HIFU(고강도 집속초음파)는 대표적인 비침습적 암 치료법이지만 치료 효능이 낮고 주변 정상 조직에 손상을 줄 위험이 있어 향후 임상 개발 및 적용에 어려움을 겪고 있다. Sonodynamic Therapy(SDT)는 초음파 치료 중 초음파 과민제에 의해 생성된 반응성 산소 분자를 통해 종양 세포를 죽입니다. SDT는 미세 기포와 같은 HIFU 효능을 향상시킬 수 있습니다. 이 작업에서 우리는 나노 스케일 N2를 개발했습니다. O 미세 기포(N2 O-mbs) 개선된 기계적 진동 방법에 의해. 이러한 미세 기포는 우수한 생체 적합성과 종양 세포 결합을 보여주었습니다. N2의 음향 감도 O-mbs는 활성 산소 종 생성의 검출을 통해 세포 외 및 세포 내에서 모두 검출되었습니다. 종양 세포에 대한 이러한 sonodynamic microbubble의 독성 효과와 HIFU 치료에 대한 시너지 효과를 평가했습니다. N2에 의해 생성된 활성 산소 종에 의해 상당한 세포 사멸이 발생했습니다. 초음파 조사에서 O-mbs. N2 HIFU와 결합된 O-mbs는 시험관 내에서 종양 세포 괴사와 세포자멸사를 증가시켰고 생체 외에서 소의 간 표적 영역에서 응고 괴사 부피 및 에코 강도를 증가시켰습니다. 이러한 소노다이나믹 마이크로버블은 또한 생체 내에서 종양 성장을 효율적으로 억제하는 것으로 입증되었습니다. N2 O-mbs는 미세 기포와 탁월한 초음파 감도의 장점으로 인해 HIFU의 치료 및 절제 효과에 상당한 영향을 미칩니다. 이 발견은 N2 O-mbs는 HIFU 종양 열 절제를 촉진하는 데 사용할 수 있는 새로운 초음파 보조제일 수 있습니다.
악성종양은 인간의 생명과 건강을 위협하는 주요 질병 중 하나이다[1]. 고강도 집속 초음파(HIFU)는 종양의 비침습적 국소 절제를 위한 새로운 기술입니다. HIFU는 간, 신장, 췌장, 전립선, 유방, 뼈 및 자궁의 양성 및 악성 고형 종양 치료에 성공적으로 사용되었습니다[2, 3]. 그러나 치료 중 초음파 에너지의 감쇠, 표적 부위의 에너지 축적 약화, 비표적 건강 조직의 손상 등 HIFU의 고유한 한계는 치료 효과를 감소시킨다[4, 5]. HIFU 조사에 의해 형성된 초점 필드는 일반적으로 밀리미터 크기로 작습니다. 큰 종양을 절제하는 데는 오랜 시간이 걸립니다. HIFU 조사 시간을 연장하면 체온이 39.2 °C까지 상승합니다. 체내 종양의 깊이가 깊어질수록 HIFU 절제 에너지도 증가해야 한다[6]. 이는 환자의 신체적 손상 위험을 증가시키고 HIFU 치료의 효율성과 안전성을 감소시킵니다. 따라서 연구자들은 최근 몇 년 동안 HIFU의 치료 효율을 높이는 방법을 찾기 위해 노력했습니다[7,8,9]. 미세 기포는 HIFU 치료 효능을 상승적으로 향상시킬 수 있습니다[7, 10]. 미세 기포의 가스는 높은 음향 임피던스 물질에 속합니다. 미세 기포는 HIFU가 종양 조직 영역에 조사될 때 표적 영역에서 초음파의 산란 및 반사를 증가시킨다[11, 12]. 미세 기포는 종양 표적 부위의 온도를 높이고 표적 부위에 HIFU 에너지 축적을 증가시켜 HIFU 치료의 열 효과를 향상시킨다[13]. 또한 외인성 공동화 핵으로서의 미세 기포는 조직 공동화 역치를 감소시키고 HIFU가 혈액 순환을 통해 종양 조직으로 통과할 때 공동화 효과를 향상시킵니다[14]. 최근 몇 년 동안 연구에 따르면 소노다이나믹 요법(SDT)이 HIFU 치료 효능을 상승적으로 향상시킬 수 있습니다[15, 16]. 초음파감작제와 초음파 사이의 상호작용은 단일항 산소와 하이드록실 라디칼을 포함한 활성산소종(ROS)을 생성하여 종양 세포를 죽이고 세포자멸사 및 괴사를 통해 종양 성장을 억제합니다[17]. SDT는 최근에 제출된 비침습적 종양 치료에서 큰 발전을 이루었습니다. 기존의 단독 요법에 비해 약물 투여량과 HIFU 조사력을 감소시킬 수 있습니다. 이 두 가지의 장점을 최대한 활용하기 위해 본 연구에서는 마이크로 버블과 소노다이내믹 효과를 결합하여 HIFU의 효능을 더욱 향상시켰습니다. Sonosensitizers는 SDT의 중요한 부분입니다[18, 19]. 현재 연구되고 있는 전통적인 음향감작제의 대부분은 감광제에서 유래한 것입니다. N2 O는 자외선 조사 조건에서 독성 물질을 생성하는 감광제[20, 21]입니다. 이 연구에서 N2의 음향 감도는 O도 처음에 탐색되었습니다. 우리는 이전에 N2 O HIFU 수술에서 흡입 마취는 복부의 두께 증가 및 피부 울혈을 포함하여 조직의 손상 정도를 악화시켰다[22]. N2 결합 활용 O와 HIFU는 조직 손상에 시너지 효과를 발휘했습니다. 그러나 생물학적 효과는 N2 O는 HIFU 치료에서 명확하지 않습니다. N2 O는 생체 변형이 없고 세포에서 조직 특이성이 없는 비교적 안정적인 저분자 가스입니다. 그것은 조직에서 널리 사용될 수 있으며 신체에 독성 효과가 없습니다 [23, 24]. 그래서, 그것은 sonosensitizer로서 매력적인 전망입니다. 이 연구에서 나노크기의 미세기포(N2 O-mbs)는 지질 포장된 N2를 사용하여 제조되었습니다. O 및 C3 F8 . N2의 복용량 O는 감소되었고 생체 내 작용 범위도 효과적으로 종양 조직 영역으로 제한되었습니다. N2의 소노다이나믹 효과 O와 HIFU 효능에 대한 시너지 효과를 조사했습니다.
