유기 인/칼슘 소스로부터 고표면적 난황-껍질 구조 인산칼슘 미세구체 합성 및 HEL 흡착 향상

요약

난황-껍질 구조 인산칼슘 미세구체는 우수한 물리화학적 특성과 생체적합성으로 의료 응용 분야에서 큰 잠재력을 가집니다. 그러나 높은 흡착 능력을 가진 난황-껍질 구조 인산칼슘 개발은 여전히 과제입니다. 본 연구에서는 아데노신 5'-삼인산 이나트륨 염(ATP)을 인 소스로, 글루콘산 칼슘 일수화물(CG)을 칼슘 소스로 사용하여 자가주형법을 통해 고비표면적(S_BET = 143 m²/g, 이는 칼슘 소스를 젖산 칼슘 오수화물(CL)로 대체해 합성한 ATP-CL 미세구체보다 약 3배 높음)을 가진 다공성 난황-껍질 구조 인산칼슘 미세구체(ATP-CG)를 성공적으로 합성했습니다. Ca/P 몰비, 수열 온도, 시간이 ATP-CG 미세구체 형태에 미치는 영향도 조사했습니다. 유기 칼슘 소스와 유기 인 소스가 난황-껍질 구조 형성에 핵심적 역할을 함을 확인했습니다. 또한 서로 다른 칼슘 소스로 합성된 두 종류의 난황-껍질 구조 미세구체의 헨 에그 라이소자임(HEL) 흡착 메커니즘을 규명하기 위해 흡착 실험을 수행했습니다. 결과적으로 ATP-CG 미세구체의 흡착 용량(332 ± 36 mg/g)은 ATP-CL 미세구체(176 ± 33 mg/g)의 약 2배였습니다. 칼슘 소스에 의한 높은 비표면적과 ATP-CG 미세구체의 독특한 표면 화학적 특성이 HEL 흡착 능력 향상에 중요한 역할을 함을 밝혔습니다. 이 연구는 제조된 난황-껍질 구조 미세구체가 약물 전달 분야에 유망하며 약물 흡착 능력을 개선하는 효과적 접근법을 제공함을 보여줍니다.

서론

인산칼슘은 우수한 생체적합성, 높은 약물 적재 용량, 전달 효율로 인해 최근 몇 년간 큰 주목을 받아왔습니다. 인산칼슘 기반 생체재료는 조직공학, 골재생, 약물 전달 등 다양한 의생명 분야에 널리 사용되어 왔습니다. 인산칼슘 기반 소재의 응용 범위 확장과 성능 향상을 위해 탄산화 하이드록시아파타이트(HAp) 미세구체, HAp 마이크로튜브, 중공 HAp 미세구체, 비정질 인산칼슘(ACP)의 메조포러스 난황@케이지-쉘 나노구체 등 다양한 형태와 미세구조를 가진 인산칼슘 소재가 보고되었습니다.

다양한 형태 중 난황-껍질 구조 미세구체는 첨단 소재과학일 뿐만 아니라 독특한 형태적 특징을 보여 더 많은 주목을 받고 있습니다. 난황-껍질 구조 미세구체에서 난황 코어와 쉘 사이의 빈 공간은 다양한 화물을 위한 저장소 역할을 할 수 있고, 다공성 쉘은 게스트 분자의 확산 경로를 제공하여 촉매, 리튬이온 배터리, 광촉매, 생물의학 등 다양한 분야에 잠재력을 가집니다. 전통적으로 희생 주형법이 난황-껍질 구조 미세구체 제조의 주요 방법이었습니다. 이러한 주형 전략은 구조와 특성 조절에 큰 성공을 거두었으나, 번거로운 공정 단계와 계면활성제 또는 구조지향 시약이 필요하며 인체 건강에 유해할 수 있다는 단점이 있습니다. 현재 자가주형법이 난황-껍질 구조 미세구체 연구에 널리 사용되고 있습니다. 전통적 주형법과 달리 자가주형법에서 사용되는 주형은 빈 공간 형성을 위한 주형일 뿐만 아니라 난황-껍질 구조 미세구체의 전구체 역할도 합니다. 따라서 자가주형법은 난황-껍질 구조 미세구체 제조에 편리한 접근법입니다. 그러나 자가주형법을 인산칼슘 난황-껍질 구조 미세구체 합성에 도입하는 것은 여전히 흥미로운 과제입니다.

