두경부 편평 세포 암종(HNSCC)에 대한 강력한 항종양 효과를 위한 NQO1 억제제와 5-플루오로우라실의 메조다공성 실리카 나노입자 기반 조합
초록
두경부 편평 세포 암종(HNSCC)은 가장 치명적인 형태의 암 중 하나이며 그 기원의 90%가 편평 세포에서 발생합니다. NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1(NQO1)은 편평 세포 암종에서 과발현되는 효소로 증식과 내화학성에 중요한 역할을 합니다. 주요 목표는 HNSCC에서 ß-라파콘(임상 형태의 ARQ761)의 억제 효과를 연구하고 HNSCC에서 치료 효능을 향상시키는 5-FU와 ß-lap의 조합 효과를 연구하는 것이었습니다. 5-FU/ß-lap이 로딩된 지질 이중층-조립 메조포러스 실리카 나노입자를 준비하고 물리화학적 및 생물학적 특성에 대해 연구했습니다. ß-lap은 Cal33 세포에서 NQO1 효소 활성의 농도 의존적 억제를 보여주었습니다. 특히, ß-lap 20-50 μg/ml의 용량에서 유의한 억제 효과가 관찰되었다. 5-FU+ß-lap의 조합은 세포 생존율을 낮췄습니다. 가장 주목할 만한 것은 5-FU/β-lap-loaded mesoporous silica nanoparticles(FNQ-MSN)이 개별 약물 또는 물리적 조합에 비해 현저히 낮은 세포 생존율을 나타냈다는 점입니다. ß-lap은 대조군과 비교하여 NQO1의 단백질 밴드를 감소시켰습니다. 그러나 NQO1 수준의 가장 현저한 감소는 FNQ-MSN 처리 세포군에서 관찰되었습니다. FNQ-MSN은 세포 사멸의 60% 이상(조기 및 후기 세포 사멸)과 암세포의 우세한 핵 단편화를 초래하여 운반체 기반 조합 요법의 우수한 항암 효과를 나타냅니다. 5-FU+ß-lap의 물리적 혼합물에서 종양 부피의 현저한 감소가 관찰되었습니다. 그러나, 캐리어 기반 5-FU 및 ß-랩(FNQ-MSN)의 병용 치료는 종양 성장을 유의하게 지연시키고 종양 보유 이종이식 마우스의 생존을 연장했습니다. 이러한 발견은 NQO1 억제제가 HNSCC 치료에서 5-FU의 화학 요법 잠재력을 향상시키는 잠재력을 시사합니다.
소개
두경부 편평 세포 암종(HNSCC)은 가장 치명적인 형태의 암 중 하나이며 그 기원의 90%가 편평 세포에서 발생합니다[1]. HNSCC는 본질적으로 고도로 혈관신생하며, 그 혈관구조는 더 높은 전이 및 불량한 생존과 관련된 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 비롯한 다양한 사이토카인을 발현합니다[2]. 중국에서 HNSCC의 발병률은 2015년에 약 250,000건의 새로운 사례가 등록되었고 77,500건의 사망 사례가 있는 암 관련 사망에서 6번째입니다. HNSCC의 전체 5년 생존율은 공격성, 조기 재발, 높은 전이, 불량한 예후로 인한 높은 사망률 등의 요인으로 인해 매우 낮습니다[3]. HNSCC의 주요 치료 옵션은 수술 절차에 이어 방사선 요법 또는 화학 요법입니다. 구체적으로, 초기 단계나 수술 후 단계에서 화학요법을 효과적으로 사용하면 종양 성장을 억제할 수 있습니다[4, 5]. 화학 요법의 효과적인 사용은 종양 조직 내의 암세포를 근절하고 종양 재발을 억제합니다. 그러나 단일 약제에 기초한 장기간의 화학요법은 종종 약물 내성 및 치료 효능 감소를 초래한다[6]. 따라서 HNSCC 환자의 생존과 삶의 질을 향상시키기 위한 혁신적인 전략을 채택할 필요가 있습니다.
HNSCC 치료에 사용되는 여러 항암제는 시스플라틴, 5-플루오로우라실(5-FU), 파클리탁셀 또는 도세탁셀을 포함합니다. 이 중 5-FU(5-fluorouracil)는 HNSCC 및 기타 편평세포암 치료에서 1차 치료제로 사용됩니다[7]. 5-FU는 암 세포 내에서 thymidylate synthase를 비가역적으로 억제하여 DNA 복제를 억제하여 세포 사멸을 초래하는 pyrimidine 유사체입니다[8]. 모든 항암제와 마찬가지로 5-FU는 전신 순환계에 부작용이 없고 정상 조직에 독성을 일으키는 반면, 5-FU와 2차 약제를 병용하면 잠재적으로 부작용을 줄이고 개선할 수 있다는 보고가 있다. 암 치료의 전반적인 치료 효능 [9].
NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1(NQO1)은 정상 조직에 비해 종양 조직에서 100~200배 정도 상승하는 플라보단백질이다[10]. 2-전자 산화환원효소는 안정한 하이드로퀴논을 형성하여 퀴논을 해독할 수 있는 유도성 단계 II 해독 효소이다[11]. NQO1은 정상적인 인간 조직에서 낮은 기저 수준으로 발현되는 것으로 나타났으며, 여기에서 산화 환원 순환 및 산화 스트레스로부터 세포를 보호하고 p53 억제인자를 안정화했습니다. NQO1은 유방, 췌장 및 편평 세포 암종을 포함한 여러 암에서 구성적으로 과발현됩니다[12]. NQO1의 과발현은 암 부담의 진행을 촉진하고 암세포가 5-FU 또는 시스플라틴(산화 스트레스 유도제)과 같은 화학 요법 약물에 대해 내성을 갖도록 하여 NQO1을 치료 효능을 향상시키는 잠재적인 종양 표적으로 만듭니다[13]. siRNA에 의한 NQO1의 녹다운은 gemcitabine 또는 doxorubicin과 같은 여러 약물의 세포독성 효과를 향상시키는 것으로 보고되었습니다[14]. 그 외에도 쿠마린이나 커큐민, ES936과 같은 합성 및 천연 NQO1 억제제가 보고되고 있다[15,16,17]. 이 연구에서 우리는 NQO1 억제제로 ß-lapachone(ß-lap, 3,4-Dihydro-2,2-dimethyl-2H-naphtho [1,2-b]pyran-5,6-dione)을 사용했습니다. 18]. ß-lap은 NQO1 의존적 메커니즘을 통해 작용하고 상당한 양의 활성 산소종(ROS)을 생성하여 DNA 가닥을 손상시키고 암세포를 사멸시킵니다[19].
소분자의 전신 전달을 위해 나노입자를 사용하는 것은 암 치료에서 유망한 접근법이 됩니다[20]. 약물 로딩된 나노 입자는 투여 일정이 덜 필요하고 항암 효능을 개선하고 부작용을 상대적으로 감소시키는 것으로 나타났습니다. 모든 운반체 중에서 메조포러스 실리카 나노입자(MSN)는 페이로드를 종양 조직에 효과적으로 전달할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다[21, 22]. 마이크로미터 크기의 기공은 약물의 안정적인 로딩을 허용하고 전신 순환에서 약물의 방출을 방지하며 EPR(Enhanced Permeation and Retention) 효과를 사용하여 누출된 암 조직에 우선적으로 축적되도록 합니다[23].
전반적으로, 본 연구의 주요 목표는 5-FU와 NQO1 억제제의 치료 이점을 결합하여 HNSCC에서 항암 효과를 향상시키는 것이었습니다. 시험관 내 항암 효과는 세포 생존율, 웨스턴 블롯 분석, 유세포 분석기/훽스트 기반 세포자멸사 분석, 살아있는/죽은 분석과 같은 다양한 기술을 사용하여 분석되었습니다. 생체 내 연구는 이종이식 모델을 포함하는 Cal33 종양 세포에 대해 수행되었습니다.
결론
요약하면, 우리는 5-FU+ß-lap-loaded 지질 이중층 코팅된 메조포러스 실리카 나노입자를 성공적으로 공식화했습니다. 우리는 (i) HNSCC 종양 세포에서 농도 의존적 방식으로 ß-lap의 항종양 효과, (ii) 5-FU+ß-lap의 조합이 NQO1 단백질과 Bcl-2 단백질의 상당한 억제를 초래한다는 것을 보여주었습니다. iii) 조합 기반 FNQ-MSN은 HNSCC 이종이식편에서 종양 부담의 상당한 감소를 입증했습니다. 이 데이터는 NQO1 억제제(ß-lap)의 치사량 이하의 용량이 HNSCC 종양에서 5-FU의 치료 효능을 잠재적으로 향상시킬 수 있고 잠재적으로 다른 악성 종양의 임상 치료로 확장될 수 있다는 사실을 분명히 지적합니다.
자료 및 방법
5-FU/ß-lap-Loaded 지질 이중층-메조포러스 실리카 나노입자의 제조
cetyltrimethylammonium bromide(CTAB)(210 mg)를 180 ml의 물에 녹여 80 °C로 끓인 후 5-FU와 ß-lap을 20% w/w의 총 나노입자를 첨가하여 약물이 로딩된 MSN을 제조했습니다. 그 다음, 암모늄 플루오라이드(NH4F)(30 mg)를 첨가하고 60분 동안 잘 교반하였다. 다음으로 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS) 1.6ml를 30분 동안 적가하고 3시간 동안 계속 교반하였다. 24 ± 1 °C에서 10000 rpm으로 원심분리(15 분)한 후 수집된 반투명 백색 콜로이드가 형성되었습니다. MSN을 초순수에 재현탁하고 원심분리 사이클을 2회 반복하였다. 별도로 DSPE-PEG2000(총 MSN 중량의 2%)을 사용하여 박막 막을 제조하고 약물이 로딩된 MSN을 현탁시킨 물로 수화시켰다. 혼합물을 즉시 실온(25 °C)에서 50 W에서 5 분 동안 프로브 초음파 처리했습니다. PEG화 지질 이중층 지지 MSN은 최종적으로 2회 세척되고 초순수에 재현탁되었습니다.
