본 연구는 표적 특성을 나타내는 압타머와 금 나노입자(Apt-Au)로 수정된 모린 pH 민감성 리포좀(MSL) 유형의 항암 나노입자 합성을 제안합니다. 종양은 정상 조직과 미세환경이 달라 pH가 낮아 약물 효과를 저해하므로 pH 반응성 약물이 주목받고 있습니다. 금 나노입자(AuNPs)는 작은 크기, 우수한 생체적합성, 쉬운 표면 수정, 강한 세포 투과성으로 약물 전달체로서 잠재력을 보입니다. Apt-Au@MSL은 우수한 단분산성과 종양 표적 특성을 가지며 투석을 통해 약산성 환경에서 약물을 방출합니다. MTT 분석으로 암세포 모델을 선별한 결과 SGC-7901 세포에서 증식 억제 효과가 확인되었습니다. 생체 내 실험에서는 이종이식 마우스 모델에서 Apt-Au@MSL 투여가 종양 성장을 억제함을 입증했습니다. H&E 염색과 TUNEL 분석은 Apt-Au@MSL이 종양 세포 사멸을 촉진함을 추가로 확인했습니다. Apt-Au@MSL은 활성산소종(ROS) 과생산을 유도하고 다중 신호 교차조절을 통해 세포 사멸을 유도할 수 있습니다. 혈액 생화학 검사와 H&E 염색 모두 이 물질이 생체 내 급성 독성이 거의 없고 우수한 생체적합성을 가짐을 시사합니다. 강력한 기능으로 Apt-Au@MSL은 향후 임상 암 치료를 위한 표적 기반 항암 소재로 활용될 수 있습니다.
사망 원인 1위인 암은 막대한 경제적 손실과 인체 피해를 초래합니다. 스마트 약물 개발에 많은 노력이 기울여졌습니다. 폴리머 나노입자는 약물이 표적 부위에 도달할 때까지 보호하여 치료 약물 전달을 개선할 수 있습니다. 치료제를 활성 부위에 전달하기 위해 고반응성 나노입자가 사용되며, 이들은 생물학적 자극에 따라 물질 특성을 변화하도록 설계됩니다. pH 반응성 나노입자는 나노입자 내포 후 pH 변화로 연구 관심이 높습니다. pH 반응 기능은 다양한 폴리머 구조에 쉽게 통합되어 pH 반응성 나노입자 세트 설계가 가능합니다. 나노입자는 표면 화학 변화, 크기 또는 형태 변화, 물질 분해 또는 방출로 pH에 반응하며, 이 특성 변화는 세포 섭취 조절과 제어된 방출에 이용됩니다. 따라서 pH 반응성 나노입자는 치료 전달 시스템 설계에 강력한 전략을 제공합니다.
모린 수화물(3,5,7,2′,4′-펜타하이드록시플라본)은 중국 한약재나 식물에서 분리된 천연 활성 물질입니다. 프로게스테론 화합물이자 식물의 페놀 2차 대사산물로, 자연계에 널리 분포하며 우수한 항산화, 항암, 항염 효과를 나타냅니다. 다양한 응용 잠재력에도 불구하고 낮은 수용성과 생체이용률로 크게 제한됩니다.
레시틴과 세라마이드 등으로 구성된 리포좀은 양친매성 지질 분자의 이중층 구조를 가지며 생체적합성, 기능성, 부작용 감소, 대량 약물 포장 능력 등 바람직한 특성을 제공합니다. 친수성 및 소수성 제제 모두 효율적으로 운반하고 외부 조건에서 보호하여 표적 조직으로 성공적으로 전달합니다. pH 민감성 리포좀을 이용한 종양 간질 내 항암 물질의 pH 유발 방출 설계로 효능이 개선되었습니다. 이 특수 리포좀은 조직 환경에서 약물을 방출하고 암 조직 엔도솜 같은 산성 환경에서 급속히 불안정해집니다.
종양 치료의 선택성과 효능 향상을 위해 pH 민감성 리포좀을 종양 표적 나노입자로 수정해야 합니다. DNA 압타머는 높은 선택성과 민감도의 바이오센싱 및 이미징 센서, 암 표적 치료제로 개발되었습니다. 단일 가닥 DNA 압타머 AS1411은 암세포 핵에 대한 높은 결합 친화력으로 화학요법제 기능을 합니다. 이 압타머(Apt)는 Au NPs와 결합하여 암세포 핵과 상호작용하는 Apt-부하 Au NPs의 2성분 나노구조체를 형성합니다. 리포좀-나노입자 하이브리드 설계가 다기능 양식 제작에 풍부한 도구상자를 제공함도 입증되었습니다. 양이온 리포좀과 Au NPs로 구성된 하이브리드 리포좀-Au NP 소포 시스템은 종양 간질 내 약물 침투 개선과 항암 활성 강화에 설계되었습니다.
