이 연구에서 우리는 퍼플루오로펜탄(PFP)을 페리틴(FRT)으로 캡슐화하고 종양 표적 분자 엽산(FA)(FA-FRT-PFP)을 접합하는 다기능 초음파(US) 치료제를 개발했습니다. 제조된 FA-FRT-PFP는 평균 입경이 42.8 ± 2.5 nm이고 제타 전위가 - 41.1 ± 1.7 mV이며 생리용액 및 온도에서 우수한 안정성을 보였다. FRT는 pH 5.0에서 분해되어 PFP를 로드할 수 있는 기공을 형성하는 pH에 민감한 케이지 단백질입니다. 중성 pH로 조정하면 기공이 닫히고 FRT 내부에 PFP가 캡슐화되어 나노입자가 형성됩니다. pH 5.0에서 저강도 집속 초음파 3분(LIFU, 2 W/cm 2 ) ADV(Acoustic Droplet Vaporization) 효과를 통해 FA-FRT-PFP의 US 신호를 크게 향상시켰습니다. 동일한 조건에서 4분의 LIFU 조사로 FA-FRT-PFP에 의해 생성된 기포가 깨졌습니다. FA-FRT-PFP는 난소암 세포를 효율적으로 표적화할 수 있었고 LIFU 조사 3분 후 FA-FRT-PFP의 미국 대비를 크게 향상시킬 수 있었습니다. LIFU 조사 4분 후, 종양 세포에 들어간 후 리소좀의 산성 환경에서 FA-FRT-PFP 매개된 PFP 방출로 인해 괴사로 인해 세포 생존율이 크게 감소했습니다. 그런 다음 PFP는 LIFU 조사에서 터지는 거품으로 변형되어 물리적 충격파를 형성하여 세포 구조와 괴사를 파괴하여 종양 치료를 달성합니다. 종합하면, 이는 FA-FRT-PFP가 미래의 클리닉 적용을 위한 새롭고 유망한 미국 진단학 에이전트임을 보여줍니다.
난소암은 전 세계적으로 가장 치명적인 여성 암 중 하나입니다[1,2,3]. 난소암의 치료는 임상적으로 방사선 요법, 화학 요법, 수술 및 기타 보조 요법에 의존합니다[4,5,6]. 그러나 이러한 전략의 단점은 환자의 생존율 향상을 계속 저해하고 있습니다. 이러한 단점을 극복하기 위해서는 보다 효과적이고 안전한 진단 방법이 필요하다. 최근 몇 년 동안 영상과 치료법을 단일 치료 플랫폼으로 통합하는 것이 화두로 떠올랐습니다[7,8,9].
초음파(US) 기술은 비침습성, 비방사성, 저비용 및 특정 특성으로 인해 임상 진단 및 종양 치료에 널리 사용됩니다[10,11,12]. 최근 수십 년 동안 효과적인 종양 진단 및 치료를 위해 미국 영상 및 치료 기능을 갖춘 음향 반응 플랫폼(ARP)이 개발되었습니다[13,14,15,16]. ARP는 주로 마이크로버블 또는 나노버블(MB 또는 NB) 및 나노입자(NP) 기반 플랫폼을 포함합니다[16, 17]. 이러한 ARP 중 MB 또는 NB는 우수한 음향 응답 능력을 나타내지만 크기가 커서 생체 내 조직 침투가 약하고 샘플 안정성이 좋지 않습니다. NP는 작은 크기로 인해 더 강한 조직 투과성과 더 긴 약동학적 주기를 나타냅니다. 그러나 NP의 음향 응답 기능은 제한적입니다. 따라서 안정성이 높고 응답성이 강한 작은 크기의 ARP를 설계하는 것이 시급합니다.
