메조포러스 실리카 나노입자로 NQO1 억제제와 5-플루오로우라실 동시 전달: 두경부 편평세포암 항종양 활성 강화

초록

두경부 편평세포암(HNSCC)은 가장 치명적인 암 형태 중 하나로, 90%가 편평세포에서 기원합니다. NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 1(NQO1)은 편평세포암에서 과발현되는 효소로 증식과 화학저항성에 중요한 역할을 합니다. 본 연구의 주요 목적은 HNSCC에서 β-라파콘(임상 형태 ARQ761)의 억제 효과를 연구하고, 5-FU와 β-라파콘 병용이 HNSCC에서 치료 효능 개선에 미치는 병용 효과를 연구하는 것이었습니다. 5-FU/β-라파콘이 적재된 지질 이중층 조립 메조포러스 실리카 나노입자를 제조하여 물리화학적, 생물학적 특성을 연구했습니다. β-라파콘은 Cal33 세포에서 농도 의존적으로 NQO1 효소 활성을 억제했습니다. 특히 20~50 μg/mL β-라파콘 용량에서 유의한 억제 효과를 관찰했습니다. 5-FU+β-라파콘 병용으로 세포 생존율이 낮아졌으며, 가장 주목할 점은 5-FU/β-라파콘 적재 메조포러스 실리카 나노입자(FNQ-MSN)가 개별 약물이나 물리적 병용보다 유의하게 낮은 세포 생존율을 보였다는 것입니다. β-라파콘은 대조군 대비 NQO1 단백질 밴드를 감소시켰으나, 가장 현저한 NQO1 수치 감소는 FNQ-MSN 처리 세포군에서 관찰되었습니다. FNQ-MSN은 60% 이상의 세포 사멸(초기 및 후기 사멸)과 암세포의 현저한 핵 분열을 유도하여 전달체 기반 병용 요법의 우수한 항암 효과를 입증했습니다. 5-FU+β-라파콘 물리적 혼합물로 종양 부피가 현저히 감소했으나, 전달체 기반 5-FU와 β-라파콘 병용(FNQ-MSN)은 종양 성장을 유의하게 지연시키고 종양 이종이식 마우스의 생존을 연장시켰습니다. 이러한 발견은 HNSCC 치료에서 NQO1 억제제가 5-FU의 화학요법 잠재력을 강화할 잠재력을 시사합니다.

서론

두경부 편평세포암(HNSCC)은 가장 치명적인 암 형태 중 하나이며 90%가 편평세포에서 기원합니다[1]. HNSCC는 높은 혈관신생성을 보이며, 그 혈관은 섬유아세포 성장 인자(FGFs)와 혈관내피 성장 인자(VEGFs) 등 다양한 사이토카인을 발현하여 높은 전이와 낮은 생존율과 연관됩니다[2]. 중국에서 HNSCC 발생률은 암 관련 사망 원인 6위로, 2015년 약 250,000건 신규 사례와 77,500건 사망이 보고되었습니다. 공격적 성격, 조기 재발, 높은 전이율, 나쁜 예후로 인한 높은 사망률로 HNSCC의 전체 5년 생존율은 매우 낮습니다[3]. HNSCC 주요 치료법은 수술 후 방사선요법 또는 화학요법입니다. 구체적으로 화학요법을 초기 단계나 수술 후 단계에서 효과적으로 사용하면 종양 성장을 억제할 수 있습니다[4, 5]. 화학요법을 효과적으로 사용하면 종양 조직 내 암세포를 근절하고 종양 재발을 억제할 수 있습니다. 그러나 단일 제제 기반 장기 화학요법은 종종 약물 내성과 치료 효능 저하를 초래합니다[6]. 따라서 HNSCC 환자의 생존율과 삶의 질을 개선하기 위한 혁신적 전략이 필요합니다.

HNSCC 치료에 사용되는 여러 항암제로는 시스플라틴, 5-플루오로우라실(5-FU), 파클리탁셀, 도세탁셀 등이 있습니다. 이 중 5-FU는 HNSCC 및 기타 편평세포암 치료에서 1차 요법으로 사용됩니다[7]. 5-FU는 피리미딘 유사체로 암세포 내 티미딜레이트 신타제를 비가역적으로 억제하여 DNA 복제를 차단함으로써 세포 사멸을 유도합니다[8]. 모든 항암제와 마찬가지로 5-FU도 전신 순환에서 부작용이 없고 정상 조직에 독성을 일으키지는 않지만, 5-FU를 제2 제제와 병용하면 부작용을 줄이고 암 치료에서 전체 치료 효능을 잠재적으로 개선할 수 있다고 보고되었습니다[9].

NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 1(NQO1)은 정상 조직에 비해 종양 조직에서 100-200배 높게 발현되는 플라보단백질입니다[10]. 이 2전자 산화환원효소는 유도 가능한 2상 해독 효소로 퀴논을 안정한 하이드로퀴논으로 형성하여 해독합니다[11]. NQO1은 정상 인간 조직에서 낮은 기초 수준으로 발현되어 세포를 산화환원 순환과 산화 스트레스로부터 보호하고 p53 억제제를 안정화시킵니다. NQO1은 유방암, 췌장암, 편평세포암을 포함한 여러 암에서 구성적으로 과발현됩니다[12]. NQO1 과발현은 암 부담 진행을 촉진하고 5-FU나 시스플라틴 같은 화학요법제(산화 스트레스 유도제)에 암세포를 더 내성 있게 만들어 NQO1을 치료 효능 개선을 위한 잠재적 종양 표적으로 만듭니다[13]. NQO1을 siRNA로 녹다운하면 젬시타빈이나 독소루비신 같은 여러 약물의 세포독성 효과가 강화된다고 보고되었습니다[14]. 또한 여러 합성 및 천연 NQO1 억제제가 보고되었는데, 쿠마린, 커큐민, ES936 등이 있습니다[15,16,17]. 본 연구에서는 β-라파콘(β-lap, 3,4-디하이드로-2,2-디메틸-2H-나프토[1,2-b]피란-5,6-디온)을 NQO1 억제제로 사용했습니다[18]. β-라파콘은 NQO1 의존적 메커니즘으로 작용하여 상당한 양의 활성산소종(ROS)을 생성하여 DNA 가닥 손상을 일으키고 암세포 사멸을 유도합니다[19].

나노입자를 이용한 소분자 전신 전달은 암 치료에서 유망한 접근법이 되고 있습니다[20]. 약물 적재 나노입자는 투여 횟수를 줄이고 항암 효능을 개선하며 부작용을 상대적으로 감소시킵니다. 모든 전달체 중 메조포러스 실리카 나노입자(MSN)는 약물 탑재물을 종양 조직에 효과적으로 전달할 큰 잠재력을 가집니다[21, 22]. 미크론 크기 기공은 약물의 안정적 적재를 허용하고 전신 순환에서의 방출을 방지하며, 향상된 투과성 및 잔류 효과(EPR 효과)를 이용해 누출성 암 조직에 선택적으로 축적되게 합니다[23].

전반적으로 본 연구의 주요 목적은 5-FU와 NQO1 억제제의 치료적 이점을 결합하여 HNSCC에서 항암 효과를 강화하는 것이었습니다. 체외 항암 효과는 세포 생존율, 웨스턴 블롯 분석, 유세포계측/Hoechst 기반 세포사멸 분석, 생존/사멸 분석 등 다양한 기법으로 분석했습니다. 체내 연구는 Cal33 종양 세포 이종이식 모델에서 수행했습니다.

결론

요약하자면, 5-FU+β-라파콘 적재 지질 이중층 코팅 메조포러스 실리카 나노입자를 성공적으로 제조했습니다. 우리는 (i) HNSCC 종양 세포에서 β-라파콘의 농도 의존적 항종양 효과, (ii) 5-FU+β-라파콘 병용으로 NQO1 단백질과 Bcl-2 단백질의 유의한 억제, (iii) FNQ-MSN 기반 병용으로 HNSCC 이종이식 모델에서 종양 부담의 유의한 감소를 보였습니다. 이 데이터들은 NQO1 억제제(β-라파콘)의 아치사량이 HNSCC 종양에서 5-FU의 치료 효능을 잠재적으로 강화할 수 있으며, 다른 악성 종양의 임상 치료로 잠재적으로 확장될 수 있음을 명확히 가리킵니다.