또한 인산칼슘 소재는 단백질, DNA, siRNA 등 다양한 화물 운반에 활용되어 왔습니다. 그러나 인산칼슘의 낮은 약물 흡착 능력은 시급히 해결해야 할 과제입니다. 일반적으로 약물 분자의 담체 표면 고정은 표면 전위, 소수성/친수성, 수소 결합, 비표면적 등 표면 특성에 의존합니다. 따라서 표면 특성과 비표면적 향상은 담체의 약물 흡착 능력 강화에 유효한 접근법입니다.

본 연구에서는 아데노신 5'-삼인산 이나트륨 염(ATP)을 인 소스로, 글루콘산 칼슘 일수화물(CG)을 칼슘 소스로 사용하여 자가주형법을 통해 다공성 난황-껍질 구조 인산칼슘 미세구체를 제조했습니다. 주형제 첨가 없이 제조된 난황-껍질 구조 인산칼슘 미세구체는 특히 높은 비표면적을 나타냈습니다. 또한 ATP-CG 미세구체의 헨 에그 라이소자임(HEL) 흡착 거동을 칼슘 소스를 젖산 칼슘 오수화물(CL)로 대체해 제조한 ATP-CL 미세구체와 비교 조사했습니다. 결과는 칼슘 소스에 의한 비표면적 차이와 표면 화학적 특성이 HEL 흡착 능력 향상에 핵심적 역할을 함을 보여줍니다.

방법

재료

아데노신 5'-삼인산 이나트륨 염(ATP)은 중국 상하이 Macklin Biochemical Co., Ltd에서 구입했습니다. 글루콘산 칼슘 일수화물(CG)과 젖산 칼슘 오수화물(CL)은 중국 상하이 Sangon Biotech Co., Ltd에서 구입했습니다. 헨 에그 라이소자임(HEL, ~70000 U/mg)은 독일 Sigma-Aldrich(Taufkirchen)에서 구입했습니다.

ATP-CG 및 ATP-CL 난황-껍질 구조 미세구체 합성 및 특성 분석

ATP-CG 난황-껍질 구조 인산칼슘 미세구체는 다음과 같이 제조했습니다: 간략히, CG 0.9 g을 60°C에서 초순수 20 mL에 용해해 용액 C를 만들고, ATP 0.11 g을 초순수 5 mL에 용해해 용액 P를 만들었습니다. 용액 C를 실온으로 냉각한 후 용액 P와 격렬히 교반하며 혼합하고, 2 M NaOH 용액으로 용액 pH를 5로 조절했습니다. 최종 용액 부피는 초순수 추가로 30 mL가 되었으며 Ca/P 몰비는 3.3이었습니다. 최종 용액을 마이크로파 소화 시스템에 옮겨 마이크로파 수열 반응을 120°C에서 15분간 수행했습니다. 생성된 침전물을 원심분리(4500 rpm, 10분)로 수집하고 초순수로 세척한 후 48시간 동결건조했습니다. ATP-CL 미세구체는 문헌 절차에 따라 제조했습니다.

미세구체의 결정상은 X선 회절(XRD, Cu Kα 소스, λ = 0.154 nm)로 분석했습니다. 미세구체 형태는 주사전자현미경(SEM), 투과전자현미경(TEM), 고분해능 TEM(HRTEM)으로 관찰했습니다. 미세구체 조성은 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)으로 연구했습니다. 비표면적은 브루나우어-에멧-텔러(BET)법으로 측정했습니다. 열중량 분석(TGA)은 질소 분위기에서 승온 속도 10°C/min으로 시료의 열적 특성 연구에 사용했습니다.

HEL 흡착 및 특성 분석

두 종류의 미세구체에 대한 HEL 흡착 실험은 다음과 같이 수행했습니다: 일정량의 난황-껍질 미세구체(ATP-CG: Ca/P = 3.3, 120°C, 15분; ATP-CL: Ca/P = 2.5, 120°C, 30분)를 초순수에 분산시키고 10분간 초음파 처리해 1.5 mg/mL 미세구체 현탁액을 만들었습니다. 다양한 농도의 HEL을 함유한 수용액 0.5 mL를 위 현탁액 1 mL에 즉시 첨가해 최종 약물 농도를 1~7.5 mg/mL로 했습니다. 각 용액을 37°C에서 200 rpm으로 6시간 진탕했습니다. 이후 원심분리하고 상등액 내 HEL 양을 280 nm에서 UV-vis 분광광도계로 측정했습니다. 약물 적재 전후 미세구체의 제타 전위와 조성은 제타 전위 분석기, FTIR 분광계, 열중량 분석기(TGA, 승온 속도 10°C/min, 질소 분위기)로 분석했습니다.

