암 치료를 위해 모린을 캡슐화하는 Aptamer-Gold 나노입자가 탑재된 pH 민감성 리포솜 설계

결과 및 토론

특성화

본 연구는 나노입자(Apt-loaded Au NPs)의 장점을 갖고 항암제로 효과적으로 사용될 수 있는 새로운 리포솜을 개발하는 것을 목표로 하였다. 새로운 리포솜의 기본 특성은 추가 연구를 수행하는 데 중요합니다. Apt-Au@MSL은 이전 연구[23]에 설명된 대로 약간 수정하여 합성한 다음 다양한 방법을 사용하여 특성화했습니다(그림 3). 그림 3b는 특성 피크를 보여주고 Au NP의 형성을 모니터링할 수 있는 UV-vis 분광법의 결과를 나타냅니다. 약 530 nm에서 Au NP의 UV-vis 스펙트럼에서 특징적인 피크가 관찰되었습니다. 구체적으로, UV-vis 스펙트럼 분석은 강한 UV 흡광도를 나타내었고, 이는 표면 Apt 변형에 의해 영향을 받았다. 동일한 결과가 관찰되었습니다. pH에 민감한 리포솜을 Morin으로 코팅한 후 특성 피크가 변위되었습니다. 제작된 Apt-Au@MSL의 특징적인 피크는 362와 550 nm에 위치하였다. 이러한 결과는 합성이 성공적으로 완료되었음을 나타냅니다. 추가 특성화를 위해 합성 결과를 확인하기 위해 FT-IR 분광법을 수행했습니다. Morin-liposomes 및 Apt-Au@MSL의 특징적인 피크 적색 편이는 Morin의 성공적인 변형을 추가로 나타냅니다(그림 3c). Apt-Au@MSL의 pH 민감도를 결정하기 위해 다양한 pH 수준에서 PBS에서 Morin 방출 분석을 수행했습니다. 이 세 가지 pH 값은 혈액 순환의 중성 환경, 종양의 약산성 환경, 세포내 신체의 산성 환경을 시뮬레이션합니다. UV-vis 분광법으로 Morin의 방출 비율을 감지했습니다. pH 5.0에서 Morin의 약 54%가 24 h 이내에 방출되었고, 다음 96 h에서 지속적인 방출이 관찰되었습니다. 한편, pH 7.4에서는 약 10%의 Morin만이 24 h 이내에 방출되었습니다. 이러한 결과는 Apt-Au@MSL이 정상적인 생리학적 조건에서 우수한 안정성을 나타내어 약물 누출을 방지한다는 것을 보여줍니다. 그러나 약물은 핵체에서 빠르게 방출됩니다. 이러한 약물 방출 행동은 치료 효과를 효과적으로 향상시킬 수 있습니다(그림 3d). 리포솜과 Apt-Au@MSL의 구조를 밝히기 위해 TEM 및 SEM을 수행했습니다(그림 3f). AuNP의 구조를 밝히기 위해 TEM을 수행하였다. 그림 3g에서 볼 수 있듯이 AuNP는 약 10 nm의 입자 크기를 가지며 이는 리포솜의 변형 크기와 일치합니다(그림 3g). 그림 3e의 SEM 결과는 원시 리포솜이 DLS에 의해 결정된 크기와 일치하는 약 120 nm의 불균일한 직경을 가진 단층 소포를 단독으로 형성함을 나타냅니다. 대조적으로, Apt-Au@MSL은 잡종 소포의 형태가 Au-Apt 변형에 기인한다는 것을 보여줍니다. 150 nm의 직경은 DLS에 의해 결정된 크기와도 일치했습니다(그림 3i). 특히, pH에 민감한 리포솜과 Au-Apt 사이의 상호 작용에 대한 TEM 조사는 Au NP가 거의 독점적으로 소포 지질 이중층과 연관되어 있고 소포 주변에 국한되어 있음을 보여주었습니다(그림 3h). ζ 전위 측정은 그림 3j에 표시되어 있으며 Au NP와 Au-Apt의 제타 전위는 음수입니다. 결과는 Au NP(− 57.1 ± 0.3 mV)와 Au-Apt가 모두 음전하(− 31.7 ± 0.2 mV)임을 보여줍니다. Apt-Au@MSL은 양전하를 띤 Morin-liposomes로 변형되었으며 전위는 36.4 ± 0.3 mV로 변경되었습니다. 양전하와 음전하 흡착은 Au-Apt와 Morin-liposome이 결합하는 메커니즘입니다. 또한, Fig. 3k는 시간에 따른 입자의 캡슐화율의 변화를 나타내며, 이는 시간의 경과에 따른 입자의 안정성을 나타낸다. 그림 3k에서 볼 수 있듯이 입자의 캡슐화 속도는 24 h 내에서 거의 변화하지 않아 입자가 일정 시간 동안 우수한 안정성을 나타냄을 나타냅니다. Morin-liposome과 Apt-Au@MSL의 캡슐화율을 연구하기 위해 Morin 농도 대 UV-Vis 흡광도의 표준 곡선을 작성하였다. 그 결과 Morin-liposome과 Apt-Au@MSL의 포집 효율은 Table S1과 Fig. S1과 같이 90.2%와 89.6%에 달할 수 있음을 보여주었다.