금 나노입자(Au NPs)는 생체 관련 분자로 표면 수정하여 암 표적 특이성을 높일 수 있는 좋은 약물 전달체로 간주됩니다. Au NPs 표면 수정을 통해 설프하이드릴 기의 압타머가 Au-S 공유 결합으로 Au NPs 표면을 수정하고, 나노금 표면의 적절한 설프하이드릴 기가 부착될 수 있습니다. 공학적 응용 관점에서 리간드 결합 금 나노물질은 표적 식별, 검출, 치료를 용이하게 하는 강력한 플랫폼을 제공합니다.
본 연구에서는 모린을 포집한 pH 민감성 리포좀을 조립하고 표면에 Au-Apt를 수정했습니다(Apt-Au@MSL, 그림 3a). 낮은 수용성과 생체이용률을 가진 모린이 변형되었습니다. 제조된 Apt-Au@MSL의 형태, 크기, 기타 특성을 특성화했습니다. 새로운 나노입자는 종양 표적 특성과 높은 항암 활성을 보였습니다. Apt-Au@MSL의 항암 활성은 체외 및 체내에서 탐구되었습니다(그림 2).
L-α-포스파티딜콜린(PC), 콜레스테롤(Chol), 콜레스테릴 헤미석시네이트(CHEMS), 모린(≥99.99%), 구연산나트륨(99.9%), HAuCl₄·3H₂O(≥99.9%), 폴리비닐피롤리돈(PVP, 분자량 40,000), NaOH(≥98.0%), HCl(37%)은 Sigma-Aldrich(미국)에서 구입했습니다. 이황화물 수정된 AS1411 압타머는 TaKaRa(중국 다롄)에서 합성했으며 서열은 5′-HS-T-(C6-S-S-C6)-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3′입니다. 티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드(MTT), 프로피듐 요오드화물(PI), 칼세인, Alexa Fluor 488 Annexin V는 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 모든 수용액은 이중 증류수로 제조했으며 기타 시약은 최상급 상용 제품을 사용했습니다.
HAuCl₄·4H₂O(1%) 1mL를 Milli-Q 물 25mL(pH 5.5)에 녹이고 PVP 50mg을 첨가했습니다. 3구 플라스크(150mL)에 붓고 기계적 교반 하에 마이크로파 조사로 5분간 처리했습니다. 이후 구연산나트륨 용액(1%) 1.5mL를 신속히 첨가하고 3분간 마이크로파 조사했습니다. 원심분리(10,000 rpm, 5분)로 용액을 수집했습니다.
트리스(2-카복시에틸)포스핀으로 압타머의 이황화 결합을 절단했습니다. 30분 후 압타머 용액(100μL, 100μM)을 10mL 5nM Au NPs 용액에 첨가하고 24시간 배양하여 Au-Apt NPs를 형성했습니다. 1일 후 500mM NaCl 용액 2.5mL를 4시간 간격으로 2회 첨가하여 염석했습니다.
난황 PC, CHEMS, Chol을 33:13:5 몰비로 하고 5% 모린을 포함하는 리포좀을 박막 수화법으로 제조했습니다. 난황 PC, CHEMS, Chol, 모린 2mg을 8mL CHCl₃에 녹이고 40°C에서 회전 증발로 유기 용매를 제거했습니다. 모린-리포좀의 경우 박막을 2%(w/v) PBS로 수화하고 얼음 욕조 프로브로 15분간 초음파 처리했습니다. 최종 리포좀은 콜로이드 시스템에서 합성 및 안정화되었습니다. Apt-Au@모린 pH 민감성 리포좀(Apt-Au@MSL)의 경우 지질 박막을 5% 덱스트로스 중 475μg/mL Au-Apt NPs로 수화한 후 초음파 처리했습니다.