1,2-디헥사데카노일-rac-글리세로-3-포스포콜린(DPPC) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N -[methoxy(polyethylene glycol)-2000](DSPE-mPEG2000)은 Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL, USA)에서 구입했습니다. 글리세린과 아가로즈는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. N2 O 및 C3 F8 Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd(중국)에서 구입했습니다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI), 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트(DiI), 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCFH-DA) , 3-아미노,4-아미노메틸-2',7'-디플루오레세인, 디아세테이트(DAF-FM DA) 및 CCK-8은 Beyotime Biotechnology(중국 충칭)에서 구입했습니다. Calcein-AM(CAM) 및 propidium iodide(PI)는 Santa Cruz Biotechnology(TX, USA)에서 입수했습니다. Annexin V-FITC/PI는 Nanjing Keygen Biotech(Nanjing, China)에서 입수했습니다. 일중항 산소 센서 그린(SOSG)은 Invitrogen(NY, USA)에서 구입했습니다.
N2 O-mbs는 기계적 진동 방법과 결합된 회전 필름에 의해 준비되었습니다. 쉘 재료로 DPPC 및 DSPE-PEG2000을 사용하고 N2 O를 핵심으로. 간단히 말해서, 5 mg DPPC, 2 mg DSPE-PEG2000 및 10 mL 클로로포름을 둥근 바닥 플라스크에 동시에 붓고 혼합하고 초음파로 완전히 용해시켰다. 그 다음, 회전 증발기(60분, 55℃, 100r/min)로 지질막을 형성하였다. 다음으로, 10% 글리세롤 2mL를 첨가하여 지질막을 수화시켜 현탁액을 제조하였다. 그 중 500 μL를 캡슐 튜브에 첨가했습니다. 캡슐 튜브는 고무 캡으로 덮었습니다. 튜브의 공기가 N2로 교체되었습니다. O 및 C3 F8 가스 치환 장치에 의해 그런 다음 현탁액을 은-수은 캡슐 혼합기(YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., 중국)로 150초 동안 기계적으로 진동시켰다. 마지막으로, 생성된 현탁액을 차등 원심분리하여 표적 N2을 얻었다. O-mbs, 300rpm에서 5분간 원심분리한 후, 800rpm에서 5분간 원심분리하였다. N2 O-mbs를 PBS에 재현탁한 다음 추가 사용을 위해 4°C에서 보관했습니다.
C3 F8 -mbs는 이전에 설명한 것과 동일한 기계적 진동 방법을 사용하여 제작되었습니다[25]. DiI 레이블 N2 O-mb는 스핀 필름 형성 동안 DiI를 추가하여 준비할 수 있습니다. N2 O는 분자량이 낮고 불안정합니다. N2 마이크로 버블의 O는 쉽게 넘칩니다. 따라서 마이크로 버블의 반감기가 감소합니다. C3 F8 초음파 미세 기포 조영제 연구에 널리 사용되는 고분자 불활성 기체입니다. C3 F8 미세 기포의 안정성을 높일 수 있습니다. 따라서 이 연구에서는 N2 O 및 C3 F8 (2:1) N2로 혼합되었습니다. 안정성을 높이는 O-mb 코어.
N2의 형태 및 크기 분포 O-mb는 명시야 광학 현미경으로 관찰되었습니다. N2의 농도 O-mbs 및 C3 F8 -mb는 계산 지침에 따라 글로불리미터로 계산했습니다. N2의 평균 입자 크기 및 제타 전위 O-mbs는 동적 레이저 광산란 시스템(Malvern Instruments, Malvern, UK)에 의해 결정되었습니다. N2의 구조와 형태 O-mbs는 투과 전자 현미경(TEM, Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)으로 특성화되었습니다. 준비된 N2 O-mbs는 4°C에서 보관되었습니다. N2의 안정성을 관찰하기 위해 O-mbs, 형태 및 농도는 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 날에 기록되었습니다. 동시에 미세 기포의 평균 입자 크기와 제타 전위를 측정했습니다.
인간 유방암 세포(MDA-MB-231; Jinxique Technology Development Co., Ltd. Chongqing, China)는 소생술 후 3개월 미만 동안 실험실에서 계대되었습니다. 세포는 5% CO2가 포함된 37°C 인큐베이터에서 유지되었습니다. , 10% 소 태아 혈청, 50㎍/L 스트렙토마이신 및 50㎍/L 페니실린을 함유하는 DMEM을 사용. 세포가 80% confluence에 도달하면 실험에 사용되었습니다.