입자 크기, 제타 전위 분석 및 형태 분석
입자 직경, 다분산 지수(PDI) 및 제타 전위는 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 평가되었습니다. 입자는 동적 광산란(DLS) 메커니즘을 사용하여 분석되었으며 입자 분산은 실험 전에 잘 희석되었습니다. 모든 실험은 실온에서 3회 수행되었습니다. 나노 입자의 형태는 100 kV에서 작동되는 CM 200 UT, Philips, MA, USA)를 사용하여 투과 전자 현미경(TEM)에 의해 결정되었습니다. 간단히 말해서, 입자 분산액을 희석하고 한 방울을 300-메시 TEM 그리드에 놓고 10분 동안 침전되도록 두었다. 입자를 음성 염색으로 2% PTA(phosphotungstic acid)로 대조염색하고 공기 건조하고 TEM 현미경으로 관찰했습니다.
약물 적재
두 가지 방법으로 약물 로딩 분석은 상청액에서 언로딩되거나 결합되지 않은 약물과 나노입자에 로딩된 약물을 계산하여 수행되었습니다. 약물 로딩 효율은 HPLC 방법으로 수행하였다. HPLC에는 Shimadzu LC-20 AD PLC 펌프 및 SPD-M20A PDA 검출기 및 역상 C18 컬럼(Phenomenex C18, 150 4.6 mm, 5 μm)을 포함하는 분석 소프트웨어 Shimadzu LC가 장착되어 있습니다. 5-FU의 이동상은 아세토니트릴과 물의 혼합물(10:90, v/v)로 구성되며 1 ml/min의 속도로 펌핑됩니다. 검출 파장은 5-FU에 대해 265 nm로 설정되었습니다. ß-lap의 이동상은 아세토니트릴/물(31:69, v/v)로 구성되고 검출 파장은 35 °C에서 254 nm로 설정됩니다. 5-FU/ß-lap의 적재 능력(LC)과 적재 효율(LE)은 각각의 공식을 사용하여 계산되었습니다.
5-FU 및 ß-lap의 방출은 투석 방법을 사용하여 37°C에서 PBS(pH 7.4) 및 ABS(pH 5.0)에서 평가되었습니다. 간단히 말해서, 각 약물-로딩된 나노입자의 1 mg 당량을 각각의 완충액 1 ml에 있는 투석막에 로딩하고 말단을 밀봉합니다. 밀봉된 투석막을 각각의 ABS 및 PBS 완충액 25ml에 넣고 37℃의 진탕 수조에 넣었다. 미리 정해진 시간 간격으로 샘플을 수집하고 동일한 부피의 새로운 버퍼로 교체했습니다. 각 완충액에서 방출되는 약물의 양은 이전 섹션에서 설명한 대로 HPLC 방법으로 평가되었습니다.
세포 배양 및 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 1(NQO1) 활성 분석
Cal33 HNSCC 세포는 10%의 FBS와 1%의 항생제 혼합물이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 배양되었습니다. 세포는 인큐베이터에서 주변 조건에서 유지되었습니다. NQO1 활성 분석을 위해 Cal33 세포를 96웰 플레이트에 8 × 10
3
의 파종 밀도로 파종했습니다. 웰당 세포를 배양하고 밤새 배양하였다. 세포를 다양한 농도의 β-lap으로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 0.8% 디지토닌(2 nM EDTA 50 ㎕)을 사용하여 세포를 용해하고 메나디올과 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)를 사용하여 분석을 수행했습니다. 기질 커플링 반응 및 활성은 620 nm에서 측정되었습니다. 분석은 삼중으로 수행되었습니다.
체외 세포 생존 분석
농도 증가에서 β-lap의 세포 생존율 분석 및 개별 및 조합 요법의 세포 생존율 분석은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4 -설포페닐)-2H-테트라졸륨(MTS) 분석. 간단히 말해서, Cal33 세포를 96웰 플레이트에 1 × 10
4
의 파종 밀도로 파종했습니다. 웰당 세포를 배양하고 밤새 배양하였다. 다음날, 세포는 증가하는 농도의 ß-lap으로 별도로 처리되었습니다. 세포를 5, 10 및 20 μg/ml의 기본 농도에서 5-FU 및 ß-lap의 개별 및 조합 요법으로 처리하고 24시간 동안 배양했습니다. 세포를 두 번 세척하고 제조업체의 지침에 따라 MTS 용액으로 처리했습니다. 처리되지 않은 세포에 대해 세포 생존율을 계산하고 460 nm에서의 흡광도는 마이크로플레이트 판독기를 사용했습니다.
