pH 반응성 퍼플루오로펜테인 단백질 나노입자로 난소암 표적 초음파 영상 및 치료

초록

본 연구에서는 페리틴(FRT)에 퍼플루오로펜테인(PFP)을 캡슐화하고 종양 표적 분자 폴산(FA)을 접합한 다기능 초음파(US) 치료제(FA-FRT-PFP)를 개발했습니다. 제조된 FA-FRT-PFP는 평균 입자 지름 42.8 ± 2.5 nm, 제타 전위 −41.1 ± 1.7 mV로 생리 용액과 온도에서 좋은 안정성을 보였습니다. FRT는 pH 5.0에서 분해되어 PFP 로딩용 기공을 형성하는 pH 감응성 케이지 단백질입니다. 중성 pH로 조절하면 기공이 닫혀 PFP가 FRT 내부에 캡슐화되어 나노입자 형성. pH 5.0에서 저강도 집속 초음파(LIFU, 2 W/cm²) 3분 조사 시 음향 방울 기화(ADV) 효과로 FA-FRT-PFP 초음파 신호 유의미하게 향상. 동일 조건 4분 조사 시 FA-FRT-PFP 생성 기포 파열. FA-FRT-PFP가 난소암 세포로 효율적으로 표적화되어 3분 LIFU 조사 후 초음파 대비도 유의미 증가. 4분 조사 후 세포 생존율 유의미 감소(괴사), 이는 FA-FRT-PFP가 종양 세포 진입 후 리소좀 산성 환경(pH 5.0)에서 PFP 방출, LIFU 조사로 기포화·파열되어 물리적 충격파 형성, 세포 구조 파괴 및 괴사 유도 때문으로 분석. 종합하면 FA-FRT-PFP는 향후 임상 적용 가능한 새롭고 유망한 초음파 진단치료제임을 입증.

서론

난소암은 전 세계적으로 가장 치명적인 여성 암 중 하나입니다[1,2,3]. 난소암 치료는 여전히 방사선 치료, 화학요법, 수술, 기타 보조 요법에 임상적으로 의존[4,5,6]. 하지만 이러한 전략들의 단점들이 환자 생존율 향상을 지속 방해. 이를 극복하기 위해 더 효과적이고 안전한 진단법 필요. 최근 영상과 치료를 단일 치료 플랫폼에 통합하는 것이 핫토픽으로 부상[7,8,9].

초음파(US) 기술은 비침습적, 비방사선, 저비용, 특이적 특성으로 임상 진단과 종양 치료에 널리 활용[10,11,12]. 최근 수십 년간 초음파 영상과 치료 능력을 가진 음향 반응 플랫폼(ARP)이 효과적 종양 진단과 치료 위해 개발[13,14,15,16]. ARP는 주로 마이크로버블/나노버블(MB/NB)과 나노입자(NP) 기반 플랫폼 포함[16, 17]. 이들 중 MB/NB는 좋은 음향 반응 능력 보이지만 큰 크기로 인한 약한 체내 조직 투과와 낮은 샘플 안정성 단점. NP는 작은 크기로 강한 조직 투과성과 긴 약동학 주기 장점. 그러나 NP 음향 반응 능력 제한. 따라서 작은 크기, 높은 안정성, 강한 반응성 갖춘 ARP 설계 시급.

액체 플루오로카본은 외부 자극에 액체-기체 상전이[18, 19]. Natalya 등은 액체 플루오로카본 함유 나노에멀전 개발, LIFU 하에서 음향 방울 기화(ADV) 효과 유도[20,21,22]. 에멀전은 기포 형성과 동시에 약물 방출 유도해 종양 치료 가능. 하지만 액체 플루오로카본 주변 봉인 재료 층이 종양 치료에 필요한 초음파 강도와 시간 증가시켜 주변 정상 조직 손상 유발. 액체 플루오로카본 캐리어 추가 최적화 필요.