모든 동물 실험은 Chongqing Medical University 동물 윤리 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. Chongqing Medical University (Chongqing, China)의 동물 실험 센터에서 특정 수의 암컷 누드 마우스(4-6주령, 체중 15-20g)를 구입했습니다. 고형 종양 확립을 위해 MDA-MB-231 세포(1 × 10 6 생리 식염수(100μL)에 현탁된 세포/mL)를 모든 마우스의 오른쪽 등 옆구리에 피하 주사했습니다. 종양 부피가 약 150mm 3 에 도달했을 때 모든 종양 보유 마우스를 치료 실험에 사용했습니다. .
성장기의 MDA-MB-231 세포는 약 1 × 10 5 의 밀도로 시딩되었습니다. 24시간 동안 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 플라스크당 세포. 다음으로 100μL(1 × 10 5 거품/mL)의 DiI 표지 N2 O-mbs 완전 배지 희석 용액을 첨가하여 공초점 접시를 배지로 채웠다. 접시를 마이크로플레이트 실러로 밀봉하고 N2를 유지하면서 인큐베이터에 거꾸로 보관했습니다. 세포와 접촉하는 O-mb. 2시간 및 4시간의 동시 배양 후, 세포를 PBS로 3회 부드럽게 세척하고, 4% 파라포름알데히드(PFA)로 20분 동안 고정하고, DAPI로 20분 동안 염색하였다. 마지막으로 N2의 셀 타겟팅 동작 O-mbs는 CLSM(Nikon A1, 일본)에 의해 관찰되었습니다.
N2의 세포독성 O-mb는 표준 CCK-8 분석에 의해 평가되었습니다. MDA-MB-231 세포를 96웰 플레이트(5 × 10 4 세포/웰) 24시간 동안. 다음으로 100μL의 다양한 농도(1 × 10 4 /mL, 1 × 10 5 /mL 및 1 × 10 6 /mL)/N2 O-MB가 추가되었습니다. 24시간의 인큐베이션 후, CCK-8 용액(10μL)을 각 웰에 첨가하였다. 그런 다음, MDA-MB-231 세포를 37°C에서 추가로 2시간 동안 배양했습니다. 마지막으로 각 웰의 흡광도는 Bio-Tek 마이크로플레이트 리더(Bio-Tek Instruments, Thermo Fisher Scientific, Winooski, VT, USA)를 사용하여 450nm에서 측정되었습니다.
약 20g 무게의 건강한 암컷 누드 마우스 10마리를 무작위로 두 그룹으로 나누었습니다. N2 O-mbs(n =5) 그룹에 N2를 정맥 주사했습니다. O-mbs(200μL, 1 × 10 5 /mL) 및 대조군(n =5) 생리 식염수(200μL) 주입. 21일 후 모든 마우스의 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐 및 신장)를 절제하고 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 염색했습니다.
산소 라디칼 검출 방법은 이전 보고서를 기반으로 하였다[26]. 간단히 말해서, 10 μL의 SOSG(500 μM)를 2 mL의 샘플 용액과 혼합하였다. 처리는 다음과 같이 그룹화되었습니다:그룹 C(블랭크 대조군), PBS만 첨가됨; N2 O-mbs 그룹, 100μL의 N2 O-mbs(1 × 10 5 /mL) 2mL의 PBS 용액에 첨가하고; C3 F8 -mbs 그룹, 100μL의 C3 F8 -mbs(1 × 10 5 /mL) 2mL의 PBS 용액에 첨가하고; LIFU 그룹, PBS에 초음파 조사(2 W/cm 2 ; Chongqing Medical Sciences의 초음파 영상 연구소, 중국 충칭) 100초 동안; LIFU–N2 O-mbs 그룹, N2가 추가된 PBS O-mbs는 초음파 조사되었습니다. LIFU–C3 F8 -mbs 그룹, C3이 추가된 PBS F8 -mbs는 초음파를 조사했습니다. 실험군 처리 매개변수는 2 W/cm 2 로 설정되었습니다. 그리고 100초는 실험 결과의 분석과 비교 및 문헌의 참조[27, 28]. 치료 목적으로 사용된 초음파 매개변수는 다음과 같이 설정되었습니다:주파수, 650kHz; 초점 거리, 12.5mm; 펄스파 모드, 50% 듀티 사이클; 및 펄스 지속 시간, 1초. 일중항 산소 생성( 1 O2 )는 형광 강도(λ)를 측정하여 형광 분광법(Cary Eclipse, Agilent Technologies)에 의해 결정되었습니다. 여기/λ 방출 =504 nm/525 nm). 초음파 강도 및 지속 시간의 선택은 체외 세포 실험과 일치했습니다.