서부 얼룩 분석
6웰 플레이트에 파종된 세포는 별도로 ß-lap의 농도를 증가시켜 처리했습니다. 세포를 개별(5-FU 또는 ß-랩) 및 5-FU 및 ß-랩(FNQ-MSN)의 조합 요법으로 처리하고 24시간 동안 배양했습니다. 세포를 수확하고, 용해시키고(M-per buffer), 원심분리하고, 단백질을 함유하는 상청액을 수집하였다. 세포 용해물의 단백질 농도는 BCA(bicinchoninic acid) 방법을 사용하여 평가되었습니다. 10%의 Bis-Tris 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 단백질을 분리하고 즉시 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮겼습니다. Tween 20(TBST, pH .2)을 포함하는 n Tris-buffered saline(TBS) 완충액에서 제조된 5% 탈지유를 사용하여 멤브레인을 차단했습니다. 토끼 다클론성 NQO1(1:1000), 마우스 단클론성 Bcl-2(1:1000) 및 마우스 단클론성 GAPDH(1:1000)의 1차 항체를 4°C에서 밤새 멤브레인에서 배양했습니다. 막을 TBST로 세척한 다음 1:10000 희석액의 2차 항체(항마우스 또는 항토끼 IgG)와 함께 인큐베이션했습니다. 막을 다시 TBST로 세척하고 블롯을 ECL 기질 용액에 노출시켰고 단백질 밴드의 밀도를 포토디벨로퍼를 사용하여 평가했습니다.
아폽토시스 및 Hoechst 분석
Cal33 세포를 6웰 플레이트에 2 × 10
5
의 파종 밀도로 파종했습니다. 웰당 세포를 배양하고 밤새 배양하였다. 그런 다음 세포를 개별(5-FU 또는 ß-랩) 및 5-FU 및 β-랩(FNQ-MSN)의 조합 요법으로 처리하고 24시간 동안 배양했습니다. 세포를 수확하고, 세척하고, 원심분리하고, 펠렛화하였다. 세포를 annexin V 2.5μl 및 PI 2.5μl로 처리하고 어두운 조건에서 15분 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 1 ml로 만들고 형광 활성화 세포 분류(FACS, BD, FACSverse)를 사용하여 평가했습니다. 총 10,000개의 세포가 분석되었습니다. 세포 파종 및 약물 처리를 위한 유사한 절차를 따랐고 Hoechst 33342 염료(10 μg/ml)로 염색하고 10분 동안 배양했습니다. 세포를 세척하고 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하고 다시 세척하였다. 세포의 형태는 형광현미경(Nikon A1, Japan)으로 관찰하였다.
HNSCC 이종이식 종양 모델에서 FNQ-MSN의 항종양 효능
평균 4-5주령의 18-22그램 수컷 BALB/c 마우스를 Henan, Zhengzhou University of Light Industry의 사내 동물 시설 센터에서 조달했습니다. 동물은 12시간 암광 주기가 있는 에어컨이 설치된 방에서 유지되었고 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 모든 동물 프로토콜은 허난성 정저우 경공업 대학 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 이종이식 모델을 설정하려면 1 × 10
7
150 ㎕의 배양 배지에 있는 Cal33 세포를 마우스의 오른쪽 엉덩이에 피하로 접종하였다. 종양의 평균 크기가 80-100 mm3에 도달하면 마우스를 대조군, 5-FU, ß-lap, 5-FU+ß-lap 및 FNQ-MSN의 5개 그룹으로 각각 무작위로 나누어 각 그룹에 8마리의 마우스를 넣었습니다. . 5-FU는 5 mg/kg의 고정용량으로, ß-lap은 25 mg/kg의 고정용량으로 투여하였으며, 매 꼬리정맥 주사마다 3 일 간격으로 3회 투여하였다. 마우스 무게와 종양 부피를 18일 동안 정기적으로 모니터링했습니다. 종양 부피는 공식을 사용하여 계산되었습니다.
본 연구에서는 종양 세포 로딩으로 인한 마우스 사망은 관찰되지 않았으며 모든 동물은 CO2로 안락사되었습니다. 그런 다음 연구가 끝날 무렵 경추 탈구에 의해 희생되었습니다.
통계 분석
이원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 여러 그룹을 비교했습니다. p의 유의 수준 <0.05는 유의한 것으로 간주되었으며 모든 데이터는 각 실험에서 구체적으로 언급되지 않는 한 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다.
