 보여줍니다. 단독요법의 한계를 극복하기 위해 복합적인 나노플랫폼을 탐색하여 시너지 치료 효율을 실현하고 있습니다. 여기에서 우리는 잘 설계된 PLGA 코어-쉘 구조에서 chlorin e6(Ce6, SDT용), 퍼플루오로펜탄(PFP, 초음파 영상용) 및 도세탁셀(DTX, 화학요법용)을 캡슐화하는 새로운 다기능 나노 시스템을 설정합니다.