SOSG assay를 이용하여 세포외 활성산소종(ROS)의 생성을 검출한 후 DCFH-DA 기반 ROS assay kit를 이용하여 세포내 ROS의 생성을 검출하였다. MDA-MB-231 세포는 약 1 × 10 5 의 밀도로 시딩되었습니다. CLSM 플라스크당 세포. 그런 다음, 대조군(처리하지 않은 그룹), N2의 6개 그룹으로 무작위로 분배되었습니다. O-mbs 전용 그룹(100μL, 1 × 10 5 거품/mL), C3 F8 -mbs 전용 그룹(100μL, 1 × 10 5 거품/mL), LIFU 전용 그룹(2 W/cm 2 100초 동안), LIFU–C3 F8 -mbs 그룹, LIFU–N2 O-mbs 그룹. 세포 부착을 허용하기 위해 24시간 동안 배양한 후, 각 그룹은 위에서 설명한 해당 실험 개입을 받았습니다. 그런 다음, 각 그룹의 해당 접시에 동량의 DCFH-DA(30μM)를 첨가하고, 접시를 암실에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포에 들어가지 않은 DCFH 프로브를 제거하기 위해 세포를 PBS로 3회 부드럽게 헹구었습니다. 마지막으로, 세포 내 ROS의 생성은 CLSM에 의해 결정되었습니다. N2의 SDT 효율성을 추가로 확인하려면 O-mbs, 세포를 6웰 플레이트에 파종하고 24시간 동안 배양하고 위에서 설명한 대로 6개 그룹으로 무작위로 분배했습니다. 그런 다음 각 그룹에서 해당하는 치료를 수행했습니다. 각 그룹의 세포를 소화시키고 적절한 농도의 세포 현탁액으로 제조하고 CLSM 접시에 넣었습니다. 마지막으로, 세포는 죽은(적색) 세포와 살아있는(녹색) 세포를 구별하기 위해 CAM 및 PI 염료로 공동 염색한 후 CLSM에 의해 스캔되었습니다. 세포자멸사는 유세포분석 및 Annexin V-FITC/PI 염색에 의해 검출되었습니다. 1시간의 처리 후, 각 세포군을 원심분리하여 세포를 수집하였다. Annexin V-FITC/PI 공동 염색 후 유세포 분석(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 검출을 수행했습니다.
진단 초음파 장치, 치료 초음파 장치 및 중앙 처리 시스템으로 구성된 HIFU 시스템(JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Chongqing, China)은 앞에서 설명한 대로 사용되었습니다[29]. 치료 목적으로 사용된 HIFU 매개변수는 다음과 같이 설정되었습니다:작동 주파수, 0.94MHz; 초점 거리, 140mm; 직경, 220mm; 및 실시간 진단 변환기 주파수, 3.5MH. 통합된 변환기는 탈기된 물에 잠겼습니다. N2의 강화 효과를 평가하려면 HIFU 처리에 대한 O-mbs, MDA-MB-231 세포를 원심분리, 5 × 10 5 /mL 및 4개의 그룹으로 분배:대조군(치료 없음), HIFU 단독 그룹(125W, 5초), HIFU-N2 O-mbs 전용 그룹, HIFU–C3 F8 -mbs 전용 그룹입니다. 다음으로, 각 그룹에 대해 다른 각각의 처리를 수행하였다. 처리된 세포를 원심분리하고 PBS로 세척하고 Annexin V-FITC/PI로 이중 염색하고 유세포 분석을 위해 수확했습니다. 산화질소(NO) 프로브 DAF-FM을 사용하여 각 처리 그룹의 상청액에서 NO를 검출했습니다. 모든 실험은 3번 수행되었습니다. TEM은 처리된 세포의 미세구조적 형태를 확인하는 데 사용되었습니다. 각 처리 후 처리된 세포는 즉시 2% OsO4로 고정되었습니다. , 등급이 지정된 일련의 알코올에서 탈수되고 Epon 812(Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA)에 평평하게 묻혀 있습니다. 초박막 절편(100 nm)을 준비하고 uranyl acetate와 lead citrate로 염색하고 전자 현미경으로 검사했습니다.
신선한 소 간 조직은 지역 도살장에서 구입하여 도축 후 12시간 이내에 사용했습니다. 결합 조직이 적고 혈관이 적은 신선한 생체 외 소 간을 10cm × 5cm × 5cm 섹션으로 슬라이스하고 37°C에서 1시간 동안 탈기했습니다. 소의 간을 세 그룹으로 나누었습니다:C3 F8 -mbs 그룹, N2 O-mbs 그룹 및 PBS 그룹. 먼저, 갓 분리한 소의 간을 탈기된 물이 담긴 용기에 넣었습니다. 그런 다음 200μL(1 × 10 5 PBS에 포함된 미세 기포(bubble/mL)를 그림 6a에 표시된 방식으로 소 간에 직접 주입했습니다. 진단 초음파 변환기의 안내에 따라 HIFU 초점은 주사 부위에 위치되었습니다. 그런 다음 치료 변환기를 사용하여 소의 간 주사 부위에 서로 다른 전력(100W, 125W, 150W)으로 5초간 절제를 수행했습니다. 마지막으로 측정된 최대 길이, 너비 및 깊이(mm)에 따라 소 간 조직에서 표적 부위의 응고 괴사 부피를 다음 식에 의해 계산했습니다. V (mm 3 ) =π/6 × 길이 × 너비 × 깊이. 또한 진단용 초음파 영상에는 각 그룹의 HIFU 절제 전후 목표 부위의 Gray 값을 기록하였다.
20마리의 종양이 있는 마우스를 무작위로 4개의 그룹으로 나누었습니다(n =그룹당 5개), 대조군(치료 없음), HIFU–PBS 그룹, HIFU–C3 F8 -mbs 그룹 및 HIFU–N2 O-mbs 그룹. HIFU(125W, 5초) 종양 절제는 마우스에 200μL의 C3를 정맥 주사한 후 적용되었습니다. F8 -mbs 그룹, N2 O-MB 및 PBS. 고형 종양의 HIFU 절제 절차는 생체 외 분리 소 간의 절차와 유사했습니다. 먼저, 마우스를 1% 펜토바르비탈(8mL/kg)로 마취시켰다. 마우스의 종양 부위를 탈기된 물이 담긴 용기에 접종하였다. 진단 초음파 변환기의 안내에 따라 HIFU 초점은 종양 조직에 위치되었습니다. 마우스 체중과 종양 부피를 3일 간격으로 기록했습니다. 마지막으로, 치료 21일 후에 모든 마우스를 죽이고 마우스에서 종양 조직을 해부한 다음 H&E, 증식 세포 핵 항원(PCNA) 염색, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL)을 위해 보냈습니다.