자외선-가시광선 분광법(UV-Vis, S-3100, Scinco), 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR, Nicolet iS50, Thermo Fisher)을 수행했습니다. Apt-Au@MSL 형태는 투과전자현미경(TEM, HT7700, Hitachi)으로 관찰했습니다. 모린 방출률은 UV-Vis 분광법으로 측정했습니다. 모린-리포좀과 Apt-Au@MSL 형태는 주사전자현미경(SEM, S-4800, Hitachi)으로도 관찰했습니다. 동적 광산란(DLS)과 제타 전위 측정으로 입자 크기와 광학 특성을 분석했습니다(Brookhaven ZetaPALS).
인간 암세포주 SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7, Hs68을 ATCC에서 구입하여 10% 태아우혈청 함유 RPMI 배지에서 37°C, 5% CO₂ 조건으로 배양했습니다.
각 세포주를 96웰 플레이트(2.0×10³ cells/well)에 접종하고 Apt-Au@MSL을 다양한 농도(0, 5, 10, 15, 20, 30 μg/mL)로 처리했습니다. Au NPs와 모린을 대조군으로, 무처리 세포를 블랭크군으로 했습니다. 가습 배양기에서 배양 후 MTT 용액(5mg/mL) 9.6mL를 각 웰에 첨가하고 2시간 추가 배양했습니다. 각 군을 3중으로 시험하고 평균 OD값 대 약물 농도 곡선에서 IC₅₀값을 도출했습니다. 공초점 형광 현미경으로 각 군의 밝기를 측정했습니다.
실시간 세포 전자 감지 시스템(RT-CES, ACEA Biosciences)으로 75시간 동안 10분 간격 세포 부착을 모니터링했습니다. 세포 부착 결정을 위해 웰당 1.0×10⁴ cells/well을 접종하고 200μL 배지로 Apt-Au@MSL 다양한 농도(10, 20, 30 μg/mL)에서 10시간 배양 후 12시간 배양했습니다. 블랭크군은 무처리 세포, 대조군은 모린과 모린-리포좀 군이었습니다.
SGC-7901 세포를 48웰 플레이트에서 하룻밤 배양한 후 Apt-Au@MSL 용액(10, 30 μg/mL)으로 12시간 처리했습니다. 대조군은 모린과 모린-리포좀, 블랭크군은 무처리 세포였습니다. 배지를 제거하고 PBS로 3회 세척한 후 생존/사멸 세포 공동 염색(LIVE/DEAD assay)으로 염색했습니다. Calcein-AM/PI로 30분 공동 염색 후 PBS로 2회 세척하여 과잉 염료를 제거하고 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)으로 형광 이미지를 획득했습니다(Calcein-AM: Ex=488nm, Em=515nm; PI: Ex=535nm, Em=615nm).
Apt-Au@MSL의 항암 효과 측정을 위해 6웰 플레이트 웰당 SGC-7901 세포(1.0×10⁵ cells/well)를 접종하고 Apt-Au@MSL 다양한 농도(5, 10, 20, 30 μg/mL)로 12시간 배양했습니다. 블랭크군은 무처리, 대조군은 모린과 모린-리포좀 군이었습니다. 처리 후 세포를 수집하여 PBS로 2회 세척하고 PI와 Annexin V-FITC로 염색한 후 CytoFLEX 분석기(Beckman Coulter)로 분석했습니다(PI: Ex=535nm, Em=615nm; Annexin V-FITC: Ex=488nm, Em=525nm).
항암 분석에서 세포벽 파괴 연구를 위해 SGC-7901 세포를 6웰 플레이트에서 배양했습니다. 무처리 세포를 블랭크군으로 했습니다. Apt-Au@MSL 다양한 농도(5, 10, 20, 30 μg/mL)로 12시간 배양 후 0.25% Trypsin-EDTA 용액으로 처리했습니다. 모든 세포(배양액 부유 세포 포함)를 2000 r/min, 5분 원심분리로 수집했습니다. 수집된 세포를 2.5% 글루타르산 용액으로 4시간 후고정했습니다. 고정된 세포를 아세톤 기울기 시리즈로 20분 탈수했습니다. 최종적으로 일련의 과정을 거쳐 구리 그리드에 마운트하고 TEM(HT-7700, Hitachi)로 관찰했습니다.