본 연구에서는 페리틴(FRT) 나노입자에 액체 플루오로카본 퍼플루오로펜테인(PFP) 로딩 후 종양 표적 분자 폴산(FA) 결합해 FA-FRT-PFP 제조. 페리틴은 pH 감응성 보이는 고생체적합성 내인성 나노케이지 단백질[23,24,25]. 산성 환경에서 분해, 알칼리 환경에서 재조립 가능. pH 변화에 따른 페리틴 제어 로딩과 방출 가능[26,27,28]. PFP는 29°C 비점 가진 상전이 물질로 흔히 사용. 낮은 비점은 LIFU로 쉬운 상전이 가능, HIFU보다 안전. PFP를 페리틴에 로딩한 결과 FA-FRT-PFP 직경 ~47.3 ± 2.8 nm, 생리 용액과 온도에서 높은 안정성. 결과적으로 FA-FRT-PFP 장점: (1) pH 산성→중성 변경으로 PFP 쉽게 FRT 로딩; (2) LIFU(2 W/cm², 3분) 및 pH 5.0에서 FA-FRT-PFP PFP 방출, 상전이로 ADV 통해 초음파 영상 신호 향상; (3) 장기 LIFU 조사(4분) 및 pH 5.0에서 FA-FRT-PFP 방출 PFP 폭발, 물리적 충격파로 종양 세포 괴사 효과적 파괴. 저희 지식으로는 PFP를 FRT에 로딩한 종양 초음파 진단치료제 첫 사례. 이 결과는 FA-FRT-PFP + LIFU가 통합 종양 진단과 치료 새 전략임을 시사.

재료 및 방법

재료

아가로스 겔, 페리틴(FRT), 폴산(FA), 퍼플루오로펜테인(C₃F₈, PFP) Sigma(미국 세인트루이스) 구입. NH₂-PEG₂₀₀₀-FA, NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH Xi'an Ruixi Biotechnology(중국) 공급. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC), N-하이드록시석시나마이드(NHS) Thermo Fisher Scientific(미국) 구입. 세포 계수 키트-8(CCK-8) Dojindo Laboratories(일본) 구입. 델베코 변형 이글 배지(DMEM), 인산완충염수(PBS), 페니실린-스트렙토마이신, 트립신-EDTA, 태아소혈청(FBS) Gibco(미국) 구입.

세포 배양

인간 난소암 세포주 SK-OV-3 상하이 세포생물학연구소(중국과학원) 제공. 정상 난소 상피 세포 HUM-CELL-0088 PriCells(중국 우한) 제공. 세포는 10% 태아소혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신 함유 DMEM 배지 배양. 5% CO₂, 37°C 습도 조절 인큐베이터 유지.

FA-FRT-PFP 제조

첫째, 표적 분자 FA를 에스테르화 반응으로 FRT에 접합[29]. NH₂-PEG₂₀₀₀-FA(10 mg)와 FRT 용액을 EDC(5 mg/mL), NHS(20 mg/mL) 존재 하 혼합. 실온 약한 교반 3시간 반응 후 투석(분자량 컷오프 1.2 kDa)으로 24시간 정제해 FA-FRT 나노입자 획득. 둘째, 단백질 변성-재자연화 과정으로 PFP를 FRT 공동 내 로딩[30]. FA-FRT를 5 mL PBS에 2 mg/mL 희석, 30% 에탄올로 pH 5.0 조절 후 실온 30분 약한 교반해 FRT 완전 해리. 얼음 욕조에서 500 μL PFP 첨가, 80 W 펄스 초음파(5초 켬/5초 멈춤, 총 5분) 처리. 초음파 후 혼합물 pH 중성(pH 7.4) 조절. PFP 오일 상태 물 불용성이라 과량 PFP 액액 분리 쉽게 제거해 FA-FRT-PFP 획득. FRT-PFP는 NH₂-PEG₂₀₀₀-FA 대신 NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH 사용 외 유사 방법 제조.