흡착 등온선

흡착 거동 조사를 위해 Dubinin-Radushkevic(D-R) 등온선 모델을 사용했습니다. D-R 모델은 미세공 충전 이론에 기반하며, 비이상적 흡착을 이종 표면에서 기술하고 흡착 메커니즘(물리흡착 또는 화학흡착)을 구별하는 데 사용됩니다. 모델은 다음 식과 같습니다: Q_eq = Q_m exp(-K_DR ε²), ε = RT ln(1 + 1/C_eq), E = 1/√K_DR. 여기서 Q_eq는 평형 흡착 용량(mg/g), C_eq는 평형 시 수용액 내 흡착질 농도(mL/L), Q_m은 최대 흡착 용량, R은 기체 상수(8.314 J/(mol·K)), T는 절대 온도, E는 흡착 유형 추정을 위한 평균 자유 에너지입니다. E 값이 8 kJ/mol 미만이면 물리흡착, 8~16 kJ/mol이면 이온 교환, 16 kJ/mol 초과면 화학흡착으로 설명할 수 있습니다.

약물 흡착 통계 분석

데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타냈습니다. 유의한 차이(p < 0.05)는 일원분산분석(one-way ANOVA)으로 통계적으로 계산했습니다. 모든 실험은 3회 반복 수행했으며 DPS 소프트웨어로 데이터를 분석했습니다.

결과 및 고찰

미세구체 형태 및 화학적 특성 분석

ATP-CG 난황-껍질 구조 미세구체

그림 1은 다양한 반응 조건에서 얻은 시료들의 형태를 보여주는 SEM 이미지입니다. t = 5분 또는 15분에서는 모든 생성물이 균일한 미세구체로 구성됩니다. 그러나 수열 시간이 30분으로 더 증가하면 나노시트 자가조립 미세구체가 형성됩니다(그림 1 f, i, l 참조). 한편, t = 30분에서 Ca/P가 증가함에 따라 나노시트 자가조립 미세구체가 점차 형성됩니다(그림 1 f, i, l 참조). 나노시트 자가조립 미세구체 형성은 다음과 같이 설명할 수 있습니다. 첫째, 마이크로파 수열 공정에서 ATP 분자가 가수분해되어 아데노신 기반 분자(ADP, AMP, 아데노신)를 형성하고 동시에 인산 이온(PO₄³⁻)을 방출합니다. 한편 CG 분자는 가수분해되어 글루콘산염과 칼슘 이온(Ca²⁺)을 형성합니다. 인산 이온은 칼슘 이온과 반응해 1차 ACP 핵을 형성합니다. 이후 초기 ACP 핵이 성장하고 조립되어 ACP 미세구체를 형성합니다. 따라서 수열 시간이 더 연장되면 용액 내 ATP와 CG 분자가 추가로 가수분해되어 더 많은 PO₄³⁻와 Ca²⁺ 이온을 방출하며, 이는 시스템의 과포화도와 핵생성 속도를 높여 나노시트 자가조립 미세구체 형성을 촉진합니다. 또한 Ca/P를 증가시키면 국소적 고농도 Ca²⁺가 위와 같은 방식으로 생성물 형태 변환을 가속화합니다. 위 분석은 수열 시간과 Ca/P가 생성물 형태에 중요한 영향을 미침을 나타냅니다.

다음으로 120°C에서 15분간 합성된 다양한 Ca/P의 미세구체 FTIR 스펙트럼을 조사했습니다(그림 2). 1620 cm⁻¹, 1383 cm⁻¹, 912 cm⁻¹의 피크는 각각 CG의 C=O, C-O 특성 피크와 ATP의 P-O 기에 기인하며, 가수분해되지 않은 CG와 ATP 분자 또는 그 유도체가 미세구체 표면에 흡착됨을 시사합니다. HAp 유래 PO₄³⁻의 희미한 특성 피크는 1035 cm⁻¹에 위치하며, 1122 cm⁻¹와 567 cm⁻¹의 흡수 피크는 ACP의 PO₄³⁻ 이온에 할당되어 생성물이 ACP와 HAp로 구성됨을 나타냅니다. FTIR 결과는 ATP를 인 소스로, CG를 칼슘 소스로 사용하여 인산칼슘이 성공적으로 제조되었음을 시사합니다.