재료 및 방법

5-FU/β-라파콘 적재 지질 이중층-메조포러스 실리카 나노입자 제조

세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)(210 mg)를 180 mL 물에 녹여 80°C로 끓인 후, 총 나노입자의 20% w/w로 5-FU와 β-라파콘을 첨가하고, 플루오르화암모늄(NH4F)(30 mg)을 넣고 60분간 잘 저었습니다. 다음으로 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS) 1.6 mL를 30분간 적가하고 3시간 연속 교반했습니다. 반투명 백색 콜로이드가 형성되어 10000 rpm, 24 ± 1°C에서 15분 원심분리 후 수집했습니다. MSN을 초순수에 재현탁하고 원심분리 사이클을 2회 반복했습니다. 별도로 DSPE-PEG2000(총 MSN 중량의 2%)을 사용해 박막 막을 제조하고 약물 적재 MSN 현탁액으로 수화했습니다. 혼합물을 실온(25°C)에서 50 W로 5분간 프로브 초음파 처리했습니다. PEG화 지질 이중층 지지 MSN을 최종적으로 2회 세척하고 초순수에 재현탁했습니다.

입자 크기, 제타 전위 분석, 형태 분석

입자 직경, 다분산 지수(PDI), 제타 전위는 제타사이저 나노 ZS(Malvern Instruments, 영국 말번)로 평가했습니다. 입자는 동적 빛 산란(DLS) 기법으로 분석했으며, 입자 분산액을 실험 전 잘 희석했습니다. 모든 실험은 실온에서 3회 반복 수행했습니다. 나노입자 형태는 투과전자현미경(TEM, CM 200 UT, Philips, 미국 MA, 100 kV 작동)으로 확인했습니다. 간단히 입자 분산액을 희석해 한 방울을 300-메쉬 TEM 그리드에 놓고 10분간 침전시켰습니다. 입자를 2% 인산텅스텐산(PTA)으로 대조 염색(음성 염색)하고 공기 건조 후 TEM 현미경으로 관찰했습니다.

약물 적재

비적재 또는 비결합 약물을 상등액에서 계산하고 나노입자에 적재된 약물을 계산하는 두 가지 방법으로 약물 적재 분석을 수행했습니다. 약물 적재 효율은 HPLC 법으로 수행했습니다. HPLC는 Shimadzu LC-20 AD PLC 펌프와 SPD-M20A PDA 검출기, 분석 소프트웨어 Shimadzu LC(역상 C18 컬럼, Phenomenex C18, 150 × 4.6 mm, 5 μm)를 장착했습니다. 5-FU의 이동상은 아세토니트릴과 물 혼합물(10:90, v/v)로 1 mL/min 유속으로 펌핑했습니다. 5-FU 검출 파장은 265 nm로 설정했습니다. β-라파콘의 이동상은 아세토니트릴/물(31:69, v/v)이고 검출 파장은 35°C에서 254 nm로 설정했습니다. 5-FU/β-라파콘의 적재 용량(LC)과 적재 효율(LE)은 각각의 공식으로 계산했습니다.

$$ \mathrm{LE}\ \left(\%\right)={W}_{t\mathrm{otal}\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\beta}-\mathrm{lap}}-{W}_{\mathrm{free}\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\beta}-\mathrm{lap}}/{W}_{\mathrm{total}\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\beta}-\mathrm{lap}}\times 100 $$

$$ \mathrm{LC}\ \left(\%\right)={W}_{\mathrm{total}\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\beta}-\mathrm{lap}}-{W}_{\mathrm{free}\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\beta}-\mathrm{lap}}/{W}_{\mathrm{total}\ \mathrm{NP}\ \mathrm{mass}}\times 100 $$

약물 방출 연구

5-FU와 β-라파콘의 FNQ-MSN으로부터의 방출을 PBS(pH 7.4)와 ABS(pH 5.0)에서 37°C, 투석법으로 평가했습니다. 간단히 각 약물 적재 나노입자 1 mg 상당량을 투석막에 넣고 1 mL 각 완충액에 담아 양 끝을 밀봉했습니다. 밀봉된 투석막을 각 ABS와 PBS 완충액 25 mL에 넣고 37°C 진탕 수조에 두었습니다. 정해진 시간 간격으로 시료를 채취하고 동일 부피의 신선한 완충액으로 대체했습니다. 각 완충액에 방출된 약물 양은 앞선 섹션에서 설명한 HPLC 법으로 평가했습니다.