액체 탄화불소는 외부 자극에 반응하여 액상 기체 상 전이를 겪는다[18, 19]. Natalya와 동료들은 저강도 집속 초음파(LIFU)에서 음향 액적 기화(ADV) 효과를 생성하는 액체 탄화불소를 함유한 나노 에멀젼을 개발했습니다[20,21,22]. 에멀젼은 기포를 형성함과 동시에 약물 방출을 유발하여 종양 치료를 가능하게 했습니다. 그러나 액체 탄화불소를 감싸는 밀봉재 층이 종양 치료에 필요한 초음파의 강도와 시간을 증가시켜 주변의 건강한 조직에 손상을 입혔다. 따라서 액체 탄화불소 운반체의 추가 최적화가 필요합니다.
이 연구에서 우리는 FA-FRT-PFP를 형성하기 위해 종양 표적 분자 엽산(FA)과 추가로 결합된 액체 플루오로카본 퍼플루오로펜탄(PFP)이 로딩된 페리틴(FRT) 나노입자를 개발했습니다. 페리틴은 pH 민감도를 나타내는 생체 적합성이 높은 내인성 나노케이지 단백질입니다[23,24,25]. 단백질은 산성 환경에서 분해될 수 있고 알칼리성 환경에서 재조립될 수 있습니다. 이것은 pH 변화에 반응하여 페리틴의 조절된 로딩 및 방출을 허용합니다[26,27,28]. PFP는 29 o 의 끓는 온도를 나타내는 자주 사용되는 상변환 물질입니다. C. 끓는점이 낮아 HIFU보다 안전한 LIFU에 의한 상변환이 용이하다. PFP는 페리틴에 로딩되었고 생성된 FA-FRT-PFP는 생리학적 용액 및 온도에서 높은 안정성으로 ~ .3 ± 2.8 nm의 직경을 가졌습니다. 결과에 따르면 FA-FRT-PFP는 다음과 같은 이점이 있습니다. (1) pH를 산성에서 중성으로 변경하여 PFP를 FRT에 쉽게 로드할 수 있습니다. (2) 저강도 집속 초음파(LIFU, 2 W/cm 2 , 3분) 및 pH =5.0, FA-FRT-PFP는 PFP를 방출하고 음향 액적 기화(ADV)를 통해 미국 영상 신호를 향상시키기 위해 위상 변화를 겪습니다. 3) 장기간 LIFU 조사(4분) 및 pH =5.0에서 FA-FRT-PFP에서 방출된 PFP가 폭발하여 괴사를 통해 종양 세포를 효과적으로 파괴할 수 있는 물리적 충격파를 생성했습니다. 우리가 아는 한, 이것은 종양 US 진단학으로 FRT에 로드되는 PFP의 첫 번째 예입니다. 이러한 결과는 FA-FRT-PFP + LIFU가 통합 종양 진단 및 치료를 위한 새로운 전략임을 나타냅니다.
아가로스 젤, 페리틴(FRT), 엽산(FA) 및 퍼플루오로펜탄(C3 F8 , PFP)는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. NH2 -PEG2000 -FA 및 NH2 -PEG2000 -COOH는 Xi'an Ruixi Biotechnology Co., Ltd.(중국)에서 공급했습니다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입했습니다. 세포 계수 키트-8(CCK-8)은 Dojindo Laboratories(Kumamoto, Japan)에서 입수했습니다. Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM), 인산완충식염수(PBS), 페니실린-스트렙토마이신, 트립신-EDTA 및 소태아혈청(FBS)은 Gibco(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)에서 구입했습니다.