SGC-7901 세포 단백질 발현을 Western blot으로 검출했습니다. SGC-7901 세포(4.0×10⁵ cells/well)를 9cm 배양 접시에 접종하고 20μg/mL Apt-Au@MSL로 1, 6, 12, 24시간 처리했습니다. 처리 후 세포를 수집하여 얼음 위 세포 용해 버퍼에 1시간 현탁했습니다. 혼합물을 11,000g, 4°C에서 10분 원심분리하고 상청액의 총세포 단백질을 수집했습니다. BCA법으로 총단백질 농도를 측정했습니다. 단백질을 로딩 버퍼에 재현탁하고 100°C에서 10분 끓였습니다. 동량 단백질(40μg/lane)을 SDS-PAGE(10% 트리신 겔)로 전기영동했습니다. 니트로셀룰로오스(NC) 막에 100V, 1.5시간 전이하고 5% 무지방 우유 함유 TBST로 1시간 차단했습니다. NC 막을 1차 항체와 2차 항체로 각각 반응시켰습니다. ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약으로 표적 단백질 밴드를 시각화했습니다. β-actin을 내부 대조군으로 사용했습니다. 단백질 발현은 Quantity-One 소프트웨어로 정량화하고 밴드 하단에 발현율을 표시했습니다.
BALB/c 누드 마우스(수컷, ~17g)를 난징대학 모델동물연구센터에서 구입하여 무균 환경(SPF)에서 사육했습니다. SGC-7901 세포 현탁액(100μL, 1×10⁶/mL)을 누드 마우스 어깨에 피하 주사하여 종양 모델을 구축했습니다. 피하 주사 15일 후 종양의 선명 이미지를 생성했습니다. 모든 동물 실험은 안후이농업대학 실험동물센터 승인 프로토콜(허가번호: SYXK 2016-007)에 따라 수행했습니다. 버니어 캘리퍼로 종양의 최대 종단 직경(길이)과 최대 횡단 직경(너비)을 측정하고 종양 부피를 길이 × 너비² × 0.5 공식으로 계산했습니다.
종양 부피가 50mm³에 도달하면 추적 실험을 수행했습니다. 마우스를 무작위 5군으로 나누어 정맥 주사했습니다: PBS(100μL), 모린, 모린-리포좀, Au-Apt, Apt-Au@MSL. 마우스 꼬리 정맥에 2mg/kg 용량으로 투여했습니다. 24일 후 종양 크기를 측정했습니다. 마우스 체중과 생존율도 측정했습니다. 마우스를 안락사시키고 종양 및 장기 조직을 수집하여 H&E 염색을 수행했습니다.
차단 및 투과화 후 종양 슬라이드를 PBS로 세척하고 TUNEL 분석 염색, DAPI 대조 염색을 수행했습니다. CLSM으로 형광 이미지를 획득했습니다. DAPI 이미징: Ex=358nm, Em=461nm; TUNEL 분석: Ex=450-500nm, Em=515-565nm.
Apt-Au@MSL 치료의 주요 장기 독성 평가를 위해 4개 치료군의 마우스를 30일 후 희생시켰습니다. 모든 군의 마우스 중요 장기(간, 비장, 신장, 심장, 폐, 종양)를 수집하여 H&E 염색했습니다. 혈액 샘플도 채취하여 혈당을 측정했습니다. 또한 마우스 체중을 측정했습니다.
본 연구는 나노입자(Apt-부하 Au NPs)의 장점을 가지며 항암제로 효과적으로 사용 가능한 새로운 리포좀 개발을 목표로 했습니다. 새로운 리포좀의 기본 특성은 추가 연구에 중요합니다. Apt-Au@MSL은 선행 연구 방법으로 약간 수정하여 합성하고 다양한 방법으로 특성화했습니다(그림 3). 그림 3b는 UV-Vis 분광법 결과로 Au NPs 형성 모니터링이 가능한 특성 피크를 보여줍니다. Au NPs의 UV-Vis 스펙트럼에서 약 530nm에서 특성 피크가 관찰되었습니다. 표면 Apt 수정에 의해 강한 UV 흡광도가 나타났으며 동일한 결과가 관찰되었습니다. pH 민감성 리포좀이 모린으로 코팅된 후 특성 피크가 이동했습니다. 제조된 Apt-Au@MSL의 특성 피크는 362nm와 550nm에 위치했습니다. 이는 합성이 성공적으로 완료됨을 나타냅니다. 추가 특성화를 위해 FT-IR 분광법을 수행하여 합성 결과를 검증했습니다. 모린-리포좀과 Apt-Au@MSL의 특성 피크 적색 이동은 모린의 성공적 수정을 추가로 입증했습니다(그림 3c).