세포 배양 및 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 1(NQO1) 활성 분석

Cal33 HNSCC 세포를 10% FBS와 1% 항생제 혼합물을 보충한 Dulbecco 변형 Eagle 배지(DMEM)에서 배양했습니다. 세포를 인큐베이터에서 주변 조건으로 유지했습니다. NQO1 활성 분석을 위해 Cal33 세포를 96웰 플레이트에 웰당 8 × 10³ 세포 밀도로 접종하고 하룻밤 배양했습니다. 세포를 다양한 농도의 β-라파콘으로 처리하고 24시간 배양했습니다. 0.8% 디지토닌(2 nM EDTA 50 μL)으로 세포를 용해시키고, 메나디올과 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)를 기질 커플링 반응으로 사용해 분석을 수행하고 620 nm에서 활성을 측정했습니다. 분석은 3회 반복 수행했습니다.

체외 세포 생존율 분석

β-라파콘의 농도 증가에 따른 세포 생존율 분석과 개별 및 병용 요법의 세포 생존율 분석을 MTS 분석법으로 수행했습니다. 간단히 Cal33 세포를 96웰 플레이트에 웰당 1 × 10⁴ 세포 밀도로 접종하고 하룻밤 배양했습니다. 다음 날 세포를 증가하는 농도의 β-라파콘으로 별도 처리하고, 별도로 5-FU와 β-라파콘의 개별 및 병용 요법을 5, 10, 20 μg/mL 기본 농도로 처리하고 24시간 배양했습니다. 세포를 2회 세척하고 제조사 지침에 따라 MTS 용액으로 처리했습니다. 세포 생존율을 미처리 세포 대비 계산하고, 마이크로플레이트 리더로 460 nm에서 흡광도를 측정했습니다.

웨스턴 블롯 분석

6웰 플레이트에 접종된 세포를 증가하는 농도의 β-라파콘으로 별도 처리하고, 5-FU 또는 β-라파콘 개별 처리와 5-FU와 β-라파콘 병용(FNQ-MSN) 처리 후 24시간 배양했습니다. 세포를 수확, 용해(M-per 버퍼), 원심분리하고 상등액에 포함된 단백질을 수집했습니다. 세포 용해액 단백질 농도를 비신코닌산(BCA) 법으로 평가했습니다. 10% Bis-Tris 폴리아크릴아미드 겔로 단백질을 분리하고 즉시 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 전이했습니다. 막을 5% 탈지유(TBST, pH 7.2)로 차단했습니다. 토끼 다클론 NQO1(1:1000), 마우스 단일클론 Bcl-2(1:1000), 마우스 단일클론 GAPDH(1:1000) 일차 항체를 막에 넣고 4°C에서 하룻밤 배양했습니다. 막을 TBST로 세척하고 이차 항체(항마우스 또는 항토끼 IgG)를 1:10000 희석으로 배양했습니다. 막을 다시 TBST로 세척하고 ECL 기질 용액에 노출시켜 단백질 밴드 농도를 포토디벨로퍼로 평가했습니다.

세포사멸 및 Hoechst 분석

Cal33 세포를 6웰 플레이트에 웰당 2 × 10⁵ 세포 밀도로 접종하고 하룻밤 배양했습니다. 세포를 개별(5-FU 또는 β-라파콘) 및 병용(5-FU와 β-라파콘, FNQ-MSN) 요법으로 처리하고 24시간 배양했습니다. 세포를 수확, 세척, 원심분리, 펠릿화했습니다. 세포를 2.5 μL 안넥신 V와 2.5 μL PI로 처리하고 암조건에서 15분 배양했습니다. 세포를 1 mL로 맞추고 형광활성화 세포 분리(FACS, BD, FACSverse)로 평가했습니다. 총 10,000개 세포를 분석했습니다. 유사한 세포 접종 및 약물 처리 절차를 따르고 Hoechst 33342 염료(10 μg/mL)로 염색하고 10분 배양했습니다. 세포를 세척하고 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하고 다시 세척했습니다. 세포 형태를 형광 현미경(Nikon A1, 일본)으로 관찰했습니다.