인간 난소암 세포주 SK-OV-3은 중국 과학원 상하이 세포 생물학 연구소에서 제공했습니다. 정상 난소 상피 세포 HUM-CELL-0088은 중국 우한의 PriCells에서 입수했습니다. 세포를 10% 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포는 5% CO2를 포함하는 가습 분위기의 인큐베이터에서 유지되었습니다. 37°C에서
첫째, 표적 분자 FA는 에스테르화 반응을 통해 FRT와 접합되었다[29]. 간단히 말해서 NH2 -PEG2000 -FA(10 mg) 및 FRT 용액을 EDC(5 mg/mL) 및 NHS(20 mg/mL)의 존재하에 혼합하였다. 실온에서 약간 교반하면서 3시간 반응시킨 후, 혼합물을 24시간 동안 증류수(MW 컷오프 =1.2kDa)에 대한 투석을 통해 정제하였다. 생성된 용액은 FA-FRT 나노입자였다. 둘째, 단백질의 변성(denaturation) 및 재생성(renaturation) 과정을 거쳐 FRT의 공동에 PFP의 로딩이 준비되었다[30]. 간단히 말해서, FA-FRT를 5mL PBS로 희석하여 2mg/mL가 되도록 하고 FRT의 완전한 해리를 보장하기 위해 실온에서 30분 동안 약간 교반하면서 pH =5.0으로 조정했습니다. 그 후, 500 μl PFP를 ice bath의 용액에 첨가하고 ice bath에서 80 W에서 총 5분 동안 5초 동안 켜고 5초 동안 펄스 초음파 처리를 수행했습니다. 초음파 처리 후, 혼합물의 pH 값을 중성(pH =7.4)으로 조정했습니다. PFP는 오일 상태이고 물에 용해되지 않기 때문에 과도한 PFP는 액체 분리에 의해 쉽게 제거되어 FA-FRT-PFP가 되었습니다. FRT-PFP는 NH2를 변경하는 것을 제외하고 유사한 방법으로 제조되었습니다. -PEG2000 -FA에서 NH2로 -PEG2000 -쿠.
나노 입자의 크기와 제타 전위는 Zeta Sizer(Malvern, NanoZS, UK)로 테스트되었습니다. FA-FRT-PFP의 형태는 투과전자현미경(TEM, Hitachi, Japan)과 역형광현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 나노입자의 화학 구조는 푸리에 변환 적외선 분광법(Bruker Tensor 27, Bruker Optik, Ettlingen, Germany)에 의해 검출되었다. FA-FRT-PFP의 세포 흡수는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LEXT OLS4100, Olympus, Japan)에 의해 감지되었습니다. FITC/PI 이중 염색 세포는 유세포 분석법(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)으로 분석되었습니다.
pH =5.0 및 7.5 조건의 FA-FRT-PFP에 서로 다른 음향 강도의 LIFU(1.5 및 2.0 W/cm2 )를 조사했습니다. ) 및 아가로스 겔 모델에서 다른 총 시간(1, 2, 3, 4분) 동안 미국 장비(Esaote Mylab 90, Italy)에서 주파수 5–12MHz 및 기계적 지수( MI) 0.06. 그 후 광학현미경으로 시간 경과에 따른 FA-FRT-PFP의 출현을 관찰하였다. 미국 이미지에서 관심 영역의 미국 강도는 ImageJ 소프트웨어로 분석되었습니다.
간단히 말해서, FITC 1mg을 DMSO 1mL에 용해시킨 다음 FRT-PFP 및 FA-FRT-PFP와 부드럽게 교반하면서 30분 동안 혼합했습니다. 그런 다음, 혼합 용액을 탈이온수에서 밤새 투석하여 유리 FITC 및 DMSO를 제거하여 FITC 표지된 나노 입자를 얻었다. 다음으로, SK-OV-3 및 정상 난소 세포(HUM-CELL-0088) 세포를 배지에서 24시간 동안 배양한 후, free FITC, FITC-표지된 FRT-PFP 및 FA-FRT-PFP와 함께 공동 배양하였다. 5시간 동안 SK-OV-3 세포. 또한, FITC로 표지된 FA-FRT-PFP를 FA 전처리된 SK-OV-3 세포와 함께 5시간 동안 인큐베이션했습니다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 4% 파라포름알데히드로 고정하고 0.2 mg/mL의 DAPI 용액으로 10분 동안 염색하였다. 세포는 형광 이미지를 캡처하기 위해 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 이미지화되었습니다. 형광 신호는 유세포 분석기로 정량했습니다.