또한 마이크로파 수열법으로 120°C에서 15분간 합성된 다양한 Ca/P의 시료 SEM 및 TEM 이미지를 그림 3에 나타냈습니다. Ca/P가 0.8 또는 1.67일 때 시료는 다공성 미세구체로 구성됩니다(그림 3b, d). Ca/P가 2.5일 때 생성물 형태가 난황-껍질 구조 미세구체로 변하기 시작합니다(그림 3f). Ca/P가 3.3으로 더 증가하면 생성물은 완전히 난황-껍질 구조 미세구체로 구성됩니다(그림 3h). 그 이상에서는 일부 파손된 구체와 난황-껍질 미세구체의 노출된 코어(그림 3g 인셋)가 기계적 파쇄 후 관찰되어 난황과 쉘 사이의 중공 구조를 입증합니다. 위 관찰을 바탕으로 다양한 Ca/P로 합성된 난황-껍질 구조 미세구체 형성 메커니즘을 잠정적으로 제안합니다. Ca/P가 낮을 때 다공성 ACP 미세구체가 먼저 형성되는데, 이는 미세구체 표면에 흡착된 ATP와 CG 분자 또는 유도체의 억제 효과에 기인합니다. 이후 Ca/P가 더 증가하면 시스템의 높은 과포화도에 의해 준안정 ACP가 추가로 성장합니다. 마지막으로 결정화된 HAp가 외부 표면에 형성되는데, 이는 그림 3i의 HRTEM 이미지(격자 간 거리 0.308 nm가 HAp의 (210)면에 인덱싱됨)로 확인됩니다. 결과적으로 HAp와 ACP의 부피 또는 밀도 차이로 인해 난황과 쉘 사이의 중공 구조가 생성됩니다. 해당 EDS 매핑은 Ca, P, O 원소가 미세구체 전체에 균일하게 분포함을 보여줍니다. 그림 3k의 EDS 스펙트럼과 그림 3l의 XPS 스펙트럼은 미세구체의 화학적 원소가 주로 Ca, P, O로 구성됨을 보여주며 이는 FTIR 결과(그림 2)와 일치합니다.

Ca/P = 3.3으로 합성된 미세구체에 대한 마이크로파 보조 수열 시간과 온도의 영향을 추가로 조사했습니다. 그림 4a-b에서 수열 시간이 5분일 때 시료는 다공성 미세구체로 구성됩니다. 앞서 논의한 바와 같이 t = 15분일 때 생성물도 난황-껍질 구조 미세구체로 구성됩니다(그림 4c-d). 수열 시간을 60분으로 연장하거나 온도를 160°C로 높이면 시트 또는 막대 다발이 관찰됩니다(그림 4e-l). 다공성에서 난황-껍질로, 다시 시트 또는 막대로의 형태 변환은 용액 내 ATP와 CG 분자의 지속적인 가수분해에 의한 ACP의 추가 성장에 기인합니다. 또한 ACP 미세구체 표면에 흡착된 ATP와 CG 분자 또는 유도체의 가수분해도 ACP 성장을 가속화합니다. 60분 또는 160°C에서 흥미로운 현상이 나타났는데, 이들 시트 또는 막대도 ACP 나노입자로부터 발달합니다(빨간 박스 참조), 이는 그림 S1의 DTA 분석으로 확인됩니다. DTA 곡선에서 650°C에서 발열 피크가 관찰되며 이는 ACP 결정화에 기인합니다. 발열 피크는 수열 시간 또는 온도 증가에 따라 점차 약해지며, 이는 생성물 내 ACP가 결정질 인산칼슘으로 변환됨을 시사합니다.