PBS에서 다양한 pH 조건으로 모린 방출 분석을 수행하여 Apt-Au@MSL의 pH 민감성을 확인했습니다. 세 가지 pH 값은 혈액 순환의 중성 환경, 종양의 약산성 환경, 세포 내 산성 환경을 모사합니다. 모린 방출률은 UV-Vis 분광법으로 측정했습니다. pH 5.0에서 24시간 내 약 54% 모린이 방출되었고 이후 96시간까지 지속적 방출이 관찰되었습니다. 반면 pH 7.4에서는 24시간 내 약 10%만 방출되었습니다. 이는 Apt-Au@MSL이 정상 생리 조건에서 우수한 안정성을 보여 약물 누출을 방지하며, 산성 환경에서 약물이 신속히 방출됨을 의미합니다. 이 약물 방출 거동은 치료 효과를 효과적으로 개선할 수 있습니다(그림 3d).
TEM과 SEM으로 리포좀과 Apt-Au@MSL 구조를 규명했습니다(그림 3f). TEM으로 Au NPs 구조를 분석한 결과 약 10nm 입자 크기를 보였으며 이는 리포좀 표면 수정 크기와 일치했습니다(그림 3g). SEM 결과(그림 3e)에서 순수 리포좀은 약 120nm 불균일 직경의 단일층 소포를 형성했으며 DLS 측정 크기와 일치했습니다. 반면 Apt-Au@MSL은 Au-Apt 수정에 기인한 하이브리드 소포 형태를 보였으며 직경 150nm로 DLS 측정 크기와 일치했습니다(그림 3i). 특히 pH 민감성 리포좀과 Au-Apt 상호작용 TEM 조사에서 Au NPs가 소포 지질 이중층과 거의 전적으로 결합하고 소포 주변부에 국한됨을 확인했습니다(그림 3h).
제타 전위 측정 결과(그림 3j)에서 Au NPs와 Au-Apt는 음전하를 띠었습니다. Au NPs(-57.1±0.3mV)와 Au-Apt(-31.7±0.2mV) 모두 음전하였으며, Apt-Au@MSL은 양전하 모린-리포좀으로 수정되어 전위가 36.4±0.3mV로 변화했습니다. 양전하와 음전하 흡착이 Au-Apt와 모린-리포좀 결합 기전입니다. 또한 그림 3k는 시간 경과에 따른 포장률 변화를 보여주며 입자의 시간적 안정성을 나타냅니다. 24시간 내 포장률이 거의 변하지 않아 입자가 시간에 대해 우수한 안정성을 가짐을 확인했습니다. 모린 농도 대 UV-Vis 흡광도 표준곡선으로 모린-리포좀과 Apt-Au@MSL 포장률을 연구했습니다. 결과적으로 모린-리포좀과 Apt-Au@MSL 포장 효율은 각각 90.2%와 89.6%에 달했습니다(표 S1, 그림 S1).
모린은 우수한 항종양 활성을 가지나 낮은 수용성으로 생체이용률이 낮습니다. 모린을 pH 민감성 리포좀으로 포집하여 수용성 물질로 변환하고 리포좀 표면을 Au-Apt로 수정하여 표적 항종양 효과를 얻었습니다. 그림 4a는 MTT 분석으로 본 Apt-Au@MSL의 체외 항암 활성입니다. 약물 농도는 모린 농도로 정의했습니다. 모린 처리군은 블랭크군 대비 현저한 항암 활성을 보이지 않았습니다. 그러나 pH 민감성 리포좀으로 포집된 모린 처리군은 항암 활성이 향상되었습니다. 이는 모린-리포좀의 항종양 활성이 순수 모린보다 우수함을 시사합니다. 동시에 압타머로 수정된 리포좀(Apt-Au@MSL)의 항종양 활성이 개선됨을 확인했습니다. 표 1은 모린, 모린-리포좀, Apt-Au@MSL, 시스플라틴의 IC₅₀ 값입니다. 모린, 모린-리포좀, Apt-Au@MSL은 종양 세포에 광범위한 항암 활성을 보였으며 SGC-7901 세포에 높은 효능과 정상 인간 세포에 낮은 독성으로 뚜렷한 선호도를 보였습니다. Apt-Au@MSL의 SGC-7901 세포 IC₅₀ 값은 15.6±1.5μg/mL였습니다. 이 결과는 RTCA 시험으로 추가 확인되었습니다. SGC-7901 세포를 Apt-Au@MSL 다양한 농도로 배양하고 블랭크군은 PBS, 대조군은 모린과 모린-리포좀으로 했습니다. iCELLigence로 부착과 확산을 모니터링했습니다(그림 4b). 결과는 MTT 시험과 대체로 유사했습니다. Apt-Au@MSL의 항종양 활성은 모린과 모린-리포좀보다 유의하게 높았습니다. Apt-Au@MSL은 농도 증가에 따라 SGC-7901 세포 증식을 억제했습니다. Apt-Au@MSL 처리 후 세포 형태 변화도 형광 현미경으로 관찰했습니다. 그림 4c에서 Apt-Au@MSL 없이 배양된 SGC-7901 세포는 세포 구조적 완전성을 유지했습니다. 반면 Apt-Au@MSL 다양한 농도 처리 후 세포 완전성이 손상되었습니다.
