고효율 종양 표적 광화학 테라노스틱 나노입자: 아르테수네이트 탑재, ICG 결합 인간 혈청 알부민

요약

임상 승인된 네 가지 물질—아르테수네이트(Arte), 인간 혈청 알부민(HSA), 폴산(FA), 인디아시아닌 그린(ICG)—을 단일 나노입자(FA-IHA NPs)에 결합한 종양 특이적 테라노스틱 플랫폼을 보고합니다. 이 나노입자는 뛰어난 광 및 물리화학적 안정성을 보입니다. ICG는 근적외선(NIR) 형광을 제공하여 영상화하고, 단일 808nm 레이저 하에서 광열(PTT) 및 광역학(PDT) 치료 능력을 부여합니다. 동시에 808nm 조사로 제어된 Arte 방출을 유도하여 화학요법 효능을 증폭시킵니다. 체외 및 체내 연구는 빠른 세포 흡수와 선택적 종양 축적을 보여주며, HepG2 이식편 마우스에서 공초점 현미경과 NIR 영상으로 검증되었습니다. 단일 NIR 조사 세션(808nm, 1W/cm²)과 FA-IHA NPs 조합이 종양 성장을 재발 없이 완전히 억제합니다. 이 발견은 FA-IHA NPs를 영상 유도 광화학 요법의 임상 전환을 위한 유망한 플랫폼으로 확립합니다.

배경

영상 유도 광화학 요법(IGPC)은 정밀한 종양 위치 확인과 다중 모달 치료를 결합하면서 부수적 손상을 최소화하는 개인 맞춤형 종양학을 위한 매력적인 전략으로 부상했습니다(1-4). 성공적인 IGPC 플랫폼은: (i) 진단 및 치료 양상을 통합하는 다기능성; (ii) 생체적합성, 안정성, 종양 선택성(5-8)을 가져야 합니다. 높은 감도와 우수한 시간 분해능으로 인해 형광 영상이 실시간 유도에 일반적으로 사용됩니다(9-16).

광열 요법(PTT)과 광역학 요법(PDT)은 NIR 조사 하에서 통합될 수 있으며, 열과 활성산소종(ROS)을 전달하여 종양 세포를 제거합니다(17-19). 그럼에도 단일 요법은 잔존 질환을 근절하지 못해 재발을 초래하는 경우가 많습니다(17-19). 기존 화학요법은 전신 세포독성을 제공하지만 비특이성과 관련 독성으로 고통받습니다(20-22). 따라서 국소 광요법과 표적 화학요법을 결합한 IGPC는 이러한 한계를 극복할 가능성을 가집니다.

나노의학은 인디아시아닌 그린(ICG), 금속 기반 나노입자, 탄소 나노물질, 폴리머 시스템 등 다양한 IGPC 테라노스틱을 생성했습니다(23-27). ICG는 FDA 승인 NIR 염료로 심박출량, 간기능, 안과 혈관조영술에 임상적으로 널리 사용됩니다(28-29). 800nm에서의 강한 흡수는 효율적인 PTT-PDT를 촉진합니다. 그러나 자유 ICG는 불안정하고, 순환에서 빠르게 제거되며, 자가 표백되고, 종양 특이성이 부족합니다(31-32). 미셀, 폴리머, 단백질 나노구조 같은 캐리어에 캡슐화하면 성능이 향상되었으나, 더 생체적합하고 표적화된 ICG 기반 복합체에 대한 필요성은 지속됩니다(33-34).

여기서 우리는 FA와 ICG를 HSA 나노입자에 공유 결합으로 연결하고, 간암, 폐암, 유방암에 항암 활성이 입증된 천연 항말라리아 화합물 Arte를 동시에 캡슐화하여 종양 표적 IGPC 제제를 설계했습니다. 결과적인 FA-IHA NPs는 FA 매개 수용체 흡수, HSA의 우수한 생체적합성, ICG와 Arte의 이중 치료 능력을 활용합니다. 이 다기능 구조는 NIR 영상, PTT-PDT, 제어된 화학요법 전달을 제공하여 임상 전환을 위한 다재다능한 플랫폼으로 자리매김합니다.

방법

재료

시약으로 EDC, NHS, Arte(≥99%)를 Sigma-Aldrich에서, DAPI와 CCK-8을 Aladdin에서, NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH와 NH₂-PEG₂₀₀₀-FA를 Xi'an Ruixi에서, DMEM과 PBS를 Gibco에서, ICG-NHS를 Dojindo에서 조달했습니다. 모든 화학물질은 수령 후 그대로 사용했습니다.

FA-IHA NPs 합성 및 특성 분석

Arte를 DMSO에 녹인 후 15mL 물에 첨가했습니다. HSA(10mg)를 도입하고 실온에서 3시간 교반한 후 150µL 0.5% 글루타르알데히드로 가교했습니다. 혼합물을 증류수(MWCO 8-12kDa)에 대해 24시간 투석하여 Arte-탑재 HSA(Arte-HSA)를 얻었습니다. EDC/NHS로 HSA의 카르복실기를 활성화한 후 NH₂-PEG₂₀₀₀-FA와 결합(3시간, 4°C)하고 이후 ICG-NHS를 부착(30분, RT)했습니다. 최종 FA-ICG-HSA@Arte(FA-IHA NPs)는 탈염수에서 24시간 투석으로 정제했습니다. Arte와 ICG 탑재 효율은 UV-vis 분광법으로 정량화했습니다(탑재 % = W₁/W₂ × 100%).