결과 및 토론
5-FU/ß-lap-Loaded 지질 이중층 지지 메조포러스 실리카 나노입자의 제조
이 연구에서 우리는 PEG화 지질 이중층에 의해 안정화된 메조포러스 실리카 나노입자를 사용자 정의했습니다. 5-FU/ß-lap-loaded MSN은 emulsion-sonication 방법으로 제조한 후 DSPE-PEG2000으로 구성된 지질박막이 들어있는 플라스크에 약물이 로딩된 MSN을 도입하였다. 혼합물을 초음파 처리하고 5-FU/ß-lap을 포함하는 지질 코팅된 MSN을 얻었습니다(FNQ-MSN)(그림 1a). 5-FU 및 ß-lap의 하중 효율(LE)은 각각 91.5 ± 1.65% 및 92.9 ± 1.24%였습니다. FNQ-MSN은 8.1 ± 1.12 wt%의 5-FU 및 7.6 ± 0.95 wt%의 ß-lap을 나타내어 MSN 캐리어의 높은 적재 용량(LC)을 나타냅니다. 지질 이중층의 존재는 전신 순환에서 원치 않는 방출을 방지하여 독성을 방지합니다. 약물이 적재된 MSN의 평균 입자 크기는 92.1 ± 0.85 nm(PDI ~ 0.089)인 반면 MSN 표면(FNQ-MSN)에 지질 이중층을 조립하면 평균 입자 크기가 128.4 ± 1.24 nm(PDI ~ 0.115)로 증가함을 나타냅니다. MSN의 표면에 지질 물질의 고체 존재(그림 1b). 제타 전위가 -18.2 ± 1.22에서 -26.4 ± mV로 변경되었습니다. FNQ-MSN의 작은 입자 크기는 EPR 효과로 인해 새는 종양 조직에 약물이 적재된 담체를 우선적으로 축적할 수 있습니다. 게다가, 표면 PEG화는 종양 조직에서 FNQ-MSN의 가능성을 더욱 증가시킬 우수한 안정성과 연장된 혈액 순환 시간을 제공합니다. TEM 이미지는 리포솜과 형태학적으로 유사하며 격자에 균일하게 퍼진 완전한 구형을 나타냈다. TEM 이미지는 MSN 표면에 지질 어셈블리의 존재를 나타내는 회색 외부와 더 어두운 코어를 명확하게 보여주었습니다(그림 1c). TEM에서 관찰된 크기는 zetasizer의 DLS 입자 크기와 확증됩니다. MSN은 약물 분자의 균질한 분포를 위해 잘 정돈된 채널을 가지고 있습니다. 기공의 표면 특성은 작은 분자의 안정적인 로딩에 중요한 요소 중 하나입니다. 호스트-게스트 상호 작용과 관련된 다양한 물리적 힘은 주로 소수성 힘과 반 데르 발스 상호 작용력을 포함합니다. 더 높은 약물 로딩 용량은 종양 부위에서 더 높은 세포내 농도 및 더 높은 사멸 효율을 제공할 것이다. FNQ-MSN은 PBS 배지에서 우수한 안정성을 보였고 입자 크기는 30 일까지 연구 기간 내내 변하지 않았습니다. 이러한 개선된 담체 시스템의 안정성과 담체 시스템의 높은 적재 용량은 종양 치료의 생체 분포와 효율성을 향상시킬 것입니다.
<그림><그림>
아 5-FU 및 β-lap-loaded 지질 이중층으로 코팅된 메조포러스 실리카 나노입자의 구조에 대한 도식적 표현. 두 개의 약물이 MSN의 외부 표면에 있는 PEG화된 지질 이중층 어셈블리에 의해 더욱 안정화된 MSN의 기공에 로드됩니다. ㄴ FNQ-MSN의 입자 크기 분포. ㄷ 더 높은 배율이 삽입된 FNQ-MSN의 TEM 이미지
체외 약물 방출
FNQ-MSN의 5-FU 및 ß-lap의 체외 약물 방출은 PBS와 ABS에서 연구되었습니다(그림 2). 나타낸 바와 같이, pH 7.4 및 pH 5.0에서 두 가지 다른 방출 경향이 관찰되었습니다. 예를 들어, 24 h에서 pH 5.0에서 약 40%의 약물 방출과 비교하여 pH 7.4에서 24 h에 방출된 5-FU의 25%. 유사하게, β-lap의 20% 및 30%는 pH .4 및 pH 5.0에서 각각 방출되었습니다. 방출 역학은 연구 기간 72시간 후 알칼리 완충액에서 50%의 5-FU가 방출되고 pH 5.0에서 약물 방출의 80%로 연구 기간 내내 동일했습니다. 산성 조건에서 약물의 pH 반응성 방출은 암 치료에 유리합니다. 연구 기간 내내 FNQ-MSN으로부터 약물의 방출을 제어하는 DSPE-PEG 층의 존재에 주로 기인한 두 pH 조건에서 버스트 방출 현상이 관찰되지 않았습니다. pH 7.4와 pH 5.0 조건 사이에서 약물 방출의 상당한 차이가 관찰되었습니다. pH 7.4 조건에서 PEG-b -DSPE는 높은 스텔스층 특성을 나타내어 캡슐화된 화합물의 방출을 방지합니다. 현재 결과는 pH 5.0에서 약물 방출이 가속화되어 MSN 표면 주변의 보호 쉘이 분해되었음을 나타냅니다. 암세포 내에서 최대 약물 방출을 보장하는 pH 민감성 약물 방출 속도는 항종양 효능을 개선하고 정상 조직에 대한 원치 않는 독성을 감소시킬 수 있습니다. pH 반응성 요소가 있는 경우 FNQ-MSN이 MSN의 지질 이중층을 흘려 낮은 pH 조건에서 방출을 증가시킬 수 있습니다.