Annexin-FITC 염색 유세포 분석으로 세포 사멸을 정량 분석했습니다. 세포를 PI와 Annexin V-FITC로 염색하고 CytoFLEX 유세포계(Beckman Coulter)로 분석했습니다. Annexin V는 노출된 포스파티딜세린에 결합한 초기 세포 사멸 세포를 검출하고, PI 표지는 후기 세포 사멸 세포를 염색합니다. 블랭크군 세포 사멸 비율은 1.57%였습니다. 모린 처리군은 3.51%였습니다. Apt-Au@MSL 다양한 농도에서 7.44%, 10.75%, 15.53%, 40.77%의 세포 사멸 비율을 보이며 더 높은 유도 능력을 나타냈습니다(그림 5). 향상된 세포 사멸은 Apt-Au@MSL에 의한 뛰어난 항암 활성을 재확인했습니다. SGC-7901 세포 사멸 비율은 Apt-Au@MSL 농도 증가에 따라 증가했습니다.
Apt-Au@MSL에 의한 SGC-7901 세포 항종양 효과를 LIVE/DEAD 형광 분석으로 직관적으로 평가했습니다. 세포를 모린, 모린-리포좀, Apt-Au@MSL 다양한 농도로 배양 후 암실 조건에서 LIVE/DEAD 키트로 30분 공동 염색했습니다. 그림 6에서 블랭크군 세포는 모두 녹색 형광 생존 세포였습니다. 모린과 모린-리포좀 대조군은 적색 형광 세포가 나타났습니다. 그러나 Apt-Au@MSL 다양한 농도 처리 세포는 다량의 세포 사멸 세포를 명확히 보였습니다. 농도 증가에 따라 생존 세포가 점차 감소하고 사멸 세포 비율이 주로 증가했으며 세포 밀도도 감소했습니다. 이는 Apt-Au@MSL이 종양 세포 사멸을 효과적으로 촉진함을 확인했습니다.
Apt-Au@MSL의 SGC-7901 세포 섭취 및 수송 영향을 확인하기 위해 TEM 분석을 수행했습니다. TEM으로 세포 형태 변화를 관찰했습니다. TEM 이미지로 세포 내부 구조를 관찰하여 항암 메커니즘 참고자료로 삼았습니다. 그림 7에서 무처리 SGC-7901 세포는 명확한 세포벽을 보이며 형태와 외관에 유의한 변화가 없었습니다. 대조군(모린, 모린-리포좀)에서는 세포 형태가 부분 손상되고 핵 영역이 수축했습니다. 그러나 Apt-Au@MSL 노출 후 세포벽과 내부 구조에 유의한 변화가 관찰되었습니다. 세포질이 누출되고 핵 구조가 불명확해졌습니다. 속이 빈 세포 주변에 많은 세포 파편이 형성되었습니다. 또한 세포벽이 붕괴되거나 파괴되었습니다. 전체 프로파일이 불명확해지고 세포가 손상되었으며 세포질이 누출되었습니다. 빨간 화살표는 Au NP 영역을 나타냅니다. Apt-Au@MSL 농도 증가에 따라 핵 내 Au NP 영역이 더 많이 나타났습니다. 이는 Apt-Au@MSL이 세포 내부로 들어간 후 모린이 방출되어 다량의 Au NPs가 출현함을 시사합니다. 이러한 결과는 항종양 활성이 세포 완전성 및 핵 구조 손상과 관련됨을 시사합니다.