모든 데이터는 GraphPad Prism(버전 7, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)으로 제시 및 분석되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 각 실험은 최소 3회 반복되었습니다. 통계 분석은 Bonferroni 사후 검정(모든 그룹 비교) 또는 Dunnett 사후 검정(모든 그룹을 대조군과 비교)을 사용한 일원 분산 분석에 의해 수행되었습니다. p 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
<섹션 데이터-제목="결과">N2 준비 수정된 기계적 진동 방법에 의한 O-mbs는 매우 안정적인 유백색 현탁액을 생성합니다(그림 1a). N2 O-mbs는 실온에서 72시간 보관 후 입자 크기와 형태가 크게 변하지 않았습니다. 광학현미경에서 N2 O-mb는 균일한 크기, 우수한 분산 및 높은 안정성으로 관찰되었습니다(그림 1b). N2의 농도 O-mbs는 5.12 ± 0.45 × 10 8 이었습니다. 거품/mL. TEM 이미지(그림 1c)에서 볼 수 있듯이 N2의 크기는 O-mbs는 고르게 분포되었으며 평균 크기는 약 450 nm였습니다. N2 O-mb 동적 광산란 결과는 TEM 결과와 일치하는 458.1 ± 17.26 nm(다분산 지수 =0.368, 그림 1d)의 유체역학적 직경을 나타냈습니다. N2의 잠재력 O-mbs는 -16.2 ± 0.35mV였습니다(그림 1e)(추가 파일 1:그림 S1).
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아 N2의 사진 탈이온수에 분산된 O-mb; ㄴ N2의 이미지 명시야 광학 현미경하의 O-mbs; ㄷ N2의 투과 전자 현미경 이미지 O-mbs; d N2의 크기 분포 O-mbs; 이 N2의 겉보기 제타 전위 O-mbs
N2의 세포독성 시험관 내 세포에 대한 O-mbs를 CCK-8 방법으로 조사했습니다. 우리는 대조군의 세포 생존율을 100%로 정의했습니다. 24시간의 인큐베이션 후, 세포 생존력 결과는 MDA-MB-231 세포에 대해 유의한 세포독성을 나타내지 않았다. 높은 N2에서도 O-mb 농도에서 세포 생존율은 95% 이상으로 유지되었습니다(그림 2a). N2의 세포독성 건강한 누드 마우스에 대한 생체 내 O-mbs를 분석했습니다. 그림 2b와 같이 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐, 신장)의 조직병리학적 분석 결과 N2 O-mbs는 쥐에게 심각한 독성 손상을 일으키지 않았습니다. 이 결과는 N2 O-mb는 생체 적합성이 높습니다.
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아 세포 생존력은 CCK-8 분석에 의해 결정되었고; ㄴ N2를 받거나 받지 않은 건강한 암컷 누드 마우스에서 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐 및 신장)의 H&E 염색 O-mbs; ㄷ a의 이미지 d까지 명시야에서 세포 표시, DAPI로 염색된 세포 핵, N2 DiI에 의해 염색된 O-mbs 및 3개의 형광 이미지의 병합된 결과; 스케일 바 =50 μm [NS 대조군과 비교하여 의미 없음(0기포/mL)]
N2의 세포내 흡수 연장된 배양 시간(2시간 및 4시간)에 대한 O-mbs는 CLSM에 의해 시각화되었습니다. DiI 라벨이 붙은 N2로 세포 배양 O-mbs는 많은 수의 N2를 축적했습니다. 암 세포막과 세포질의 O-mbs. 그림 2c와 같이 적색 형광성 N2의 colocalization이 양호했습니다. 파란색 형광 세포가 있는 O-mb. 이 발견은 N2 O-mbs는 MDA-MB-231 암세포에 효율적으로 내재화됩니다.
SOSG는 일반적으로 사용되는 일중항 산소 검출 프로브로 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 산소 자유 라디칼 생성 검출에 사용됩니다. N2의 잠재력을 탐색하려면 O-mbs는 sonosensitizer로, SOSG는 시험관 내에서 ROS 생성을 감지하는 데 사용되었습니다[30, 31]. SOSG는 1 과 결합합니다. O2 형광 강도의 증가를 특징으로 하는 SOSG-EP를 형성합니다. 그림 3a와 같이 N2를 포함하는 SOSG 용액에 초음파를 조사한 후 O-mbs, 형광 강도 값이 크게 증가했습니다. 나머지 그룹에 비해 활성산소의 생성이 유의하게 증가했습니다(p <0.01).