<그림><그림>
pH 7.4 및 pH 5.0 완충제 조건에서 FNQ-MSN의 5-FU 및 ß-lap의 시험관 내 방출. 방출 연구는 72 h까지 계속되었고 약물 방출은 HPLC 방법을 사용하여 정량화되었습니다. **p <0.01
ß-lap에 대한 NQO1의 감도
HNSCC를 포함한 많은 암세포에서 NQO1의 상향 조절이 불량한 예후 및 불량한 치료 결과와 관련되기 때문에 NQO1을 표적으로 하는 약물은 암 치료에 대한 잠재적인 전략이 될 수 있습니다[24]. NQO1은 정상 조직에 비해 편평세포암에서 100~200배 정도 과발현된다. 따라서 NQO1 효소 활성에 대한 ß-lap 영향은 Cal33 세포에서 연구되었습니다. 도시된 바와 같이, ß-lap은 Cal33 세포에서 NQO1 효소 활성의 농도 의존적 억제를 보여주었다(그림 3a). 특히, ß-lap 20-50 μg/ml의 용량에서 유의한 억제 효과가 관찰되었다. 또한, NQO1 단백질에 대한 ß-lap의 억제 가능성은 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가로 연구되었습니다(그림 3b). 결과는 ß-lap의 농도가 증가함에 따라 암세포에서 NQO1 단백질의 현저한 감소를 분명히 보여주었습니다. 대략 80% NQO1 억제가 ß-lap 100 μg/ml에서 관찰되었습니다. ß-lap과 같은 NQO1 생체 활성화 약물은 NQO1에 의해 대사되고 불안정한 하이드로퀴논 화합물을 형성하여 즉시 원래 성분으로 다시 전환되어 2개의 1전자 산화를 남기고 2O
2-
를 소모합니다. . 이것은 60-70몰의 NAD(P)H6를 소비하는 비용으로 1분자의 ß-lap이 130몰의 초과산화물을 생성하는 무익한 산화환원 순환을 생성할 것입니다. 이렇게 형성된 슈퍼옥사이드(O2.-) 라디칼은 과산화수소(H2O2-)로 전환되어 세포 사멸과 세포 사멸을 일으킬 것입니다[25].
<그림><그림>
아 효소적 방법에 의한 Cal33 암세포의 NQO1 활성에 대한 ß-lap의 농도 의존적 활성의 영향. ㄴ 하우스키핑 단백질로 GAPDH를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의한 ß-lap의 농도 의존적 활성이 NQO1 단백질 수준에 미치는 영향
HNSCC 세포에서 FNQ-MSN의 체외 항암 효과
Cal33 세포에서 ß-lap의 in vitro 항암 효과를 MTT assay로 연구하였다. 결과는 ß-lap이 세포 생존력에서 전형적인 농도 의존적 감소를 나타냄을 보여주었습니다(그림 4a). 특히, 50 μg/ml의 농도에서 세포 생존율의 현저한 감소가 관찰되었습니다. 추가 실험을 위해 20 μg/ml가 선택되었습니다(ß-lap의 IC50 값 미만). 다음으로, 5-FU에 대한 ß-lap의 강화 효과는 3가지 농도(5, 10 및 20 μg/ml)에서 연구되었습니다. 도시된 바와 같이, 5-FU+ß-lap의 조합은 더 낮은 세포 생존율을 초래하였다; 가장 주목할 만한 것은 FNQ-MSN이 개별 약물 또는 물리적 조합에 비해 현저히 낮은 세포 생존율을 나타냈다는 점입니다(그림 4b). 예를 들어, 5-FU와 ß-lap은 각각 35.7%와 70.2%의 세포 생존율을 보였고, 5-FU+ß-lap은 26.5%와 FNQ-MSN은 13.1%를 보여주었습니다. 결과는 5-FU의 세포 독성 효과가 ß-lap과 결합될 때 유의하게 증가함을 분명히 보여주었습니다. FNQ-MSN은 5-FU+ß-lap에 비해 더 나은 내재화 및 운반체 시스템에서 로드된 치료제의 제어 방출로 인해 더 효과적이었습니다. 결과는 NQO1 효소 활성 및 단백질 수준에 대한 ß-lap의 억제 효과를 분명히 보여주고 5-FU의 항암 효과를 강화했으며 HNSCC 치료에서 향상된 치료 결과를 가져왔습니다.