SK-OV-3 세포를 FA가 없는 배지에서 24시간 동안 배양한 후 PBS, FRT-PFP 및 FA-FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA를 SK-OV-3 세포와 함께 배양하였다. 6시간 세포를 수집하여 아가로스 겔과 혼합한 후, 세포에 3분 동안 LIFU의 유무에 관계없이 조사하였다(총 3분 동안 1초 on 및 1초 휴지; 1MHz; 2.0 W/cm2 ). 드디어 미국 사진이 찍혔습니다.
SK-OV-3 세포를 96웰 플레이트에 1 × 10 4 밀도로 시딩했습니다. 세포/웰, 및 24시간 동안 부착되도록 하였다. FA-FRT의 세포독성을 위해 다양한 농도(0, 20, 40, 100, 200, 500 μg/mL)의 FA-FRT를 SK-OV-3 세포와 함께 배양하였다. 24시간 처리 후, 세포를 인큐베이터에서 20분 동안 10% CCK-8을 함유하는 DMEM 배지로 처리하였다. 450 nm 파장에서 세포의 흡광도를 Multimode Plate Reader(Thermo Scientific)로 검출하여 세포 생존력을 특성화했습니다. 또한, SK-OV-3 세포와 정상 난소 세포(HUM-CELL-0088)에 PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP 및 FA-FRT-PFP + FA를 3시간 동안 처리한 후, LIFU로 조사(총 4분 동안 1초 정지, 1MHz, 2.0W/cm 2 ). 처리된 세포를 추가로 21시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로 LIFU 없이 PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP 및 FA-FRT-PFP + FA를 24시간 동안 처리하였다. 이후 CCK-8 assay로 처리된 세포의 생존력을 확인하였다.
세포 사멸 유형을 평가하기 위해 SK-OV-3 세포를 5 × 10 4 밀도로 6웰 플레이트에 접종했습니다. 세포/mL. 24시간 후, 세포를 PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP 및 FA-FRT-PFP + FA로 3시간 동안 처리한 다음, LIFU(1초, 1초 동안 일시정지, 총 4회)를 조사하였다. 최소, 1MHz, 2.0W/cm 2 ). 처리된 세포를 추가로 23시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로서 세포를 LIFU 없이 PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP 및 FA-FRT-PFP + FA로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 트립신 처리하고 1500xg에서 원심분리했습니다. 3분 동안 얼음처럼 차가운 PBS로 3회 세척한 다음 200mL의 결합 완충액에 재현탁했습니다. 그 후, annexin V-FITC 5μL와 PI 10μL를 첨가하고 암실에서 15분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 유세포 분석기를 사용하여 염색된 세포를 분석했습니다.
웨스턴 블로팅은 선행 문헌에 따라 수행하였다. 세포를 40㎍/mL의 PBS(대조군), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA 및 LIFU 조사(2.0W/cm2 저녁> , 4분) 및 추가 21시간 배양. 그런 다음 처리된 세포를 RIPA 완충액(Sigma)에 용해시켰다. Laemmli 샘플 버퍼가 포함된 각 단백질 50마이크로그램을 5분 동안 끓이고 SDS-PAGE를 수행했습니다. 단백질은 반건조 Trans-Blot(Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 PVDF 멤브레인(Bio-Rad Laboratories)으로 옮겼습니다. 블롯은 먼저 실온에서 1시간 동안 2% 우유 또는 2% BSA(포스포 특이적 항체의 경우)를 포함하는 TBS 차단 완충액에서 배양한 다음 TBST(0.1% Tween20 및 2% BSA 포함)에 희석된 각 1차 항체와 함께 배양되었습니다. 4 ° C에서 하룻밤. 그 후, 블롯을 세척하고 TBST에서 적절한 2차 항체(Santa Cruz)와 함께 배양하고 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo)를 사용하여 검출했습니다.