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아 N2를 포함하는 SOSG의 형광 스펙트럼 LIFU에 의해 조사된 O-mbs; ㄴ 세포 생존력은 CCK8 분석에 의해 결정되었고; ㄷ 세포내 ROS 생성의 공초점 이미지(녹색 형광은 DCFH-DA로 염색된 ROS에 대한 양성 염색을 나타냄); d Image J에 의해 계산된 각 그룹의 평균 형광 강도 값(DCFH-DA). (데이터는 평균 ± SD로 표시, n =그룹당 5개, *p <0.05, LIFU–C3와 비교 F8 -mbs 그룹)
N2의 초음파 조사 후 수용액에서 ROS 발생 감지 외에도 DCFH-DA ROS 분석 키트인 O-mbs를 사용하여 N2에 의한 세포 내 ROS 생산을 결정했습니다. 옴. 도 3b에 나타난 바와 같이 양성 대조군이 가장 강한 형광 강도를 보였다. 다음으로 강한 녹색 형광 신호는 LIFU–N2에서만 나타났습니다. O-mbs 그룹, N2의 동시 존재에서 ROS의 결과적 생성을 공개 O-mbs 및 LIFU 조사. 그러나 나머지 그룹에서는 명백한 형광이 감지되지 않았습니다(그림 3c). 대조군의 세포 생존율은 100%로 정의하였다. CCK-8 분석 결과는 LIFU-N2에서 약 46%의 세포 사멸을 나타냈습니다. O-mbs 그룹(그림 3d). N2의 세포독성 LIFU와 조합된 O-mbs는 치료 후 세포 사멸의 CLSM 관찰에 의해 평가되었습니다. CAM은 녹색 형광으로 살아있는 세포를 염색하는 데 사용되었습니다. PI는 죽은 세포를 적색 형광으로 염색하는 데 사용되었습니다. 그림 4a와 같이 LIFU-N2에는 죽은 세포가 많이 존재했습니다. O-mbs 그룹. 또한, 유세포 분석 결과 MDA-MB-231 세포 그룹의 세포 사멸 속도가 다른 그룹보다 유의하게 높았다(p <0.05) N2 결합 후 LIFU 치료를 받은 O-mbs(그림 4b). 결합된 C3 F8 -mbs LIFU 치료는 명백한 세포 사멸이나 세포 사멸을 일으키지 않았습니다. 결과는 SDT에 대한 반응으로 광범위한 세포 사멸 및 괴사가 발생했음을 추가로 나타냅니다. 유세포 분석 결과는 CLSM의 결과와 일치했습니다. 이 결과는 N2 LIFU와 결합된 O-mbs는 시험관 내에서 종양 세포 사멸을 유도합니다(추가 파일 2:그림 S2, 추가 파일 3:그림 S3).
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아 종양 세포 사멸 및 괴사의 유세포 분석; ㄴ 다양한 처리 후 CAM/PI 공동 염색 MDA-MB-231 세포의 공초점 이미지. 눈금 막대는 100μm입니다.
유세포 분석 결과는 그림 5a에 나와 있습니다. 둘 다 N2 O-mbs 및 C3 F8 -mbs는 HIFU 절제 후 MDA-MB-231 세포의 사망률을 증가시켰습니다. 또한 HIFU-C3에 비해 F8 -mbs, N2 O-mbs는 MDA-MB-231 세포자멸사를 유의하게 증가시켰습니다(p <0.05; 그림 5b). NO 시험 결과 HIFU-N2 상층액의 형광 강도는 O-mbs 그룹도 나머지 그룹보다 유의하게 높았습니다(p <0.05) (그림 5c). 세포질과 세포 소기관의 변화는 TEM에 의해 관찰되었습니다(그림 5d). 대조군(아무 처리도 하지 않은)의 세포는 완전한 세포 형태를 보였다. HIFU 그룹의 세포질에서 다량의 액포 물질이 발견되었습니다. 그러나 세포는 여전히 완전한 세포막과 핵막을 가지고 있습니다. 그러나 HIFU–N2 O-mbs 그룹 및 HIFU–C3 F8 -mbs 그룹은 세포막 무결성의 손실과 세포 구조의 완전한 붕괴를 보여주었습니다. TEM 관찰은 각 그룹에서 처리 후 세포 사멸 및 세포 사멸 과정의 순간에 불과했다는 점을 언급할 가치가 있습니다. N2 외인성 미세 기포로서의 O-mbs는 HIFU 치료에 분명히 시너지 효과가 있습니다. HIFU–N2에서 O-mbs 그룹, N2의 소노다이나믹 효과 O-mbs는 더 많은 세포 사멸을 촉진할 수 있습니다. 결과는 유세포 분석 및 생체 내 실험 모두에서 검증되었습니다(추가 파일 4:그림 S4, 추가 파일 5:그림 S5)
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아 Annexin V-FITC/PI 결합 분석 결과; ㄴ 각 그룹의 평균 세포 자멸사 비율; ㄷ N2의 NO 생성 정량 분석 HIFU에 의해 조사된 O-mbs; d 세포의 투과 전자 현미경 이미지. 눈금 막대는 100μm입니다. (데이터는 평균 ± SD, n으로 표시되었습니다. =그룹당 5개, *p <0.05, 대조군과 비교, HIFU , HIFU–C3 F8 -mb 그룹)
분리된 소 간의 HIFU 절제 후 표적 부위에 회백색 응고 괴사 영역이 나타났습니다(그림 6b). HIFU 전후의 목표 영역의 평균 에코 강도 변화는 그림 6c에 나와 있습니다. PBS 그룹과 비교하여 C3의 타겟 에코 강도 값은 F8 -mbs 그룹 및 N2 O-mbs 그룹은 HIFU 치료 후 유의하게 증가했습니다(p <0.05) and increased as the HIFU ablation intensity increased. The coagulative necrotic volume of the latter two groups and the echo intensity of the B-mode ultrasound images of the target area both increased as the HIFU power increased (Fig. 6d, e).