<그림><그림>
아 Cal33 세포의 세포 생존력에 대한 β-lap의 농도 의존적 활성의 효과. ㄴ 각각 5-20 μg/ml의 3가지 농도에서 개인 및 두 번째 화학요법제인 5-FU와의 조합의 세포독성 효과. 세포 생존율은 24시간 배양 후 MTT 분석에 의해 평가되었습니다. ㄷ 개별 및 5-FU 및 ß-lap의 조합 처리 후 NQO1 및 Bcl-2 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석
신호 경로에서 FNQ-MSN 역할:웨스턴 블롯 분석
ß-lap 매개 세포독성 효과의 메커니즘은 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가로 조사되었습니다. 도시된 바와 같이, ß-lap은 대조군과 비교하여 NQO1의 단백질 밴드의 감소를 초래하였다. 그러나 NQO1 수준의 가장 현저한 감소는 FNQ-MSN 처리 세포군에서 관찰되었습니다(그림 4c). ß-lap에 의해 유발된 Cal33의 화학감수성 증가는 Bcl-2 단백질 수준을 통해 세포의 세포사멸을 강화하여 평가하였다. Bcl-2 계열은 세포 항상성을 조절하고 암세포의 증식과 사멸을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. Bcl-2가 감소하고 Bax가 증가하는 과정은 세포질에서 시토크롬 C를 방출하여 전체 카스파제 캐스케이드를 시작하여 세포 사멸을 초래합니다[26]. 결과는 5-FU와 ß-lap(FNQ-MSN)의 조합이 Bcl-2를 유의하게 하향 조절함을 분명히 강조하여 Cal33 암세포에서 향상된 항암 효과를 나타냅니다.
HNSCC의 세포자멸사 분석
세포 생존율 분석 후, 개별 및 복합 약물이 Cal33 세포에 미치는 세포자멸사 효과를 annexin V/PI 염색 후 유세포분석기로 평가하였다(Fig. 5). 개별 5-FU(10 μg/ml) 또는 ß-lap(30 μg/ml)의 세포자멸사 효과는 암 세포의 어떠한 감지할 수 있는 세포자멸사를 초래하지 않았습니다. 그러나 5-FU+ß-lap은 암세포의 세포자멸사 비율을 극적으로 증가시켰습니다. 중요하게는, FNQ-MSN은 60% 이상의 세포 사멸(초기 및 후기 세포사멸)을 초래하여 운반체 기반 조합 요법의 우수한 치료 효과를 나타냅니다. Apoptosis 효과는 Hoechst 33342 염색에 의해 추가로 확인되었습니다. 도시된 바와 같이, FNQ-MSN으로 처리된 세포는 5-FU 또는 ß-lap 단독의 세포에 비해 더 많은 양의 세포 사멸, 핵 응축 및 단편화 특징을 겪는다. 아폽토시스 과정에서 세포는 외부 세포막에서 손상되지 않고 수축하고 결과적으로 염색질 응축이 일어나 아폽토시스체 형성이 증가합니다.
<그림><그림>
5-FU 및 ß-lap의 개별 및 조합 처리 후 Annexin V 및 PI의 이중 염색을 사용한 Cal33 세포의 유세포 분석기. 10,000개의 이벤트가 유세포 분석기에 기록되었습니다.
<그림><그림>
Hoechst 33342로 염색한 후 Cal33 세포의 핵 형태 분석; 세포는 5-FU와 ß-lap의 개별 및 조합으로 처리되었습니다. 10,000개의 이벤트가 유세포 분석기에 기록되었습니다.
라이브/데드 어세이
개별 및 복합 약물의 항암 효과는 Live/Dead 분석에 의해 추가로 평가되었습니다. 처리된 세포는 살아있는 세포와 죽은 세포의 각각의 마커로서 Calcein AM과 ethidium bromide 염색을 하였다(Fig. 7). 도시된 바와 같이, 처리되지 않은 세포는 100% 녹색 형광으로 염색된다. 개별 약물, 5-FU(10 μg/ml) 또는 ß-랩(30 μg/ml)은 약간의 적색 형광 염색 세포를 나타내었지만; 그러나 우세한 세포는 제한된 세포 사멸을 나타내는 녹색 형광을 나타냈다. 현저한 세포 사멸은 적색 형광이 우세하고 녹색 형광으로 염색된 세포가 적은 것으로 나타난 바와 같이 FNQ-MSN 처리된 암세포에서 관찰되었습니다. FNQ-MSN의 더 높은 항암 효과는 암세포에서 5-FU와 ß-lap의 상승 작용과 5-FU의 화학 감수성을 증가시키는 ß-lap의 능력에 기인합니다.