Ca/P = 3.3에서 다양한 수열 시간 또는 온도로 합성된 시료의 화학적 조성과 구조를 FTIR과 XRD로 조사했습니다. 그림 5a에서 HAp의 PO₄³⁻ 이온 특성 피크는 1037 cm⁻¹과 603 cm⁻¹에 위치합니다. 1122 cm⁻¹ 피크는 ACP의 PO₄³⁻ 이온 특성 피크에 할당됩니다. 1620 cm⁻¹와 1383 cm⁻¹ 흡수 피크는 각각 CG의 C=O와 C-O 기 특성 피크에 기인합니다. 912 cm⁻¹ 흡수 피크는 ATP의 비대칭 P-O 신축 진동을 나타냅니다. 수열 시간 또는 온도 증가에 따라 CG와 ATP의 특성 피크 강도가 점차 감소하여 미세구체 표면에 흡착된 ATP와 CG 분자 또는 유도체가 추가로 가수분해됨을 나타냅니다. 한편 HAp의 PO₄³⁻ 이온 특성 피크 강도는 ACP 특성 피크 강도 감소와 함께 점차 증가하는 경향을 보여 생성물의 결정상이 HAp 상으로 변환됨을 나타냅니다.

그림 5b는 다양한 시료의 XRD 패턴을 보여줍니다. 5분 또는 15분 합성된 미세구체에서 2θ ≈ 30° 부근의 비정질상 특성 험프가 관찰됩니다. 그러나 수열 시간을 60분으로 연장하거나 온도를 160°C로 높이면 미세구체의 결정상이 완전히 HAp로 변환되며, 이는 표준 데이터(JDCPS no. 09-0432)로 인덱싱될 수 있습니다. (211), (300), (002) 격자면의 상대 강도 향상은 생성물의 결정도 증가를 추가로 설명합니다. 따라서 XRD와 FTIR 결과는 수열 온도 또는 시간 증가에 따른 생성물의 결정상 변환을 추가로 확인시켜 줍니다.

ATP-CL 난황-껍질 구조 미세구체

약물 흡착 거동 비교를 위해 CL을 유기 칼슘 소스로 사용해 마이크로파 수열법으로 다른 난황-껍질 구조 미세구체를 제조했습니다(참조 [24]). 형태 측면에서 시료는 여전히 난황-껍질 구조 미세구체로 구성되며, 이는 파손된 구체(그림 6a 인셋)와 TEM 이미지(그림 6b, c)로 검증됩니다. 이 결과는 칼슘 소스 변경이 생성물 형태에 유의미한 영향을 미치지 않음을 보여줍니다. 또한 선택영역 전자회절(SAED)은 이산 SAED 스팟을 보여줍니다(그림 6d), 이는 잘 결정화된 미세구체가 얻어짐을 입증합니다. EDS 매핑은 미세구체 내 Ca, P, O 원소의 균일한 분포를 보여줍니다(그림 6e). 해당 EDS 스펙트럼도 미세구체 내 Ca, P, O 원소 존재를 확인합니다(그림 6f), 이는 제조된 미세구체가 인산칼슘임을 나타냅니다.

미세구체의 HEL 흡착 및 흡착 메커니즘

그림 7에서 두 종류의 미세구체 흡착 용량은 초기 HEL 농도 증가에 따라 증가합니다. 초기 HEL 농도가 6.5 mg/mL로 증가하면 ATP-CG 미세구체 흡착 용량이 평탄해지며 최대 흡착 용량은 약 332 ± 36 mg/g입니다(그림 7a), 이는 ATP-CL 미세구체(176 ± 33 mg/g, 6 mg/mL, 그림 7b)의 약 2배입니다.

HEL 흡착 결과는 FTIR 스펙트럼과 TG 곡선으로 추가 뒷받침됩니다. 그림 8a, b에서 1134 cm⁻¹(1139 cm⁻¹)과 563 cm⁻¹(568 cm⁻¹)의 흡수 피크는 ACP의 PO₄³⁻ 이온 특성 피크에, 1039 cm⁻¹(1040 cm⁻¹)은 HAp의 PO₄³⁻ 이온 특성 피크에 할당되며, 이는 HEL 도입이 미세구체 구조에 유의미한 변화를 일으키지 않음을 나타냅니다. 1542 cm⁻¹와 1545 cm⁻¹의 흡착 피크는 HEL의 아미드 기에 기인하며 HEL이 미세구체에 성공적으로 흡착됨을 확인합니다. 한편 2966, 2962, 2935, 2927 cm⁻¹의 흡착 밴드는 HEL의 -CH₃와 -CH₂ 기에 기원하며 HEL이 미세구체에 존재함을 추가로 검증합니다. TGA 곡선에서 ATP-CG 미세구체의 HEL 흡착 전후 중량 손실은 각각 11.3%와 36.7%입니다(그림 8c). 따라서 ATP-CG 미세구체의 HEL 흡착 용량은 약 340 mg/g입니다. 그러나 ATP-CL은 HEL 흡착 전 21.1% 중량 손실, 흡착 후 37% 중량 손실을 보입니다(그림 8d). 따라서 ATP-CL 미세구체의 HEL 흡착 용량은 189 mg/g입니다. TGA 결과는 그림 7 결과와 근접합니다.