모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 통계적 분석은 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. *피 <0.05, **P <0.01은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
FA-FRT-PFP가 합성되어 종양 치료에 사용되었습니다(그림 1). FRT의 pH 유도 가역적 분해 및 재조립을 통해 상변환 액적이 FRT에 로딩되었습니다. LIFU로 유도된 음향 액적 기화(ADV)가 있는 PFP는 세포로 전달되어 초음파 영상 에이전트로 작용했습니다. 그림 2a–c는 구형 형태의 FRT, FRT-PFP 및 FA-FRT-PFP의 TEM 이미지를 보여줍니다. FRT, FRT-PFP 및 FA-FRT-PFP의 평균 입자 크기는 각각 6.9 ± 0.3 nm, 43.8 ± 1.6 nm 및 47.3 ± 2.8 nm였으며(그림 2d), 이는 PFP 로딩 및 FA 접합이 FRT의 크기. FRT 및 FA-FRT-PFP의 평균 제타 전위는 각각 - 43.2 ± 3.1mV, - 46.9 ± 2.2mV 및 - 41.5 ± 2.7mV였습니다(그림 2e). 또한, FA와 FRT의 접합은 추가 파일 1에 표시된 대로 FT-IR로 특성화되었습니다. 그림 S1. FT-IR 스펙트럼은 ~ 1110cm −1 에서 흡수 밴드를 표시했습니다. PEG의 진동 CO-C 에테르 결합에 해당할 수 있습니다. ~ 1601cm −1 에서 흡수 피크 및 ~ 1710cm −1 -COOH 및 -CONH2뿐만 아니라 PEG 및 FRT의 진동 C=O 결합에 속합니다. FA 및 FRT; ~ 2820cm −1 의 밴드 , ~ 2920cm −1 및 ~ 2950cm −1 -CH2의 비대칭 및 대칭 CH 스트레치 진동에 해당 FA 및 PEG; ~ 1440cm −1 에서 흡수 피크 FA의 페닐 고리와 연결되어 있습니다. 결과는 FA와 FRT의 성공적인 접합을 확인합니다. 28일의 저장 기간 동안 물, PBS, 식염수 및 FBS에서 FA-FRT-PFP의 크기와 PDI는 큰 변화가 없었습니다(그림 3a, b). 이는 FA-FRT-PFP가 우수한 안정성을 나타냄을 나타냅니다. 그림 3c는 25 o 범위의 다양한 온도에서 FA-FRT-PFP의 크기 변화를 보여줍니다. C ~ 45 o C. FA-FRT-PFP의 크기는 온도를 25-40 °C로 낮추었을 때 거의 변하지 않았으며, 이는 FA-FRT-PFP가 40 o 이하에서 높은 안정성을 나타냄을 나타냅니다. C. 온도가 45°C에 도달했을 때 FA-FRT-PFP의 크기는 42.1 nm에서 6 nm 범위였으며, 이는 FA-FRT-PFP의 PFP가 심한 가스화를 겪고 나노 입자의 파열로 이어졌기 때문일 수 있습니다. FA-FRT-PFP의 가스화 온도가 29 o 에서 증가했습니다. C(상압에서 PFP의 가스화 온도) ~ 45 o C, 아마도 FRT 쉘의 적용 범위로 인한 것 같습니다[21, 31,32,33].