FA-FRT-PFP 특성화

나노입자 크기와 제타 전위 제타 사이저(Malvern, NanoZS, 영국) 측정. 형태 투과전자현미경(TEM, Hitachi, 일본)과 도립 형광 현미경(Olympus, 일본) 관찰. 화학 구조 푸리에 변환 적외선 분광법(Bruker Tensor 27, Bruker Optik, 독일) 분석. 세포 섭취 공초점 레이저 주사 현미경(LEXT OLS4100, Olympus, 일본) 검출. FITC/PI 이중 염색 세포 유세포분석기(BD, 미국) 분석.

pH 및 초음파 반응성 기체 생성 성능

pH 5.0, 7.5 조건 FA-FRT-PFP를 다양한 LIFU 음향 강도(1.5, 2.0 W/cm²)와 시간(1, 2, 3, 4분) 조사 아가로스 겔 모델에서 수행, 초음파 장비(Esaote Mylab 90, 이탈리아)로 5-12 MHz 주파수, 기계적 지수(MI) 0.06 US 영상 관찰. 이후 시간 경과 광학 현미경으로 FA-FRT-PFP 모습 관찰. US 영상 관심 영역 강도 ImageJ 소프트웨어 분석.

세포 섭취

1 mg FITC 1 mL DMSO 녹인 후 FRT-PFP, FA-FRT-PFP와 30분 부드러운 교반 혼합. 투석으로 유리 FITC, DMSO 제거해 FITC 표지 나노입자 획득. SK-OV-3, 정상 난소 세포(HUM-CELL-0088) 24시간 배양 후 유리 FITC, FITC 표지 FRT-PFP, FA-FRT-PFP 5시간 공동 배양. 추가로 FITC 표지 FA-FRT-PFP를 FA 전처리 SK-OV-3 세포 5시간 배양. 세포 PBS 3회 세척, 4% 파라포름알데히드 고정, 0.2 mg/mL DAPI 10분 염색. 공초점 레이저 주사 현미경으로 형광 이미지 촬영. 형광 신호 유세포분석기 정량.

세포 내 초음파 영상

SK-OV-3 세포 24시간 FA-free 배지 배양 후 PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA 6시간 배양. 세포 수집 아가로스 겔 혼합, LIFU 3분 조사(1초 켬/1초 멈춤 총 3분; 1 MHz; 2.0 W/cm²) 유무 비교. US 영상 촬영.

세포 내 항암 효능

SK-OV-3 세포 96웰 플레이트 1×10⁴ cells/well 밀도 파종, 24시간 부착 대기. FA-FRT 세포독성 위해 다양한 농도(0, 20, 40, 100, 200, 500 μg/mL) FA-FRT 배양 24시간. DMEM 10% CCK-8 20분 인큐베이션 후 450 nm 흡광도 멀티모드 플레이트 리더(Thermo Scientific) 측정으로 세포 생존율 평가. 추가로 SK-OV-3, 정상 난소 세포(HUM-CELL-0088) PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA 3시간 처리 후 LIFU 조사(1초 켬/1초 멈춤 총 4분; 1 MHz; 2.0 W/cm²). 처리 세포 추가 21시간 배양. 대조군: LIFU 없이 PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PPP, FA-FRT-PFP+FA 24시간 처리. 이후 CCK-8 분석으로 처리 세포 생존율 검출.

세포 사멸 분석

세포 사멸 유형 평가 위해 SK-OV-3 세포 6웰 플레이트 5×10⁴ cells/mL 밀도 파종. 24시간 후 PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA 3시간 처리, LIFU 조사(1초 켬/1초 멈춤 총 4분; 1 MHz; 2.0 W/cm²). 처리 세포 추가 23시간 배양. 대조군: LIFU 없이 동일 처리 24시간. 세포 트립신화, 1500×g 3분 원심, 얼음 PBS 3회 세척, 200 mL 결합 버퍼 재현탁. Annexin V-FITC 5 μL, PI 10 μL 첨가 15분 암소 배양. 염색 세포 유세포분석기 분석.