특성화 이미지. 아 Apt-Au@MSL 합성의 개략도. ㄴ Morin, Au NPs, Au-Apt, Morin-liposome 및 Apt-Au@MSL의 자외선 흡수 스펙트럼. ㄷ Morin, Morin-liposome 및 Apt-Au@MSL의 FT-IR 분광기. d 다양한 pH 조건에서 Apt-Au@MSL에서 Morin의 방출 거동. 이 Morin-liposome의 SEM 이미지. 에 Apt-Au@MSL의 SEM 이미지. 지 Au NP의 TEM 이미지. 아 Apt-Au@MSL의 TEM 이미지. 나 Morin-liposome 및 Apt-Au@MSL의 직경은 DLS를 통해 최소 세 번 결정되었습니다. j Au NP, Apt-Au 및 Apt-Au@MSL의 ζ-전위. 케이 Morin-liposome과 Apt-Au@MSL의 포획 효율(EE%)

Apt-Au@MSL의 항암 활성 시험

체외

Morin은 우수한 항종양 활성을 나타내지만 낮은 수용성으로 인해 생체이용률이 낮습니다. Morin을 pH 민감성 리포솜으로 캡슐화하고 수용성 물질로 변형시킨 후 Au-Apt를 사용하여 리포솜 표면을 변형시켜 표적 항종양 효과를 얻었다. 그림 4a는 시험관 내 MTT 분석에 의한 Apt-Au@MSL의 항암 활성을 보여줍니다. 약물 농도는 Morin 농도로 정의됩니다. 모린 처리군은 블랭크군에 비해 뚜렷한 항암 활성을 나타내지 않았다. 그러나 pH 민감성 리포솜으로 캡슐화된 모린 처리군은 향상된 항암 활성을 나타냈다. 결과는 Morin-liposomes의 항종양 활성이 생 Morin의 항종양 활성보다 우수함을 시사합니다. 동시에 Apt(Apt-Au@MSL)에 의해 변형된 리포솜의 항종양 활성이 향상되었음을 발견했습니다. 표 1은 IC₅₀를 나열합니다. Morin, Morin–liposomes, Apt-Au@MSL 및 cisplatin의 값. Morin, Morin-liposome 및 Apt-Au@MSL은 종양 세포에 대한 광범위한 항암 활성을 나타냈다. 그들은 정상 인간 세포에 대해 높은 효능과 낮은 독성을 가진 SGC-7901 세포에 대해 뚜렷한 선호도를 보였습니다. IC₅₀ Apt-Au@MSL의 값은 SGC-7901 세포에 대해 15.6 ± 1.5 μg/mL였습니다. 이러한 결과는 RTCA 테스트에 의해 추가로 확인되었습니다. SGC-7901 세포는 다양한 농도에서 Apt-Au@MSL과 함께 배양되었습니다. 빈 그룹은 PBS로 처리하였고, 대조군은 Morin과 Morin-liposome으로 구성하였다. iCELLigence를 사용하여 접착 및 퍼짐을 모니터링했습니다(그림 4b). 결과는 MTT 테스트에서 얻은 결과와 대체로 유사했습니다. Apt-Au@MSL의 항종양 활성은 Morin 및 Morin-liposomes보다 유의하게 높았다. Apt-Au@MSL은 농도 증가에 따라 SGC-7901 세포의 증식을 억제할 수 있습니다. Apt-Au@MSL 처리 후 세포 형태의 변화는 형광 현미경으로도 관찰되었습니다. 그림 4c와 같이 Apt-Au@MSL이 없는 SGC-7901 세포는 세포의 구조적 무결성을 유지합니다. 대조적으로, 세포가 다양한 농도에서 Apt-Au@MSL로 처리된 후에는 세포 무결성이 손상됩니다.