HNSCC 이종이식 종양 모델에서 FNQ-MSN 항종양 효능

18~22g, 평균 4~5주령 수컷 BALB/c 마우스를 중국 허난 정저우 경공업대학 부속 실험동물센터에서 구입했습니다. 동물을 12시간 명암 주기의 항온실에 두고 먹이와 물을 자유롭게 섭취하게 했습니다. 모든 동물 실험 프로토콜은 정저우 경공업대학 윤리위원회 승인을 받았습니다. 이종이식 모델 구축을 위해 1 × 10⁷ Cal33 세포를 150 μL 배양액에 현탁하여 마우스 오른쪽 엉덩이 피하에 접종했습니다. 평균 종양 크기가 80~100 mm³에 도달하면 마우스를 대조군, 5-FU, β-라파콘, 5-FU+β-라파콘, FNQ-MSN 5개 그룹으로 무작위 배정하고 각 그룹당 8마리씩 배정했습니다. 5-FU를 5 mg/kg 고정 용량으로, β-라파콘을 25 mg/kg 고정 용량으로 투여하고, 3일 간격으로 3회 꼬리정맥 주사했습니다. 마우스 체중과 종양 부피를 18일간 정기적으로 모니터링했습니다. 종양 부피는 다음 공식으로 계산했습니다.

$$ V\ \left({\mathrm{mm}}^3\right)={\mathrm{Width}}^2\ \left({\mathrm{mm}}^2\right)\times \mathrm{Length}\ \left(\mathrm{mm}\right)/2 $$

본 연구에서는 종양 세포 접종으로 인한 마우스 사망은 관찰되지 않았으며, 연구 종료 시 모든 동물을 CO₂로 안락사시키고 경추 탈골로 희생시켰습니다.

통계 분석

다군 비교는 이원 분산 분석(ANOVA) 사용했습니다. 유의수준 p < 0.05를 유의한 것으로 간주하고, 특별히 언급되지 않는 한 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈습니다.

결과 및 고찰

5-FU/β-라파콘 적재 지질 이중층 지지 메조포러스 실리카 나노입자 제조

본 연구에서는 PEG화 지질 이중층으로 안정화된 메조포러스 실리카 나노입자를 맞춤 제작했습니다. 5-FU/β-라파콘 적재 MSN을 유화-초음파법으로 제조한 후, DSPE-PEG2000으로 구성된 지질 박막이 든 플라스크에 약물 적재 MSN을 넣었습니다. 혼합물을 초음파 처리하여 5-FU/β-라파콘 함유 지질 코팅 MSN(FNQ-MSN)을 얻었습니다(그림 1a). 5-FU와 β-라파콘의 적재 효율(LE)은 각각 91.5 ± 1.65%와 92.9 ± 1.24%였습니다. FNQ-MSN은 5-FU 8.1 ± 1.12 wt%와 β-라파콘 7.6 ± 0.95 wt%를 나타내어 MSN 전달체의 높은 적재 용량(LC)을 보여주었습니다. 지질 이중층 존재는 전신 순환에서의 원치 않는 방출을 방지하여 독성을 예방합니다. 약물 적재 MSN 평균 입자 크기는 92.1 ± 0.85 nm(PDI ~ 0.089)였으며, MSN 표면에 지질 이중층 조립(FNQ-MSN) 후 평균 입자 크기가 128.4 ± 1.24 nm(PDI ~ 0.115)로 증가하여 지질 물질이 MSN 표면에 견고하게 존재함을 나타냈습니다(그림 1b). 제타 전위는 -18.2 ± 1.22에서 -26.4 ± mV로 변화했습니다. FNQ-MSN의 작은 입자 크기는 EPR 효과에 의해 누출성 종양 조직에 약물 적재 전달체가 선택적으로 축적되게 합니다. 또한 표면 PEG화는 우수한 안정성과 연장된 혈액 순환 시간을 부여하여 FNQ-MSN이 종양 조직에 도달할 기회를 더욱 높입니다. TEM 이미지는 리포좀과 유사한 형태학적 특징을 보이며 그리드에 균일하게 퍼진 완벽한 구형을 나타냈습니다. TEM 이미지는 회색 외부 층과 어두운 핵심을 명확히 보여주어 MSN 표면에 지질 조립이 있음을 나타냈습니다(그림 1c). TEM에서 관찰된 크기는 제타사이저 DLS 입자 크기와 일치했습니다. MSN은 약물 분자의 균일 분포를 위한 정렬된 기공을 가집니다. 기공 표면 특성은 소분자 안정적 적재의 중요한 요소 중 하나입니다. 호스트-게스트 상호작용에 관여하는 다양한 물리적 힘에는 주로 소수성 힘과 반데르발스 상호작용 힘이 포함됩니다. 높은 약물 적재 용량은 종양 부위에서 더 높은 세포 내 농도와 더 높은 살상 효율을 제공합니다. FNQ-MSN은 PBS 배지에서 우수한 안정성을 보이며 연구 기간 30일까지 입자 크기가 변하지 않았습니다. 이러한 전달체 시스템의 향상된 안정성과 높은 적재 용량은 종양 치료에서 생체분포와 효율을 개선할 것입니다.