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FA-FRT-PFP 합성 및 종양 치료학에서의 적용에 대한 도식적 표현
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아 –ㄷ FRT, FRT-PFP 및 FA-FRT-PFP의 TEM 이미지. d , e FRT, FRT-PFP 및 FA-FRT-PFP의 크기 및 제타 전위 분포
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아 , b 28일 동안 물, PBS, 식염수 및 FBS에서 FA-FRT-PFP의 크기 및 PDI 변화. ㄷ 25 o 다양한 온도에서 FA-FRT-PFP의 크기 변화 C ~ 45 o ㄷ
FA-FRT-PFP의 미국 팬텀 실험은 다양한 pH 값과 LIFU 전력 강도에서 수행되었습니다. 도 4a에 도시된 바와 같이, LIFU 조사가 없는 경우(pre), US 신호는 모든 그룹에서 약하였다. LIFU 조사 3분 후 pH 7.5에서 FA-FRT-PFP는 1.5 및 2.0 W/cm2 모두에서 낮은 US 신호를 나타냈습니다. 2 , 동일한 LIFU 조사 시간 하에서 pH =5.0에서 FA-FRT-PFP가 더 강한 US 신호 강도를 가졌다. 이는 FA-FRT-PFP가 시간 및 음향 강도 의존적 ADV 효과를 나타냄을 입증했습니다. 이는 pH =5.0에서 FA-FRT-PFP가 분해되어 PFP를 방출하여 상변환을 더 쉽게 하기 때문이다. 흥미롭게도 LIFU 조사 시간을 4분으로 연장했을 때 pH =5.0 및 2.0 W/cm2에서 FA-FRT-PFP 의 LIFU는 더 낮은 조사 시간에 비해 더 약한 US 신호 강도를 가졌는데, 아마도 이 조건에서 LIFU가 너무 강하여 기포 파열을 유도하기 때문일 수 있습니다. 이러한 결과는 FA-FRT-PFP가 PFP를 방출하여 2.0W/cm 2 에서 상변환과 폭발을 일으킬 수 있음을 보여주었습니다. pH =5.0에서 LIFU 조사. US 강도의 결과는 그림 4b, c에 나와 있습니다. 그림 4d–g는 3분의 LIFU 조사(2.0 W/cm 2 ) 후 FA-FRT-PFP 용액의 형태를 보여줍니다. ) 및 pH =7.5 및 5.0에서. pH =5.0 및 2.0 W/cm 2 에서 FA-FRT-PFP LIFU는 큰 거품을 생성하여 우리의 발견을 더욱 입증했습니다.
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아 다른 pH 값에서 아가로스 겔과 혼합되고 다른 LIFU 전력 강도에 의해 조사된 FA-FRT-PFP의 미국 이미지. ㄴ , ㄷ a에 있는 미국 신호의 해당 통계 데이터 . d –지 다양한 pH 값에서 아가로스 겔과 혼합하고 2.0 W/cm 2 조사한 FA-FRT-PFP의 광학 현미경 이미지 3분 동안
그림 5는 FA-FRT-PFP의 세포 흡수 용량을 보여줍니다. 유리 FITC 처리된 세포는 무시할 수 있는 형광을 나타내었지만 FA-FRT-PFP에 라벨링한 후 강한 형광 신호가 분명하여 FA-FRT-PFP가 강한 세포 흡수 능력을 가지고 있음을 나타냅니다. FA와 함께 사전 배양된 FRT-PFP 처리 및 FA-FRT-PFP 처리 세포는 더 약한 FITC 형광을 나타냈다. 이것은 FA가 나노 입자의 활성 표적화를 향상시킨다는 것을 추가로 입증했습니다. 또한, FA-FRT-PFP는 FCM과 유사한 흡수 거동을 보였다(그림 5c, d). FA-FRT-PFP의 섭취율은 46.5±2.8%로 free FITC(control), FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA보다 유의하게 높았다. 또한 추가 파일 1:그림 S2는 정상 난소 세포에서 나노입자의 세포 흡수를 보여줍니다. 세포 흡수에서 FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA 및 FA-FRT-PFP 그룹 간에는 큰 차이가 없습니다. 이는 정상 난소 세포(HUM-CELL-0088)가 SK-OV-3 세포에 비해 FA 수용체 발현이 낮기 때문일 수 있습니다.