웨스턴 블로팅

선행 문헌 따라 웨스턴 블로팅 수행. 세포 40 μg/mL PBS(대조), FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA, FA-FRT-PFP LIFU 조사 유무(2.0 W/cm², 4분) 처리 후 추가 21시간 배양. 처리 세포 RIPA 버퍼(Sigma) 용해. 단백질 50 μg Laemmli 샘플 버퍼 혼합 5분 끓여 SDS-PAGE. 단백질 PVDF 멤브레인(Bio-Rad) 반건식 전이. 블롯 TBS 차단 버퍼(2% 우유 또는 2% BSA, 인산화 특이 항체용) 1시간 실온 배양 후 1차 항체 TBST(0.1% Tween20, 2% BSA) 희석해 4°C 오버나이트. 이후 세척 후 2차 항체(Santa Cruz) TBST 배양, SuperSignal West Pico 화학발광 기질(Thermo)로 검출.

통계 분석

모든 데이터 평균 ± 표준편차 제시. Student's t-test 통계 분석. *P < 0.05, **P < 0.01 통계적 유의성.

결과 및 논의

FA-FRT-PFP 제조 및 특성화

FA-FRT-PFP 종양 치료용 합성(그림 1). 상전이 방울을 FRT의 pH 유도 가역적 분해-재조립으로 로딩. LIFU 유도 ADV PFP 세포 전달해 초음파 영상제 역할. 그림 2a-c FRT, FRT-PFP, FA-FRT-PFP TEM 이미지, 구형 형태. 평균 입자 크기 FRT 6.9 ± 0.3 nm, FRT-PFP 43.8 ± 1.6 nm, FA-FRT-PFP 47.3 ± 2.8 nm(그림 2d) PFP 로딩과 FA 접합으로 FRT 크기 증가 확인. 평균 제타 전위 FRT −43.2 ± 3.1 mV, FRT-PFP −46.9 ± 2.2 mV, FA-FRT-PFP −41.5 ± 2.7 mV(그림 2e). FA-FRT 접합 FT-IR로 특성화(추가 파일 1: 그림 S1). FT-IR 스펙트럼 ~1110 cm⁻¹ 흡수대 PEG C-O-C 에테르 결합 진동 대응. ~1601, ~1710 cm⁻¹ 흡수 피크 PEG, FRT C=O 진동, FA, FRT -COOH, -CONH₂ 소속. ~2820, ~2920, ~2950 cm⁻¹ 밴드 FA, PEG -CH₂ 비대칭/대칭 C-H 신축 진동 대응. ~1440 cm⁻¹ 흡수 피크 FA 페닐 고리 관련. 결과 FA-FRT 성공적 접합 확인. 28일 보관 기간 물, PBS, 생리식염수, FBS에서 FA-FRT-PFP 크기, PDI 유의미 변화 없음(그림 3a, b) 우수한 안정성 입증. 그림 3c 25-45°C 온도별 FA-FRT-PFP 크기 변화. 25-40°C 크기 거의 불변, 40°C 이하 높은 안정성. 45°C 도달 시 42.1 nm에서 6 nm 범위 변화, FA-FRT-PFP 내 PFP 심한 기화로 나노입자 파열 때문. FA-FRT-PFP 기화 온도 정상압 PFP 29°C에서 45°C로 상승, FRT 껍질 피복 때문[21, 31,32,33].

FA-FRT-PFP 합성 및 종양 진단치료 적용 개략도

a-c FRT, FRT-PFP, FA-FRT-PFP TEM 이미지. d, e FRT, FRT-PFP, FA-FRT-PFP 크기 및 제타 전위 분포

a, b 28일간 물, PBS, 생리식염수, FBS에서 FA-FRT-PFP 크기, PDI 변화. c 25-45°C 온도별 FA-FRT-PFP 크기 변화