두 미세구체 간 흡착 용량 차이의 원인을 조사하기 위해 미세구체의 평형 흡착 데이터를 D-R 등온선 모델로 추가 분석했습니다. 피팅 곡선은 그림 9에, 피팅 파라미터는 표 1에 각각 나타냈습니다. 피팅 결과에서 ATP-CG의 상관계수가 ATP-CL보다 높아 D-R 모델이 ATP-CG 미세구체의 약물 흡착 거동 기술에 적합함을 시사합니다. E 값이 8 kJ/mol 미만이므로 ATP-CG 미세구체 상의 HEL 흡착은 물리흡착입니다. ATP-CG 미세구체의 HEL 최대 용량(Q_m)은 381 mg/g에 육박할 수 있으며 이는 그림 7a 결과와 근접합니다.

ATP-CG 미세구체 상의 HEL 흡착이 물리흡착이므로 미세구체 표면 전위를 조사했습니다. 그림 10a에서 초순수 중 ATP-CG, ATP-CL 미세구체와 HEL의 제타 전위 값은 각각 -17 mV, -22 mV, 20 mV입니다. HEL 흡착 후 ATP-CG와 ATP-CL 미세구체 제타 전위 값은 각각 2.7 mV와 1.5 mV로 변하며, 이는 HEL 분자가 인력 정전기력을 통해 미세구체 표면에 흡착됨을 나타냅니다. 그러나 인력 정전기력은 두 미세구체 간 흡착 용량 차이의 주요 원인이 아닙니다. 두 미세구체 간 제타 전위 값(-17 mV와 -22 mV)에 유의미한 차이가 없기 때문입니다.

따라서 미세구체 간 흡착 용량 차이를 일으키는 이유를 추가로 규명하기 위해 미세구체 비표면적을 조사했습니다. 그림 11a에서 ATP-CG 미세구체의 BET 비표면적(S_BET)은 143 m²/g로 ATP-CL 미세구체(55 m²/g, 표 2)의 약 3배입니다. 따라서 비표면적이 미세구체 간 흡착 용량 차이에 기여할 수 있습니다. ATP-CG 미세구체의 이러한 높은 비표면적은 주로 낮은 결정도에 기인합니다(참조 [31]). 그림 11b에서 ATP-CG 미세구체는 ATP-CL 미세구체보다 낮은 결정도를 보입니다. 또한 ATP-CG와 ATP-CL 간 결정도 차이는 주로 다른 합성 조건에 기인합니다. 일반적으로 일정 압력과 온도에서 반응물의 가수분해 정도가 증가하면 생성물 결정도도 증가합니다. 여기서는 글루콘산(pKa = 3.39)의 산도가 젖산(pKa = 3.86)보다 높아 더 느린 가수분해 속도를 유발하고 궁극적으로 더 낮은 결정도를 나타냅니다. 결과적으로 칼슘 소스 변경을 통해 더 높은 비표면적을 가진 ATP-CG 미세구체를 얻었습니다.

결론

ATP-CG 난황-껍질 미세구체는 ATP를 유기 인 소스로, CG를 유기 칼슘 소스로 사용하여 마이크로파 보조 수열법으로 설계되었습니다. 이 미세구체는 높은 비표면적과 높은 흡착 능력을 나타냅니다. Ca/P, 수열 온도, 시간이 미세구체 형태와 구조에 미치는 영향도 조사했습니다. 연구는 유기 인 소스와 유기 칼슘 소스가 난황-껍질 구조 미세구체 형성에 중요한 영향을 미침을 보여줍니다. 또한 수열 조건(Ca/P, 수열 시간, 온도)이 난황-껍질 미세구체 형성에 책임이 있습니다. 나아가 서로 다른 칼슘 소스로 합성된 두 종류의 미세구체 HEL 흡착 거동 비교를 통해 미세구체 흡착 용량에 영향을 미치는 두 핵심 요인이 비표면적과 표면 전위 같은 표면 화학적 특성임을 밝혔습니다.