체외 약물 방출

FNQ-MSN으로부터의 5-FU와 β-라파콘 체외 방출을 PBS와 ABS에서 연구했습니다(그림 2). pH 7.4와 pH 5.0에서 두 가지 다른 방출 경향을 관찰했습니다. 예를 들어, pH 7.4에서 24시간 내 5-FU 25% 방출된 반면, pH 5.0에서는 24시간 내 약 40% 방출되었습니다. 마찬가지로 β-라파콘은 pH 7.4와 pH 5.0에서 각각 20%와 30% 방출되었습니다. 방출 동역학은 연구 기간 내내 동일했으며, 알칼리성 완충액에서 5-FU 50% 방출, pH 5.0에서 72시간 후 80% 방출되었습니다. 산성 조건에서 pH 감응성 약물 방출은 암 치료에 유리합니다. 두 pH 조건 모두에서 급속 방출 현상은 관찰되지 않았으며, 이는 주로 DSPE-PEG 층이 연구 기간 내내 FNQ-MSN으로부터 약물 방출을 제어했기 때문입니다. pH 7.4와 pH 5.0 조건 간 약물 방출에 유의한 차이가 관찰되었습니다. pH 7.4 조건에서 PEG-b-DSPE는 높은 스텔스 층 특성을 보여 캡슐화된 화합물 방출을 방지합니다. 현재 결과는 pH 5.0에서 약물 방출이 가속화됨을 보여주며, 이는 MSN 표면 주위 보호 쉘의 분해를 나타냅니다. 최대 약물 방출을 암세포 내에서 보장하는 pH 감응성 약물 방출 속도는 항종양 효능을 개선하고 정상 조직에 대한 원치 않는 독성을 감소시킬 수 있습니다. pH 감응성 요소가 존재하면 FNQ-MSN이 MSN 표면의 지질 이중층 탈락을 초래하여 낮은 pH 조건에서 방출이 강화될 수 있습니다.

β-라파콘에 대한 NQO1 감수성

HNSCC를 포함한 많은 암세포에서 NQO1 상향조절이 나쁜 예후와 치료 결과와 연관되므로, NQO1 표적 약물은 암 치료를 위한 잠재적 전략이 될 수 있습니다[24]. NQO1은 정상 조직 관련 조직에 비해 편평세포암에서 100~200배 수준으로 과발현됩니다. 따라서 Cal33 세포에서 β-라파콘의 NQO1 효소 활성 영향을 연구했습니다. 그림 3a에서 β-라파콘이 Cal33 암세포에서 농도 의존적으로 NQO1 효소 활성을 억제함을 보였습니다. 특히 20~50 μg/mL β-라파콘 용량에서 유의한 억제 효과를 관찰했습니다. 또한 웨스턴 블롯 분석으로 β-라파콘의 NQO1 단백질 억제 잠재력을 추가 연구했습니다(그림 3b). 결과는 β-라파콘 농도 증가에 따라 암세포에서 NQO1 단백질이 유의하게 감소함을 명확히 보여주었습니다. 약 100 μg/mL β-라파콘에서 80% NQO1 억제를 관찰했습니다. NQO1 생체활성화 약물인 β-라파콘은 NQO1에 의해 대사되어 불안정한 하이드로퀴논 화합물을 형성하고, 이는 즉시 원래 성분으로 돌아가며 2개의 1전자 산화를 남기고 2 O²⁻를 소모합니다. 이는 1분자 β-라파콘이 60~70몰 NAD(P)H를 소모하며 130몰 초산화물을 생성하는 헛된 산화환원 순환을 만듭니다. 이렇게 형성된 초산화물(O₂^•−) 라디칼은 과산화수소(H₂O₂)로 전환되어 세포 사멸과 세포 죽음을 유발합니다[25].