아 다양한 농도(0, 5, 10, 15, 20 및 30 μg/mL)에서 다양한 물질(Morin, Au-Apt, Morin-liposome 및 Apt-Au@MSL)과 함께 배양된 SGC-7901 세포의 세포 생존율. PBS로 처리한 세포는 공백 그룹으로 설정하였다. ㄴ SGC-7901 세포의 세포 증식 곡선은 RT-CES 시스템으로 검출하였다. 상이한 화합물을 10 h에 첨가하였다. a의 농도 , b , 및 c Apt-Au@MSL(10, 20 및 30 μg/mL)이 각각 다릅니다. ㄷ 다양한 농도(0, 2.5, 5, 10, 20 및 30 μg/mL)에서 밝은 세포 이미지

아폽토시스 세포 사멸 분석

아폽토시스의 정량적 분석은 Annexin-FITC 염색을 사용하는 유세포 분석에 의해 수행되었습니다. 세포를 PI 및 Annexin V-FITC로 염색한 다음 CytoFLEX 유세포 분석기(Beckman Coulter)를 사용하여 분석했습니다. Annexin V는 노출된 phosphatidylserine에 결합된 초기 apoptotic 세포를 감지하는 데 사용되었으며 PI labeling은 late apoptotic 세포를 염색하는 데 사용되었습니다. apoptosis 비율은 공백 그룹에 대해 1.57%였습니다. Morin을 처리한 세포는 3.51%의 apoptosis 비율을 보였다. 다른 농도에서 Apt-Au@MSL은 7.44%, 10.75%, 15.53% 및 40.77%의 세포자멸사 비율로 더 높은 유도 능력을 나타냈습니다(그림 5). 강화된 세포자멸사는 또한 Apt-Au@MSL이 유도하는 뛰어난 항암 활성을 확인시켜 주었다. Apt-Au@MSL 농도가 증가함에 따라 SGC-7901 세포의 세포 사멸 비율이 증가했습니다.

다양한 방법으로 처리한 후의 SGC-7901 세포자멸사의 Annexin V-FITC/PI 염색 기반 유세포 분석. a의 농도 , b , ㄷ , 및 d 각각 5, 10, 20 및 30 μg/mL입니다.

형광 분석에 의한 항암 활성 연구

Apt-Au@MSL에 의해 유도된 SGC-7901 세포에 대한 항종양 효과는 LIVE/DEAD 형광 분석에 의해 직관적으로 평가되었습니다. 세포를 다른 농도에서 Morin, Morin-liposomes 및 Apt-Au@MSL과 함께 배양한 후 어두운 조건에서 30분 동안 LIVE/DEAD 키트로 공동 염색했습니다. 그림 6에서 빈 그룹의 세포는 모든 녹색 형광 세포가 살아있는 세포를 나타냄을 보여줍니다. Morin 및 Morin-liposomes를 포함한 대조군은 적색 형광 세포의 수를 보여줍니다. 그러나 다른 농도의 Apt-Au@MSL을 처리한 세포는 많은 수의 사멸 세포를 분명히 나타내었다. 농도가 증가함에 따라 살아있는 세포가 점차 감소했습니다. 사멸 세포의 비율이 우세하게 증가하고 세포 밀도가 감소했습니다. 그 결과 Apt-Au@MSL이 종양 세포자살을 효과적으로 촉진할 수 있음을 확인했습니다.