<그림><그림>
개별 및 5-FU 및 ß-lap의 조합 처리 후 Calcein AM 및 ethidium bromide의 이중 염색을 사용한 Cal33 세포의 생/사 분석
HNSCC 이종이식 모델에 대한 FNQ-MSN의 생체 내 항종양 효능
동물 모델에서 병용 요법의 효능을 추가로 평가하기 위해 HNSCC 이종이식편을 준비하여 각각 5 mg/kg의 5-FU 및 10 mg/kg의 ß-lap을 투여했습니다. ß-lap의 의약품 등급은 ARQ761로 현재 전이성 악성종양 치료를 위한 임상 1상 시험 중이다. ß-lap은 전임상 연구에 따라 인간의 최대 허용 용량에 대한 한계를 설정했습니다[27]. 이를 염두에 두고 우리는 생체 내 연구를 위해 10 mg/kg의 ß-lap의 용량을 최적으로 선택했습니다. 도시된 바와 같이, 개별적으로 투여된 5-FU 및 ß-lap에서는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 종양 부피의 유의한 감소가 관찰되지 않았다(도 8a). 5-FU+ß-lap의 물리적 혼합물에서 종양 부피의 현저한 감소가 관찰되었습니다. 그러나, 캐리어 기반 5-FU 및 ß-랩(FNQ-MSN)의 병용 치료는 종양 성장을 유의하게 지연시키고 종양 보유 이종이식 마우스의 생존을 연장했습니다. FNQ-MSN의 종양 부피 그래프는 두 부분으로 나눌 수 있습니다. 종양 부피의 미미한 성장은 9일까지 관찰된 반면 종양은 9일 이후부터 18일까지 유의하게 증가했지만, 그럼에도 불구하고 전체 종양 부피는 대조군 또는 다른 그룹의 종양 부피에 비해 훨씬 작았다. 개인 및 복합 요법의 독성 우려는 체중 측면에서 평가되었습니다(그림 8b). 도시된 바와 같이, 5-FU+ß-lap의 물리적 혼합은 체중의 10% 이상 감소로 대표되는 심각한 독성을 초래한 반면 5-FU는 체중의 5%를 초래했습니다. 예상대로 FNQ-MSN은 지질-MSN 기반 담체 시스템의 고유한 이점을 나타내는 체중 감소를 초래하지 않았습니다. FNQ-MSN의 향상된 항종양 효과는 NQO1 효소와 단백질에 대한 ß-lap의 억제 효과에 기인하며, 이는 차례로 5-FU의 화학 민감성을 증가시키고 Cal33 인간 종양, 두 번째 지질 이중층에서 상승적인 항암 효과를 초래했습니다. -코팅된 MSN은 전신 순환 동안 약물을 보호하고 종양 조직에서 조절된 방식으로 방출될 수 있습니다. 셋째, 나노운반체의 PEGylation은 혈액 순환 시간을 연장하여 EPR 효과로 인해 종양 조직에 우선적으로 축적될 수 있습니다[28, 29 ]. PEG화된 MSN은 주로 간, 비장 및 폐의 RES에 포획되어 투여량의 80% 이상을 차지했습니다. MSN의 PEG 변형은 장기에서 MSN의 제거율을 분명히 감소시켰으며, 이는 PEG화된 NP가 입자 모양에 관계없이 RES 장기에서 제거하기가 더 어렵다는 것을 보여줍니다[30, 31]. 전반적으로, HNSCC 모델에 대한 생체 내 연구는 안정적인 나노운반체에서 5-FU+ß-lap의 효과적인 조합이 관련 독성 효과를 완화하면서 종양의 치료 효능을 향상시킬 수 있다는 "개념 증명"을 제공합니다.
<그림><그림>
아 HNSCC 이종이식 모델에서 FNQ-MSN의 생체내 항종양 효능. HNSCC 종양이 있는 마우스에 5-FU, ß-lap, 5-FU+ß-lap 및 FNQ-MSN을 5 mg/kg의 5-FU 및 10 mg/kg의 ß-lap의 고정 용량으로 정맥 주사했습니다. 3번. 종양 부피는 효능 분석의 일부로 기록되었고 처리되지 않은 대조군과 비교되었습니다. ㄴ 종양 부피 데이터에 해당하는 체중 분석. *p <0.05 및 ***p <0.001
데이터 및 자료의 가용성
이 연구 동안 생성되거나 분석된 모든 데이터는 이 출판된 기사와 추가 정보 파일에 포함되어 있습니다.