형태는 TEM(Hitachi)으로 평가했습니다. 수동적 크기와 ζ-전위는 DLS(Malvern Zetasizer)로 측정했습니다. 흡수 스펙트럼은 Shimadzu UV-vis 분광광도계로 기록했습니다. 광열 반응은 808nm CW 레이저(1W/cm²)로 측정하며 온도는 Fluke 열전대로 모니터링했습니다. 광안정성과 형광 수명은 각각 5사이클과 30일간 평가했습니다.

열 및 pH 유도 Arte 방출

FA-IHA NPs(50µg/mL)를 pH 6.5, pH 7.4, pH 6.5+NIR(808nm, 1W/cm², 1분 펄스) 조건에서 36시간 배양했습니다. Arte 방출은 상등액에서 287nm UV-vis로 정량화했습니다.

단일 산소 생성 검출

DPBF(15µL)를 10µg/mL ICG 또는 FA-IHA NPs 1mL와 혼합하고 조사했습니다(808nm, 1W/cm², 5분). 410nm에서의 흡광도 감소로 단일 산소 생성을 반영했습니다.

세포 배양 및 세포 흡수

HepG2 세포(ATCC)를 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 포함 DMEM에서 37°C, 5% CO₂로 배양했습니다. 흡수 연구를 위해 세포를 유리 ICG, IHA NPs, FA-IHA NPs(ICG 0.05mg/mL)와 6시간 배양하고, 세척, 고정, DAPI 염색 후 공초점 현미경으로 이미징했습니다. 유세포 분석으로 내부화율을 정량화했습니다.

세포 내 ROS 생성

HepG2 세포(2×10⁵cells/mL)를 PBS, Arte, FA-HA-NPs, 유리 ICG, IHA-NPs, FA-IHA NPs로 12시간 처리한 후 조사했습니다(808nm, 1W/cm², 5분). DCFH-DA(5µg/mL)를 30분 첨가한 후 유세포 분석과 형광 현미경으로 ROS 수준을 평가했습니다.

체외 종양 병용 광화학 요법

HepG2 세포(2×10⁴cells/well)를 유리 ICG, Arte, IHA NPs, FA-IHA NPs(Arte 0-30µg/mL)로 6시간 처리한 후 조사(808nm, 1W/cm², 5분)하거나 미처리 상태로 두었습니다. 24시간 후 CCK-8로 세포 생존율을 측정했습니다. 칼세인-AM/PI 이중 염색으로 공초점 이미징을 통해 세포독성을 확인했습니다.

동물 모델 및 체내 형광 영상

Balb/c 누드 마우스(n=5)에 1×10⁶ HepG2 세포를 피하 주입했습니다. IVIS Spectrum 영상(Caliper)으로 자유 ICG, IHA NPs, FA-IHA NPs 꼬리 정맥 주사 후 10분, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간에 NIR 형광을 추적했습니다.

체내 종양 병용 광화학 요법

마우스를 6그룹(n=5)으로 무작위 배정: PBS, Arte, FA-IHA NPs, ICG+NIR, IHA+NIR, FA-IHA+NIR(동등 Arte 용량). NIR 조사(808nm, 1W/cm², 5분)를 24시간과 48시간에 적용했습니다. 종양 부피를 4일마다 기록하고 기준선 대비 상대값으로 표현했습니다. 치료 후 주요 장기를 수확하여 H&E 조직학을 수행했습니다.

결과 및 논의

FA-IHA NPs 합성 및 특성 분석

그림 1은 FA-IHA NPs의 설계와 치료 워크플로를 개략적으로 보여줍니다. 나노입자는 간단하고 생체적합한 방법으로 조립되었으며, NIR 영상과 광요법을 위한 ICG, 화학요법 작용을 위한 Arte를 통합했습니다.

투과 전자 현미경은 단분산 구형 입자(약 131.2nm)를 보여주었습니다. 동적 빛 산란은 물, PBS, 세포 배지 전반에서 131±2.3nm의 수동적 직경과 -29.2±1.13mV의 안정한 ζ-전위를 확인했습니다. 크기는 7일간 변하지 않아 PEG와 HSA 코팅이 부여한 견고한 콜로이드 안정성을 나타냅니다. UV-vis 스펙트럼은 Arte와 ICG의 특징적 피크를 보여주며 성공적인 탑재를 확인했습니다(Arte 98.6±3.1%, ICG 56.9±2.4%). 형광 스펙트럼은 자유 ICG와 일치하여 보존된 광물리적 특성을 확인했습니다.