다양한 농도의 Apt-Au@MSL로 배양한 SGC-7901의 형광 현미경 이미지와 이후의 짧은 염색. 빈 그룹은 PBS였습니다. Morin 및 Morin-liposome을 대조군으로 설정

세포 무결성 연구

Apt-Au@MSL의 SGC-7901 세포로의 흡수 및 수송의 영향을 확인하기 위해 TEM 분석을 수행했습니다. 세포 형태의 변화는 TEM에 의해 관찰되었다. 세포의 내부 구조를 관찰하고 항암 기전에 대한 참고 자료를 제공하기 위해 TEM 이미지를 수행했습니다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 처리하지 않은 SGC-7901 세포의 블랭크 이미지는 투명한 세포벽의 형태와 외관에 상당한 변화를 보였습니다. 대조군(Morin 및 Morin-liposomes)에서는 세포 형태가 부분적인 손상을 보였고 핵 영역이 수축했습니다. 그러나 Apt-Au@MSL에 노출된 후에도 세포벽과 내부 구조의 상당한 변화가 관찰되었습니다. 세포질이 누출되고 핵 구조가 불분명해졌습니다. 속이 빈 세포 주위에 많은 세포 조각이 형성되었습니다. 또한 세포벽이 붕괴되거나 파괴되었습니다. 전체 프로필이 불분명해지고 세포가 손상되었으며 세포질이 누출되었습니다. 빨간색 화살표는 Au NP 영역을 나타냅니다. As the concentration of the Apt-Au@MSL increased, more Au NP regions appeared in the nucleus. This occurrence suggested the release of Morin after Apt-Au@MSL entered the cell interior, hence the appearance of a large amount of Au NPs. These aforementioned results suggest that antitumor activity was associated with compromised cell integrity and nuclear structure.

TEM images of SGC-7901 cells treated with different concentration of Apt-Au-MSL (10, 20, and 30 μg/mL). The blank group was PBS. The Morin and Morin–liposome were set as control group. The red square is the enlarge area. The red arrow point to Au NPs

Molecular Mechanism Induced by Apt-Au@MSL

To explore the molecular mechanism of Apt-Au@MSL-induced apoptosis, we detected the expression levels of caspases and PARP. Activation of caspase-3, -8, and -9 was first detected with specific substrates. As shown in Fig. 8a, Apt-Au@MSL treatment induces dose-dependent activation of caspase-3, -8, and -9. Caspase-9 promotes mitochondria-mediated apoptosis more than does caspase-8, indicating that the mitochondria-mediated apoptosis signaling pathway is dominant. Western blot analysis further confirmed the existence of Apt-Au@MSL-induced apoptosis at the protein level. Figures 8b and c show that after cells are treated with Apt-Au@MSL, activation of caspases and cleavage of PARP shows time and dose dependence (Figs. 8b, c). In Fig. 8d, e, the Western blot analysis confirmed our results. In conclusion, Apt-Au@MSL inhibits the growth of SGC-7901 cells mainly by inducing apoptosis.

Apt-Au@MSL induced apoptosis in SGC-7901 cells. 아 SGC-7901 cells were treated with indicated concentrations of Apt-Au@MSL for 24 h. Then, the total protein was extracted and incubated with synthetic Apt-Au@MSL substrates for measuring caspase activities. Dose-dependent (b ) and time-dependent (c ) effects of Apt-Au@MSL on PARP and caspases expression. d , e Quantitative analysis of PARP, caspase-7, caspase-9, and caspase-3 expressions. Data are means ± SD, *P <0.05, **P  < 0.01