아 Schematic illustration of ex vivo HIFU ablation on degassed bovine livers; ㄴ photography of the targeted area in excised bovine liver after HIFU ablation; ㄷ real-time ultrasound images before and after HIFU irradiation on bovine livers at 100 W, 125 W and 150 W for 5 s; d quantitative analysis of echo intensity; 이 quantitative analysis of coagulative necrosis volume of the targeted area in the excised bovine liver after HIFU ablation. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with 100 W, 5 s, 125 W, 5 s groups)
The synergistic effect of N2 O-mbs on HIFU therapy was further verified in vivo. As shown in Fig. 7a, the digital photos of mice and corresponding tumor tissue were recorded 21 days after different treatment. Tumor growth was more effectively inhibited after N2 O-mbs combined with HIFU treatment. The synergistic effect of N2 O-mbs on HIFU treatment was also evaluated by H&E, PCNA, and TUNEL staining (Fig. 7b), which demonstrated that N2 O-mbs combined with HIFU irradiation could cause larger scale of tumor cell necrosis as compared with HIFU–C3 F8 -mbs group. The cell morphology changes exhibited in HIFU–N2 O-mbs were more obvious than other groups, including karyopyknosis, karyorrhexis and karyolysis, indicating the substantial necrosis of cancer cells.
아 Digital photos of tumor-bearing mice and ex vivo tumors 21 days after different treatments; ㄴ H&E, PCNA and TUNEL staining of tumor sections after various treatments; ㄷ the corresponding calculated tumor volume of each group after 21 days of different treatments; d body weight of tumor-bearing mice for each group. The scale bars in HE staining are 100 μm; the scale bars in TUNEL and PCNA staining are 50 μm. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with HIFU-C3 F8 -mbs group)
In addition, the tumor volume of HIFU–N2 O-mbs exhibited a more significant inhibited tendency than HIFU–C3 F8 -mbs within the 21 days (Fig. 7c, d).
HIFU, as a new method of oncotherapy, has been clinically recognized and has achieved notable progress in the treatment of many solid tumors [32]. The thermal effect, cavitation effect, mechanical effect and acoustic chemical effect play significant roles in killing tumor cells and causing irreversible damage to the target area tissue during HIFU ablation [33]. HIFU has limited impact on surrounding normal tissues and is essentially a non-invasive tumor treatment. However, the energy carried by the ultrasound is attenuated due to increased transmission distance, absorption by the blood flow in the target area and the blockage of bones or gas in the body during the HIFU treatment, so that the energy transferred to the target area is reduced. However, prolonging the ablation time and increasing the treatment power increases the risk of normal tissue damage, such as skin burns, neurovascular damage and other complications [34]. Therefore, it is necessary to increase the efficacy of HIFU. Many studies have confirmed that both microbubbles and SDT can improve the efficacy of HIFU [15, 16, 35]. N2 O-loaded microbubbles prepared in this study have a smaller particle size, but similar characteristics as ultrasonic microbubble contrast agents. Studies have shown that nano/microbubbles have the same imaging capability as microbubbles in vitro, but have greater capability than microbubbles in vivo [36]. So, N2 O-mbs not only could be used for ultrasound guidance and localization for HIFU treatment, but also could be used as exogenous microbubbles to enhance the efficacy of HIFU (Additional file 6:Figure S6). At the same time, the sonodynamic effect of N2 O-mbs could effectively improve the efficacy of HIFU. The generation of ROS after ultrasonic excitation is one of the most important factors for sonosensitizers [16]. To verify the sonosensitivity of N2 O-mbs, the production of ROS in both extracellular and intracellular environments was detected in this study. The consistent result of both tests showed that N2 O-mbs can generate ROS in both aqueous solution and intracellularly. Studies have also shown that gases (N2 및 O2 ) trapped in cavitation nuclei in solution can undergo cleavage reactions and produce N and O free radicals [37, 38], as follows:
$$ {N}_2O\to {N}_2+{O}_2\kern0.50em {O}_2\to 2\bullet O\ \ \ {N}_2\to 2N.N.+ HO.\to NO+H. NO+ HO.\to HNO $$The cavitation effect and the advantage of microbubble packaging reduce the difficulty of the N2 O reaction [39]. When incubated with cells, N2 O-mbs exhibit good biocompatibility. The high selectivity, high affinity and high drug loading of nanoparticles [40], as well as the active phagocytosis by cells, promote efficient N2 O-mbs binding to cancer cells. The nanobubbles display increased penetration, stability and ease of cell entry or aggregation around the cells [36]. In addition, the sonoporation effect of ultrasound can effectively promote the transfer of microbubbles into cells [41].
In contrast to the traditional microbubble contrast agent C3 F8 -mbs, N2 O-mbs have a greater inhibitory effect on cell growth after ultrasonic irradiation, which is characterized by increased intracellular ROS, decreased cell viability, and apoptosis and necrosis. These results preliminarily suggested the sonodynamic toxic effect of N2 O-mbs.