pH 및 LIFU 반응성 초음파 향상

FA-FRT-PFP US 팬텀 실험 다양한 pH, LIFU 강도 수행. 그림 4a: LIFU 무조사(pre) 시 모든 그룹 약한 US 신호. pH 7.5에서 3분 LIFU 조사 후 1.5, 2.0 W/cm² 모두 낮은 US 신호. 반면 pH 5.0 동일 조사 시간에서 더 강한 US 신호 강도. FA-FRT-PFP 시간 및 음향 강도 의존적 ADV 효과 입증. pH 5.0에서 FA-FRT-PFP 분해돼 PFP 방출, 상전이 용이해짐. 흥미롭게 LIFU 조사 시간 4분 연장 시 pH 5.0, 2.0 W/cm²에서 더 약한 US 신호, 이 조건 LIFU 너무 강해 기포 파열 유도 때문. 결과 FA-FRT-PFP가 pH 5.0, 2.0 W/cm² LIFU 조사 시 PFP 방출, 상전이 및 폭발 가능 입증. US 강도 결과 그림 4b, c. 그림 4d-g 3분 LIFU 조사(2.0 W/cm²) pH 7.5, 5.0 후 FA-FRT-PFP 용액 형태. pH 5.0, 2.0 W/cm² LIFU에서 큰 기포 생성, 발견 추가 검증.

a 다양한 pH, LIFU 강도 조사 FA-FRT-PFP 아가로스 겔 혼합 US 이미지. b, c a 대응 통계 데이터. d-g 2.0 W/cm² 3분 조사 다양한 pH FA-FRT-PFP 아가로스 겔 혼합 광학 현미경 이미지

세포 섭취

그림 5 FA-FRT-PFP 세포 섭취 능력. 유리 FITC 처리 세포 무시할 형광, FA-FRT-PFP 표지 후 강한 형광 신호로 강한 세포 섭취 능력 입증. FRT-PFP 처리, FA 전처리 FA-FRT-PFP 처리 세포 약한 FITC 형광. FA가 나노입자 능동 표적화 향상 추가 입증. 또한 FA-FRT-PFP FCM과 유사 섭취 거동(그림 5c, d). FA-FRT-PFP 섭취율 46.5 ± 2.8%로 유리 FITC(대조), FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA 대비 유의미 높음. 추가 파일 1: 그림 S2 정상 난소 세포 나노입자 섭취. FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA, FA-FRT-PFP 그룹 간 섭취 유의미 차이 없음. 정상 난소 세포(HUM-CELL-0088) FA 수용체 발현 낮아 SK-OV-3 대비 표적 효과 없음 때문.

세포 섭취. a, b 유리 FITC, FITC 표지 FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA, FA-FRT-PFP 처리 세포 공초점 형광 이미지. 녹색/파랑 FITC/DAPI 형광. 스케일 바 25 μm. c, d 세포 내 FITC 형광 신호 및 통계 데이터

세포 내 초음파 영상

FA-FRT-PFP가 ADV로 세포 내 초음파 영상 향상 확인 위해 나노입자 5시간 배양 후 LIFU(2.0 W/cm²) 조사 유무 비교. 그림 6a: LIFU 무조사 시 모든 그룹 초음파 신호 향상 없음. LIFU 조사 후 FA-FRT-PFP 처리 세포 대조 FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA 그룹 대비 높은 US 강도. 초음파 영상 위해 ImageJ로 그레이스케일 값 정량 분석. 결과 US 영상 데이터와 일치(그림 6b) FA-FRT-PFP 처리 세포 2.0 W/cm² 3분 LIFU 조사 후 US 강도 향상. FA-FRT-PFP 세포 진입 후 리소좀 산성 환경(pH ~5.0)서 분해 PFP 세포질 방출[34, 35]. LIFU 조사 후 방출 PFP 방울→기체 상전이 용이, US 강도 향상.