광열 평가에서 FA-IHA NPs(동일 ICG 함량)는 808nm(1W/cm²) 조사 5분 내 약 36°C 온도 상승을 보였으며, 자유 ICG도 비슷한 상승을 보인 반면 물은 거의 증가하지 않았습니다(<4°C). 광안정성 테스트에서 FA-IHA NPs는 5회 조사 사이클 동안 흡광도를 유지한 반면 자유 ICG는 강도를 잃어 공유 결합과 HSA/PEG 캡슐화의 보호 효과를 강조했습니다. 4°C에서 30일 형광 수명은 FA-IHA NPs 28% 감소 대 자유 ICG 88% 감소로 우수한 광안정성을 보여주었습니다.

DPBF 분석에서 FA-IHA NPs는 5분 NIR 노출 내 표준 단일 산소 수율의 58%를 생성하여 자유 ICG(35%)를 능가했습니다. 이 향상은 이중 광요법의 시너지 효과를 반영합니다.

산성 조건(pH 6.5)과 NIR 조사 하에서 FA-IHA NPs의 Arte 방출은 pH 7.4의 11.6%에서 pH 6.5+NIR의 68.4%로 증가했습니다. 이중 트리거—HSA의 열적 팽창과 양성자 매개 표면 전하 변화—가 제어된 약물 방출을 촉진합니다(37-38).

세포 흡수 및 세포 내 ROS 검출

공초점 이미징은 FA-IHA NPs 처리 HepG2 세포에서 뚜렷한 빨간 ICG 형광을 보여주며, 자유 ICG와 IHA NPs를 능가했습니다. 유세포 분석은 FA-IHA NPs의 52.3% 흡수율을 정량화했으며, 이는 IHA NPs(25.2%)와 자유 ICG(3.9%)보다 현저히 높습니다—FA 매개 수용체 표적화의 명확한 증거입니다(39-41).

DCFH-DA로 평가한 ROS 생성은 5분 NIR 조사 후 FA-IHA NPs 처리 세포에서 다른 모든 그룹 대비 현저히 높았으며, 향상된 광역학 활성을 확인했습니다(그림 6a,b).

체외 종양 병용 광화학 요법

FA-IHA NPs는 5분 NIR 노출 후 모든 처리군 중 가장 높은 온도 상승(약 31°C)을 달성하여 우수한 광열 성능과 연관되었습니다(그림 7a). 조사 없이 Arte, IHA NPs, FA-IHA NPs는 농도 의존적 세포독성을 보인 반면 자유 ICG는 비활성이었습니다. 조사 후 FA-IHA NPs 그룹에서 세포 생존율이 급격히 떨어졌으며, 이는 화학-광열 시너지 효과에 기인합니다. 칼세인-AM/PI 염색은 FA-IHA NPs+NIR에서 근완전한 세포 사멸을 확인한 반면 다른 그룹은 생존 세포를 유지했습니다(그림 7d).

체내 형광 영상

IVIS 영상은 모든 제형 주사 후 10분 내 강한 전신 형광을 보여주었습니다. 종양 형광은 24시간에 피크를 이루었으며, FA-IHA NPs가 모든 시점에서 가장 높은 신호를 보여 FA 주도 종양 축적을 확인했습니다(그림 8b). 24시간 장기 분석에서는 모든 그룹에서 주로 간 흡수가 나타나 간 청소 경로와 일치했습니다(그림 8c).

체내 종양 병용 광화학 요법

주사 24시간 후 NIR 조사 하 열화상 영상에서 FA-IHA NPs가 가장 큰 온도 상승(약 22.1°C)을 보여 강력한 광열 변환을 확인했습니다(그림 9a,b). 두 번의 조사 세션(0일, 2일)으로 FA-IHA+NIR 그룹에서 완전한 종양 퇴행을 유도했으며, 90일간 재발 없이 100% 생존율을 보인 반면 다른 모든 그룹은 지속적 억제에 실패했습니다(그림 9c,d). 조직학적 검사에서 FA-IHA+NIR 그룹에서 유의미한 장기 병리가 나타나지 않아 무시할 만한 전신 독성을 강조했습니다(그림 10).

결론

FA와 ICG를 공유 결합으로 연결하면서 Arte를 HSA 내에 캡슐화한 다기능 테라노스틱 나노입자를 설계했습니다. FA-IHA NPs는 견고한 콜로이드 및 광열 안정성을 보이며, NIR 형광을 보존하고, NIR 조사 시 Arte를 방출합니다. FA 매개 수용체 표적화는 높은 세포 흡수와 종양 축적을 산출하여 시너지적 광열-광역학-화학요법 공격을 가능하게 하며, 체외 및 체내에서 재발 없이 종양을 근절합니다. 이 결과는 FA-IHA NPs를 영상 유도, 종양 표적 광화학 요법의 임상 전환을 위한 매우 유망한 플랫폼으로 자리매김시킵니다.

약어

Arte:

아르테수네이트

FA:

폴산

HSA:

인간 혈청 알부민

ICG:

인디아시아닌 그린

NIR:

근적외선

PDT:

광역학 요법

PEG:

폴리에틸렌 글리콜

PTT:

광열 요법