Apt-Au@MSL Inhibits Tumor Growth

In Vivo

The in vivo antitumor activities of Apt-Au@MSL were evaluated using an SGC-7901 tumor xenograft model. A comparison of the images of the tumors with those of the control group (Morin and Morin–liposomes) showed that mice treated with Apt-Au@MSL markedly reduced the weight and size of the tumor (Fig. 9a). The relative tumor volume curves and the mice weight curves indicate that the Apt-Au@MSL in vivo exhibits a higher anticancer efficiency (Fig. 9b) than those of the other treatment groups. No significant difference in average tumor volume was indicated between the control group (Morin and Morin–liposomes) and the blank group. The tumor volume of the Apt-Au@MSL group was only nearly a tenth of the blank group and nearly a sixth of the control group. The result indicated that raw Morin and Morin–liposomes at 40 mg/kg exerted no effect on the growth rate of tumors. However, Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth. The body weight of mice in the different groups (PBS, Morin, Morin–liposomes, and Au-Apt groups) showed no marked fluctuation (Fig. 9c) during the treatment period. This result suggested that the treatment was tolerated and caused no acute side effects. Notably, we found that the mice with Apt-Au@MSL treatment showed markedly prolonged survival (Fig. 9d). The surviving mice in this group behaved normally, showing no apparent sign of unhealthy condition. These results demonstrated that the administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models.

아 In vivo applications of Apt-Au@MSL and photographs of the mice tumor taken 24 days. A dosage of 2 mg/kg was administrated intravenously for all mice (n = 6–8). ㄴ Tumor weight of mice in different groups after 24 days. ㄷ Tumor volume index for the different treatment groups. The tumor sizes were measured at the indicated time points. d Survival rate of the mice in different group after tumor inoculation. Data are means ± SD (n  = 6-8). The intravenous injection of PBS was set as blank group (100 μL); the treated by Morin and Morin–liposome were set as control group. In vivo therapeutic effects of Apt-Au@MSL in SGC-7901-bearing mice. Data are means ± SD, *P <0.05, **P  < 0.01

Histological Analysis of Anticancer Activity

H&E staining of tumor tissue and organ samples was conducted after fixation and treatment. Treatment efficacy with respect to tumor cell death was also evaluated by H&E staining of tumor tissue from different groups. In Fig. 10a, the mice treated with Au-Apt, Morin, and Morin–liposomes show the same extent of thermal damage as that of the mice in the blank group. No apparent apoptosis was observed in the blank group. The tumor tissue sections consisted of tightly packed tumor cells. However, Apt-Au@MSL treatment exhibited the most significant damage to the tumor tissue, with moderate cell apoptosis in the tumor. The result suggested anticancer activity in the mouse models treated with Apt-Au@MSL. To further investigate the ratio of apoptotic cells in tumors tissue in vivo, TUNEL assay was performed for the detection of apoptotic cells. As shown in Fig. 10b, the apoptotic cells in tumors can be stained with green fluorescence to indicate apoptosis. The merged images show fewer green fluorescent regions in the blank group and the control group (Morin and Au-Apt), indicating the presence of fewer apoptotic cells. The cells of the mice treated with Morin–liposomes appear partly apoptotic. Moreover, a large number of green fluorescent regions were observed in the group treated with Apt-Au@MSL, indicating a large amount of apoptotic cells. The results were consistent with that of H&E staining, confirming that Apt-Au@MSL can promote tumor apoptosis in vivo.

아 H&E staining analysis of the tumors in mice. Histological analysis of the tumors in mice following different treatments as PBS, Morin, Morin–liposome, Au-Apt, and Apt-Au@MSL group. ㄴ Apoptotic cells were detected by a TUNEL assay (green) and co-stained by nuclear staining DAPI (blue)

In Vivo Toxicity Evaluation

The potential in vivo toxicity is often a significant concern for the clinical application of anticancer medicine. To verify the applicability of Apt-Au@MSL in vivo, the mice were evaluated under different treatments (Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL). Blood biochemical assays were also conducted to examine possible changes in the biochemistry of mice after treatment. As shown in Fig. 11a, the blood glucose index for blood function of the Apt-Au@MSL groups was similar to those of the blank and control groups. No difference in body weight was found in each group. A steady increase was observed, indicating that the drug exhibited no toxicity (Fig. 11b). H&E staining of organ sections (Fig. 11c) showed no sign of damage or inflammation in the group treated with Apt-Au@MSL, compared with the blank and control group. This finding indicated that PBS, Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL were negligible side effects in vivo. These results, as well those of H&E staining, further indicate safety in the use of Apt-Au@MSL for tumor treatment.

In vivo toxicity evaluation. 아 Blood glucose data detected in the mouse toxicity model. ㄴ Weight of mice in different groups after 24 days. ㄷ Images of H&E-stained major organs. Each value represents the mean ± SD (n  = 3)