세포 내 초음파 영상. a PBS(대조), FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA, FA-FRT-PFP 처리 세포 LIFU 조사(2.0 W/cm², 3분) 유무 초음파 이미지 및 통계 데이터(b)

세포 내 항암 효능 및 세포 사멸 분석

그림 7a 0.5 mg/mL까지 FA-FRT-PFP 세포독성. LIFU 무조사 시 FA-FRT-PFP SK-OV-3 세포 생존율 명백한 억제 없음. CCK-8 분석으로 FA-FRT-PFP LIFU 병용 항암 효능 분석. 그림 7b: LIFU 무조사 시 FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA, FA-FRT-PFP 대조군 대비 현저한 세포독성 없음. 4분 LIFU 조사 병용 시 FA-FRT-PFP 유의미한 세포독성, FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA 대비 높음, 40 μg/mL에서 최대 세포 억제율 ~90% 도달. FA-FRT-PFP가 FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA 대비 세포질, 리소좀 더 잘 섭취되기 때문. 리소좀 산성 환경서 FA-FRT-PFP PFP 방출 세포질. 4분 LIFU 조사 시 방출 PFP 기화, 캐비테이션 및 파열로 물리적 충격력 발생, 종양 살상 효과 대폭 향상[36,37,38]. 추가 파일 1: 그림 S3 정상 난소 세포 나노입자 세포독성. LIFU 병용 시 세 그룹 간 세포독성 유의미 차이 없음. HUM-CELL-0088 세포 낮은 FA 수용체 발현으로 FA 표적 효과 없음 때문.

세포 내 항암 효능. a 24시간 다양한 농도 FA-FRT-PFP 배양 SK-OV-3 세포 생존율. b 40 μg/mL PBS(대조), FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA, FA-FRT-PFP LIFU 조사(2.0 W/cm², 4분) 병용 유무 및 추가 21시간 배양 후 생존율

그림 8a, b: LIFU 무조사 시 모든 그룹 최소 세포 사멸. 4분 LIFU 조사 후 FA-FRT-PFP 처리 세포 유의미 괴사(~91.6%) 타 그룹 대비, LIFU 유도 PFP 캐비테이션/기포 폭발 물리적 충격파 때문. 추가 파일 1: 그림 S4 세포 TNF 단백질 발현 수준. LIFU 없이 TNF 단백질 발현 거의 없음. LIFU 시 FA-FRT-PFP 그룹 높은 TNF 발현, FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA 그룹 대비, TNF 단백질이 FA-FRT-PFP+LIFU 유도 사멸 관련 중요 단백질 입증[39]. 우수한 세포 내 암 치료 효과 기반[40,41,42] FA-FRT-PFP 향후 체내 암 치료 유망.

a 40 μg/mL PBS(대조), FRT-PFP, FA-FRT-PFP+FA, FA-FRT-PFP LIFU 조사(2.0 W/cm², 4분) 병용 유무 및 추가 23시간 배양 SK-OV-3 세포 유세포분석 및 통계 데이터

결론

요약하면 FA 표적 분자 수정 FRT 기반 PFP 로딩 상전이 나노입자(FA-FRT-PFP) 성공 개발. 새로운 표적 초음파 진단치료제로서 FA-FRT-PFP 다중 장점: (1) 나노스케일 입자 크기; (2) FRT 캐리어로 산성/중성 조건에서 분해/재조립해 PFP 방울 업로드/방출; (3) 3분 LIFU 보조 및 산성 조건에서 FA-FRT-PFP PFP 방출, ADV 통해 상전이 생성, US 대비도 유의미 증가; (4) 4분 LIFU 조사 및 산성 환경에서 방출 PFP 세포 내 "폭발 효과" 유도, 물리적 항종양 특성 발현. 이 결과 FA-FRT-PFP가 LIFU 보조로 초음파 분자 영상과 종양 치료 새 전략 제공 입증.

데이터 및 재료 가용성

본 원고 결론은 본 논문 제시 및 표시된 모든 데이터 기반.

약어

ADV:

음향 방울 기화

ARP:

음향 반응 플랫폼

CCK-8:

세포 계수 키트-8

EDC:

1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드

FA:

폴산

FBS:

태아소혈청

FITC:

플루오레세인 아이소티오시아네이트

FRT:

페리틴

LIFU:

저강도 집속 초음파

NHS:

N-하이드록시석시나마이드

PFP:

퍼플루오로펜테인

US:

초음파