HNSCC 세포에서 FNQ-MSN 체외 항암 효과

MTT 분석법으로 Cal33 세포에서 β-라파콘 체외 항암 효과를 연구했습니다. 결과는 β-라파콘이 전형적인 농도 의존적 세포 생존율 감소를 보임을 나타냈습니다(그림 4a). 특히 50 μg/mL 농도에서 유의한 세포 생존율 감소를 관찰했습니다. 추가 실험을 위해 β-라파콘 IC50 값 이하인 20 μg/mL를 선택했습니다. 다음으로 3가지 다른 농도(5, 10, 20 μg/mL)에서 β-라파콘의 5-FU 잠재화 효과를 연구했습니다. 그림 4b에서 5-FU+β-라파콘 병용으로 세포 생존율이 낮아졌으며, 가장 주목할 점은 FNQ-MSN이 개별 약물이나 물리적 병용보다 유의하게 낮은 세포 생존율을 보였다는 것입니다. 예를 들어, 5-FU와 β-라파콘은 각각 35.7%와 70.2% 세포 생존율을 보인 반면, 5-FU+β-라파콘은 26.5%, FNQ-MSN은 13.1%를 보였습니다. 결과는 5-FU의 세포독성 효과가 β-라파콘과 병용 시 유의하게 증가함을 명확히 보여주었습니다. FNQ-MSN이 5-FU+β-라파콘보다 더 효과적이었음을 주목할 만하며, 이는 전달체 시스템으로부터 탑재된 치료제의 더 나은 내부화와 제어된 방출 덕분입니다. 결과는 β-라파콘의 NQO1 효소 활성과 단백질 수준에 대한 억제 효과와 5-FU 항암 효과 잠재화를 명확히 드러내며, HNSCC 치료에서 향상된 치료 결과를 가져옵니다.

FNQ-MSN의 신호 전달 경로 역할: 웨스턴 블롯 분석

β-라파콘 매개 세포독성 메커니즘을 웨스턴 블롯 분석으로 추가 탐구했습니다. 그림 4c에서 β-라파콘은 대조군 대비 NQO1 단백질 밴드를 감소시켰으나, 가장 현저한 NQO1 수치 감소는 FNQ-MSN 처리 세포군에서 관찰되었습니다. β-라파콘 유도 Cal33 화학감수성 증가는 Bcl-2 단백질 수준을 통해 세포사멸 증진으로 평가되었습니다. Bcl-2 패밀리는 세포 항상성 조절과 암세포 증식 및 죽음 조절에 중요한 역할을 합니다. Bcl-2 감소와 Bax 증가는 사이토크롬 C를 세포질로 방출하여 전체 카스파제 캐스케이드를 개시하여 세포 죽음을 유도합니다[26]. 결과는 5-FU와 β-라파콘 병용(FNQ-MSN)이 Bcl-2를 유의하게 다운레귤레이션하여 Cal33 암세포에서 항암 효과를 강화함을 명확히 강조했습니다.

HNSCC 세포사멸 분석

세포 생존율 분석 후, 안넥신 V/PI 이중 염색 후 유세포계측으로 개별 및 병용 약물의 Cal33 세포 세포사멸 효과를 평가했습니다(그림 5). 개별 5-FU(10 μg/mL) 또는 β-라파콘(30 μg/mL) 세포사멸 효과는 암세포에서 눈에 띄는 세포사멸을 유도하지 않았으나, 5-FU+β-라파콘은 암세포 세포사멸 비율을 극적으로 증가시켰습니다. 중요하게, FNQ-MSN은 60% 이상의 세포사멸(초기 및 후기 세포사멸)을 유도하여 전달체 기반 병용 요법의 우수한 치료 효과를 의미했습니다. 세포사멸 효과는 Hoechst 33342 염색으로 추가 확인되었습니다. 그림 6에서 FNQ-MSN 처리 세포는 5-FU나 β-라파콘 단독 처리보다 더 많은 세포가 세포사멸, 핵 응축, 분열 특징을 보였습니다. 세포사멸 과정에서 세포는 외부 세포막 손상 없이 수축하며 염색질 응축과 증가된 세포사멸체 형성을 초래합니다.