Apt-Au@MSL 유도 세포 사멸의 분자 메커니즘 탐구를 위해 카스파제와 PARP 발현 수준을 검출했습니다. 카스파제-3, -8, -9 활성화를 특이적 기질로 먼저 검출했습니다. 그림 8a에서 Apt-Au@MSL 처리는 카스파제-3, -8, -9의 농도 의존적 활성화를 유도했습니다. 카스파제-9가 카스파제-8보다 미토콘드리아 매개 세포 사멸을 더 촉진하여 미토콘드리아 매개 세포 사멸 신호 경로가 우세함을 나타냅니다. Western blot 분석은 단백질 수준에서 Apt-Au@MSL 유도 세포 사멸 존재를 추가로 확인했습니다. 그림 8b, c에서 세포가 Apt-Au@MSL 처리 후 카스파제 활성화와 PARP 절단이 시간 및 농도 의존성을 보였습니다(그림 8b, c). 그림 8d, e에서 Western blot 분석이 결과를 확인했습니다. 결론적으로 Apt-Au@MSL은 주로 세포 사멸 유도를 통해 SGC-7901 세포 성장을 억제합니다.
SGC-7901 종양 이종이식 모델로 Apt-Au@MSL의 체내 항종양 활성을 평가했습니다. 대조군(모린, 모린-리포좀) 종양 이미지와 비교 시 Apt-Au@MSL 처리 마우스에서 종양 무게와 크기가 현저히 감소했습니다(그림 9a). 상대적 종양 부피 곡선과 마우스 체중 곡선은 Apt-Au@MSL이 체내에서 다른 치료군보다 높은 항암 효율을 보임을 나타냅니다(그림 9b). 대조군(모린, 모린-리포좀)과 블랭크군 간 평균 종양 부피에 유의한 차이가 없었습니다. Apt-Au@MSL군 종양 부피는 블랭크군의 약 1/10, 대조군의 약 1/6에 불과했습니다. 이는 순수 모린과 모린-리포좀(40mg/kg)이 종양 성장률에 영향을 미치지 않으나 Apt-Au@MSL은 종양 성장을 억제할 수 있음을 나타냅니다. 다양한 군(PBS, 모린, 모린-리포좀, Au-Apt)에서 마우스 체중은 치료 기간 중 현저한 변동이 없었습니다(그림 9c). 이는 치료가 내약성이며 급성 부작용이 없음을 시사합니다. 주목할 점은 Apt-Au@MSL 처리 마우스에서 생존율이 현저히 연장되었습니다(그림 9d). 이 군 생존 마우스는 정상적으로 행동하며 건강하지 않은 징후가 없었습니다. 이러한 결과는 Apt-Au@MSL 투여가 이종이식 마우스 모델에서 종양 성장을 억제할 수 있음을 입증했습니다.
고정 및 처리 후 종양 조직과 장기 시료를 H&E 염색했습니다. 다양한 군의 종양 조직 H&E 염색으로 치료 효능을 종양 세포 사멸 측면에서 평가했습니다. 그림 10a에서 Au-Apt, 모린, 모린-리포좀 처리 마우스는 블랭크군 마우스와 동일한 열 손상 정도를 보였습니다. 블랭크군에서는 명백한 세포 사멸이 관찰되지 않았으며 종양 조직 절편은 빽빽하게 포장된 종양 세포로 구성되었습니다. 그러나 Apt-Au@MSL 처리는 종양 조직에 가장 유의한 손상을 보였고 종양에서 중간 정도의 세포 사멸이 관찰되었습니다. 이는 Apt-Au@MSL 처리 마우스 모델에서 항암 활성을 시사합니다. 체내 종양 조직 세포 사멸 비율 추가 조사를 위해 TUNEL 분석으로 세포 사멸 세포를 검출했습니다. 그림 10b에서 종양 세포 사멸 세포는 녹색 형광으로 염색되어 세포 사멸을 나타냈습니다. 병합 이미지에서 블랭크군과 대조군(모린, Au-Apt)은 녹색 형광 영역이 적어 세포 사멸 세포가 적음을 나타냈습니다. 모린-리포좀 처리 마우스 세포는 부분적으로 세포 사멸된 것으로 보였습니다. 반면 Apt-Au@MSL 처리군에서는 다량의 녹색 형광 영역이 관찰되어 다량의 세포 사멸 세포를 나타냈습니다. 결과는 H&E 염색과 일치하며 Apt-Au@MSL이 체내 종양 세포 사멸을 촉진함을 확인했습니다.