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세포 흡수. 아 , b 유리 FITC 및 FITC 표지 FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA 및 FA-FRT-PFP로 처리된 세포의 공초점 형광 이미지. 녹색 및 파란색은 각각 FITC 및 DAPI 형광을 나타냅니다. 스케일 바 =25 μm. ㄷ , d 유리 FITC 및 FITC 표지 FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA 및 FA-FRT-PFP로 처리된 세포 내부의 FITC 형광 신호 및 해당 통계 데이터
FA-FRT-PFP가 시험관 내 ADV에 의해 초음파 영상을 향상시킨다는 것을 확인하기 위해 나노입자를 세포와 함께 5시간 동안 배양하고 LIFU(2.0 W/cm2 포함 또는 포함하지 않음)를 조사했습니다. ). LIFU 조사가 없을 때 그림 6a에서 볼 수 있듯이 모든 테스트 그룹의 세포는 강화된 초음파 신호를 나타내지 않았지만 LIFU 조사 후 FA-FRT-PFP 처리된 세포는 대조군 FRT-PFP 및 FA-FRT에 비해 높은 US 강도를 보였습니다. -PFP + FA 그룹, 각각. 초음파 영상의 경우 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 회색조 값의 정량적 분석을 계산했습니다. 결과는 FA-FRT-PFP 처리된 세포의 미국 강도가 2.0 W/cm2에서 LIFU 조사 후 강화되었음을 보여주는 미국 영상 데이터(그림 6b)와 일치했습니다. 3분 동안 FA-FRT-PFP는 세포에 들어가고 리소좀의 산성 환경(pH =~ 5.0)에서 분해되어 PFP를 세포질로 방출합니다[34, 35]. LIFU 조사 후 PFP는 액적에서 기체로의 상 변환을 쉽게 생성하여 US 강도를 향상시켰습니다.
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체외 초음파 영상. 아 초음파 이미지 및 해당 통계 데이터(b ) PBS(대조군), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA 및 FA-FRT-PFP 처리된 세포(LIFU 조사 포함 또는 미포함)(2.0 W/cm 2 , 3분)
그림 7a는 최대 0.5 mg/mL 농도에서 FA-FRT-PFP의 세포 독성을 보여줍니다. LIFU 조사가 없는 경우 FA-FRT-PFP는 SK-OV-3 세포에서 생존력의 명백한 억제를 나타내지 않았습니다. CCK-8 분석을 사용하여 LIFU와 결합된 FA-FRT-PFP의 항암 효능을 분석했습니다. 도 7b에 도시된 바와 같이, LIFU 조사가 없는 경우, FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA 및 FA-FRT-PFP는 대조군에 비해 현저한 세포독성을 나타내지 않았다. 4분의 LIFU 조사와 결합했을 때, FA-FRT-PFP는 FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA보다 더 높은 유의한 세포독성을 나타내었으며 피크 세포 억제율은 40μg/mL에서 90%에 도달했습니다. 이것은 FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA에 비해 FA-FRT-PFP가 세포질로 더 쉽게 흡수된 다음 리소좀으로 흡수되기 때문일 수 있습니다. 리소좀의 산성 환경에서 FA-FRT-PFP는 PFP를 세포질로 방출했습니다. 4분의 LIFU 조사에서 방출된 PFP가 가스화되어 공동화 및 파열을 일으켜 일련의 물리적 충격력을 생성하여 종양의 사멸 효과를 크게 향상시켰습니다[36,37,38]. 또한, 추가 파일 1:그림 S3은 정상 난소 세포에서 나노입자의 세포독성을 보여줍니다. FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA 및 FA-FRT-PFP 그룹 사이에 LIFU와 결합했을 때 세포 독성에서 유의한 차이가 없습니다. 그 결과는 HUM-CELL-0088 세포가 FA 표적화 효과를 보이지 않는 FA 수용체 발현이 낮기 때문일 수 있습니다.
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체외 항암 효과. 아 다른 농도의 FA-FRT-PFP로 24시간 배양 후 SK-OV-3 세포의 세포 생존율. ㄴ 40μg/mL의 PBS(대조군), FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA 및 FA-FRT-PFP와 LIFU 조사(2.0W/cm 2 , 4분) 및 추가 21시간 배양
도 8a, b에 도시된 바와 같이, LIFU 조사가 없는 경우, 세포는 모든 그룹에서 최소의 세포 사멸을 나타내었다. LIFU 조사 4분 후, FA-FRT-PFP 처리 세포는 LIFP 유도 PFP 캐비테이션 또는 버블 블라스팅에 의해 생성된 물리적 충격파로 인해 다른 그룹에 비해 상당한 괴사(~ 91.6%)를 보여주었습니다. 또한 추가 파일 1:그림 S4는 세포의 TNF 단백질 발현 수준을 보여줍니다. LIFU가 없으면 세포는 TNF 단백질을 거의 발현하지 않았다. LIFU를 사용하는 동안 FA-FRT-PFP 그룹의 세포는 FRT-PFP 및 FA-FRT-PFP + FA 그룹의 세포와 비교하여 높은 수준의 TNF 발현을 가지며, 이는 TNF 단백질이 중요한 FA-FRT-PFP임을 나타냅니다. + LIFU로 인한 사망 관련 단백질 [39]. FA-FRT-PFP는 우수한 체외 암 치료 효과[40,41,42]를 바탕으로 향후 생체 내 암 치료에 유망합니다.