생존/사멸 분석

개별 및 병용 약물 항암 효과를 생존/사멸 분석으로 추가 평가했습니다. 처리된 세포를 각각 생존 및 사멸 세포 마커인 칼세인 AM과 에티디움 브로마이드 염색했습니다(그림 7). 미처리 세포는 100% 녹색 형광으로 염색되었습니다. 개별 약물 5-FU(10 μg/mL) 또는 β-라파콘(30 μg/mL)은 약간의 적색 형광 염색 세포를 보였으나, 우세한 세포가 녹색 형광을 보여 제한된 세포 죽음을 나타냈습니다. FNQ-MSN 처리 암세포에서 우세한 적색 형광과 적은 녹색 형광 염색 세포로 현저한 세포 죽음을 관찰했습니다. FNQ-MSN의 높은 항암 효과는 암세포에서 5-FU와 β-라파콘의 상승적 활성과 β-라파콘의 5-FU 화학감수성 증가 능력에 기인합니다.

HNSCC 이종이식 모델에서 FNQ-MSN 체내 항종양 효능

동물 모델에서 병용 요법 효능을 추가 평가하기 위해 HNSCC 이종이식을 준비하고 5 mg/kg 5-FU와 10 mg/kg β-라파콘을 각각 투여했습니다. β-라파콘 의약품 등급은 ARQ761로 현재 전이성 악성 종양 치료를 위한 1상 임상시험 중입니다. β-라파콘은 전임상 연구에 따라 인간 최대 내약 용량 한계를 설정했습니다[27]. 이를 고려하여 체내 연구에 β-라파콘 10 mg/kg 최적 용량을 선택했습니다. 그림 8a에서 개별 투여된 5-FU와 β-라파콘은 비처리 대조군 대비 유의한 종양 부피 감소를 보이지 않았습니다. 5-FU+β-라파콘 물리적 혼합물로 주목할 만한 종양 부피 감소가 관찰되었으나, 전달체 기반 5-FU와 β-라파콘 병용(FNQ-MSN)은 종양 성장을 유의하게 지연시키고 종양 이종이식 마우스의 생존을 연장시켰습니다. FNQ-MSN 종양 부피 그래프는 두 부분으로 나눌 수 있습니다; 9일까지 종양 부피 증가가 미미했으나 9일 후 18일까지 종양이 유의하게 증가했지만, 전반적 종양 부피는 대조군이나 다른 그룹에 비해 현저히 작았습니다. 개별 및 병용 요법의 독성 우려를 체중 측면에서 평가했습니다(그림 8b). 5-FU+β-라파콘 물리적 혼합물은 체중 10% 이상 감소로 심각한 독성을 보인 반면, 5-FU는 5% 체중 감소를 보였습니다. 예상대로 FNQ-MSN은 체중 감소를 일으키지 않아 지질-MSN 기반 전달체 시스템의 독특한 이점을 나타냈습니다. FNQ-MSN의 향상된 항종양 효과는 β-라파콘의 NQO1 효소 및 단백질 억제 효과가 5-FU 화학감수성을 증가시켜 Cal33 인간 종양에서 상승적 항암 효과를 가져온 것, 지질 이중층 코팅 MSN이 전신 순환 중 약물을 보호하고 종양 조직에서 제어된 방식으로 방출할 수 있는 것, 나노전달체 PEG화가 혈액 순환 시간을 연장하여 EPR 효과로 종양 조직에 선택적 축적을 허용하는 것 등에 기인합니다[28, 29]. PEG화 MSN은 주로 간, 비장, 폐 RES에 갇혀 투여 용량의 80% 이상을 차지했습니다. MSN PEG 변형은 장기에서 MSN 청소율을 명백히 감소시켜 PEG화 NP가 입자 모양에 관계없이 RES 장기에서 제거되기 더 어렵게 만들었습니다[30, 31]. 전반적으로 HNSCC 모델 체내 연구는 안정적 나노전달체 내 5-FU+β-라파콘 효과적 병용이 종양에서 치료 효능을 강화하면서 관련 독성 효과를 완화할 수 있다는 '개념 증명'을 제공합니다.