항암제의 임상 적용에서 잠재적 체내 독성은 중요한 우려 사항입니다. Apt-Au@MSL의 체내 적용 가능성 검증을 위해 마우스를 다양한 처리(모린, 모린-리포좀, Au-Apt, Apt-Au@MSL)로 평가했습니다. 혈액 생화학 분석으로 치료 후 마우스 생화학 변화 가능성도 검사했습니다. 그림 11a에서 Apt-Au@MSL군 혈당 지수는 블랭크군과 대조군과 유사했습니다. 각 군에서 체중 차이도 없었으며 안정적 증가가 관찰되어 약물이 독성을 나타내지 않음을 시사했습니다(그림 11b). 장기 절편 H&E 염색(그림 11c)에서 Apt-Au@MSL 처리군은 블랭크군과 대조군 대비 손상이나 염증 징후가 없었습니다. 이는 PBS, 모린, 모린-리포좀, Au-Apt, Apt-Au@MSL이 체내에서 무시할 만한 부작용을 가짐을 나타냅니다. 이 결과들과 H&E 염색은 Apt-Au@MSL의 종양 치료 안전성을 추가로 입증합니다.
요약하면 본 연구는 항종양 나노물질 Apt-Au@MSL 합성을 제시합니다. Apt-Au@MSL은 우수한 단분산성과 종양 표적 특성을 보였습니다. 모린의 극성이 수정되어 항종양 활성이 향상되었습니다. 특성화 실험에서 용액 pH 5.0일 때 Apt-Au@MSL로부터 모린 방출률이 최대였습니다. Apt-Au@MSL은 Au-Apt 수정에 기인한 하이브리드 소포 형태를 보였으며 직경 150nm는 DLS 측정 크기와 일치했습니다. MTT 분석으로 암세포 모델을 선별한 결과 SGC-7901 세포 증식을 효과적으로 억제했습니다. Apt-Au@MSL의 SGC-7901 세포 IC₅₀는 15.6±1.5μg/mL였습니다. 형광 유세포 분석은 Apt-Au@MSL이 효과적인 항암 소재로 사용되어 체외에서 세포 사멸을 유도할 수 있음을 확인했습니다. TEM 이미지에서 세포 내부에서 발견된 Apt-Au@MSL은 암세포 표적 가능성을 시사했습니다. 종양 무게 시험에서 Apt-Au@MSL 투여가 이종이식 마우스 모델에서 종양 성장을 억제함을 확인했습니다. H&E 염색과 TUNEL 분석은 Apt-Au@MSL이 체내 종양 세포 사멸을 촉진함을 추가로 확인했습니다. 혈액 생화학 검사와 H&E 염색 모두 이 물질이 체내에서 무시할 만한 급성 독성과 우수한 생체적합성을 가짐을 시사합니다.
나노물질
금속 적층 제조는 가능하게 하는 새로운 것들로 흥미롭습니다. 이미 더 연비 효율적인 항공기를 위한 더 가벼운 부품을 만들고 맞춤형 의료 임플란트로 환자들의 삶을 개선하는 데 도움을 주었습니다. 시장도 성장하고 있어, 분석가들은 금속 적층 제조가 향후 10년간 2,280억 달러 규모의 구성요소를 생산할 것으로 예측합니다. 금속 적층 제조의 약속은 명확하지만 반드시 쉽게 실현되는 것은 아닙니다. 부분적으로 금속 적층 제조 설계에는 가파른 학습 곡선이 있기 때문입니다. 제조 산업은 감산 레거시 공정에 대해 수십 년간 축적한 기능적 지식이
제품이나 부품의 두 조각을 연결해야 한다면, 접착제에 의존하거나 후공정에서 금속 힌지나 다른 체결 부품을 추가할 필요가 없습니다. 대신 스냅핏 조인트(snap-fit joints)를 사용할 수 있습니다. 간단히 말해, 스냅핏 조인트는 비드(bead), 스터드(stud), 후크(hook) 같은 작은 돌기(조인트)를 짝이 되는 부품의 일치하는 함몰부에 끼워 두 조각을 연결합니다. 스냅핏 조인트는 사출 성형으로 만들 수 있지만, 언더컷이 필요해 스냅핏 조인트용 사출 금형 툴링은 비용이 많이 들고 복잡할 수 있습니다. 적층 제조(3D 프