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아 40 μg/mL의 PBS(대조군), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA 및 FA-FRT-PFP와 LIFU가 결합되거나 결합되지 않은 FA-FRT-PFP로 처리된 SK-OV-3 세포의 유세포 분석 및 해당 통계 데이터 조사(2.0 W/cm 2 , 4분) 및 추가 23시간 배양
요약하면, 우리는 FA 표적 분자(FA-FRT-PFP)로 변형된 FRT 기반 및 PFP 로딩 상변환 나노입자를 성공적으로 개발했습니다. 새로운 표적 US theranostic으로서 FA-FRT-PFP는 다음과 같은 여러 이점을 가지고 있습니다. (2) FRT는 산성 및 중성 조건에서 각각 PFP 액적을 업로드 및 방출하기 위해 분해 및 재조립할 수 있는 캐리어로 사용되었습니다. (3) 3분의 LIFU 지원 및 산성 조건에서 FA-FRT-PFP는 PFP를 방출하고 ADV를 통해 위상 변환을 생성하여 US 대비를 크게 증가시킬 수 있습니다. (4) LIFU와 산성 환경에서 4분 동안 조사하면 방출된 PFP가 세포 내 "폭발 효과"를 쉽게 유도하여 물리적 항종양 특성을 나타낼 수 있습니다. 이러한 결과는 LIFU를 지원하는 FA-FRT-PFP가 초음파 분자 영상 및 종양 치료를 위한 새로운 전략을 제공한다는 것을 보여줍니다.
이 원고에서 내린 결론은 모두 이 백서에 제시되고 표시된 데이터를 기반으로 합니다.
음향 액적 기화
음향 응답 플랫폼.
세포 계수 키트-8
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드
엽산
태아 소 혈청
플루오레세인 이소티오시아네이트
페리틴
저강도 집속 초음파
N-하이드록시숙신이미드
퍼플루오로펜탄
초음파
나노물질
초록 유방암의 전이는 예후에 부정적인 영향을 미치는 것으로 여겨집니다. 현저한 깊숙이 침투하고 비침습적인 특성의 이점을 누리는 소노다이나믹 요법(SDT)은 암 치료로 이어지는 전체 시리즈의 잠재력을 보여줍니다. 단독요법의 한계를 극복하기 위해 복합적인 나노플랫폼을 탐색하여 시너지 치료 효율을 실현하고 있습니다. 여기에서 우리는 잘 설계된 PLGA 코어-쉘 구조에서 chlorin e6(Ce6, SDT용), 퍼플루오로펜탄(PFP, 초음파 영상용) 및 도세탁셀(DTX, 화학요법용)을 캡슐화하는 새로운 다기능 나노 시스템을 설정합니다.
초록 X선 컴퓨터 단층촬영(CT)은 임상 실습에서 널리 사용되어 왔으며 Iohexol과 같은 조영제는 종종 정상 조직과 병든 조직 간의 CT 영상의 대비를 향상시키는 데 사용됩니다. 그러나 이러한 조영제는 약간의 독성을 가질 수 있습니다. 따라서 새로운 CT 조영제가 시급히 필요하다. 높은 원자 번호(Z =83), 저렴한 비용, 우수한 생물학적 안전성 및 우수한 X선 감쇠 특성(5.74cm2) kg−1 100keV)에서 비스무트는 나노 크기 CT 조영제 분야의 연구원들로부터 큰 관심을 받았습니다. 여기에서 BiF3를 합성했습니다.