In the HIFU synergy experiment, the treatment parameters in the experimental group were set to 125 W for 5 s by analyzing and comparing the experimental results and consulting the literature, which validated a low HIFU power could induce sufficient ablation effect and reduce adverse effects. The results showed that N2 O-mbs increased the necrosis and advanced apoptosis of more tumor cells. N2 O-mbs acted as a nanoscale microbubble synergizer and its sonodynamic effect in response to HIFU may be the reason for the different experiment results. As a microbubble, N2 O-mbs increased the deposition of HIFU energy in the target area and increased the temperature of the target area and increased the thermal effect of HIFU treatment [11]. The generation of the cavitation effect is closely related to the cavitation threshold and cavitation nucleus concentration [42]. N2 O-mbs were cavitation nucleus that reduce the cavitation threshold of HIFU and facilitate the cavitation effect. Therefore, N2 O-mbs effectively promoted cell necrosis. As a nanoscale microbubble synergizer, N2 O-mbs were lysed and generate free radicals and nitrogen oxide in response to ultrasound. Studies have confirmed that ROS are important factors in apoptosis induction [43]. It is worth noting that many kinds of free radicals can cause damage to cells. In addition to the generation of oxygen radicals, N2 O can generate other types of free radicals in cleavage reactions, such as nitrogen free radicals, which contribute to the killing of tumor cells. A small amount of nitric oxide (NO) production was detected in the cell supernatant after HIFU treatment, further indicating that the N2 O cleavage reaction occurred. An et al. [44] reported that NO may have an anti-tumor function, the mechanism of which involves NO attacking suspected iron enzymes that cause cells to fail to grow and divide when they are trapped. In addition, unstable NO can interact with oxygen molecules to form hydroxyl radicals (HO · ) and NO2 . Hydroxyl radicals are extremely cytotoxic and promote tumor cell apoptosis. NO is also an endothelium-derived relaxing factor. The generation of NO may be the reason for hyperaemia and abnormal swelling in patients during HIFU operation. In an excised bovine liver experiment, we carefully compared the echo intensity of B-mode ultrasound images, pathological changes and coagulative necrotic volume of the target area after HIFU ablation in the presence of N2 O-mbs, C3 F8 -mbs and PBS. All of these results were consistent. Compared with PBS, N2 O-mbs effectively enhanced the ablation effect of HIFU. This synergistic effect was also better demonstrated in the ablation of solid tumor in vivo, manifested by tumor cell apoptosis increased, tumor volume reduced and tumor growth inhibition. This finding further indicates that N2 O-mbs may be a novel auxiliary agent for ultrasound that can be used to promote HIFU thermal tumor ablation. The synergistic effect of N2 O-mbs in HIFU and the synergistic mechanism provide new ideas and theoretical practice for HIFU synergist research. But, the other related mechanisms of the synergy should be further explored. The effect of tumor ablation by HIFU combined with N2 O-mbs should be further addressed.
In summary, we have developed N2 O-mb nanoparticles. The characterization and biocompatibility of the N2 O-mbs were determined. The sonosensitivity of N2 O-mbs was examined by detecting the production of ROS in aqueous solution and intracellularly. Compared with C3 F8 -mbs, N2 O-mbs generated ROS and promoted the apoptosis and necrosis of tumor cells, which exhibited extraordinary sonosensitivity. In the HIFU synergy experiments, the sonodynamic effects of N2 O-mbs significantly increased the apoptosis and necrosis of tumor cells in vitro, and increased the coagulative necrotic volume and echo intensity in the ex vivo isolated bovine liver target area, and effectively inhibited tumor growth in vivo. These results suggested that N2 O-mbs could be a new kind of sonosensitizer and a novel auxiliary agent for ultrasound therapy that can be used for the ablation of tumors by HIFU.
이 원고에서 내린 결론은 모두 이 백서에 제시되고 표시된 데이터를 기반으로 합니다.
N2 O microbubbles
C3 F8 microbubbles
high-intensity focused ultrasound
low-intensity focused ultrasound
singlet oxygen sensor green
sonodynamic therapy
1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine
1,2-distearoyl-sn-glycero-3phosphoethanolamine-N -[methoxy(polyethylene glycol)-2000
4′,6-diamidino-2-phenylindole
1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate
2′,7′-dichlorofluorescin diacetate
3-amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescein, diacetate
Calcein-AM
Cell Counting Kit-8
confocal laser scanning microscopy
transmission electron microscope
Dulbecco의 수정된 Eagle 배지
fetal bovine serum
phosphate-buffered saline
deionized water
regions of interest
reactive oxygen species
nitric oxide
나노물질
초록 유방암의 전이는 예후에 부정적인 영향을 미치는 것으로 여겨집니다. 현저한 깊숙이 침투하고 비침습적인 특성의 이점을 누리는 소노다이나믹 요법(SDT)은 암 치료로 이어지는 전체 시리즈의 잠재력을 보여줍니다. 단독요법의 한계를 극복하기 위해 복합적인 나노플랫폼을 탐색하여 시너지 치료 효율을 실현하고 있습니다. 여기에서 우리는 잘 설계된 PLGA 코어-쉘 구조에서 chlorin e6(Ce6, SDT용), 퍼플루오로펜탄(PFP, 초음파 영상용) 및 도세탁셀(DTX, 화학요법용)을 캡슐화하는 새로운 다기능 나노 시스템을 설정합니다.
초록 전통적인 종양 치료 전략과 비교하여 약물 저장소 시스템인 하이드로겔은 주문형 약물 방출 및 깊은 조직 침투 능력을 실현할 수 있습니다. 또한 종양 치료의 투과성 및 체류 효과를 향상시키기 위해 우수한 종양 부위 체류를 나타냅니다. 이것은 약물의 내성과 심각한 부작용을 크게 극복할 수 있습니다. 무기/유기 복합 하이드로겔은 다양한 종류의 종양에 대한 치료 효과를 높이는 복합적인 효과로 많은 주목을 받고 있습니다. In situ 주사 가능한 하이드로겔은 누출 없이 병변 부위의 약물을 안전하게 제한하고 더 나은 생물학적 안전성을
