전이성 유방암의 초음파 영상과 시너지 치료를 통합하기 위한 저강도 집중 초음파 증강 다기능 나노입자
초록
유방암의 전이는 예후에 부정적인 영향을 미치는 것으로 여겨집니다. 현저한 깊숙이 침투하고 비침습적인 특성의 이점을 누리는 소노다이나믹 요법(SDT)은 암 치료로 이어지는 전체 시리즈의 잠재력을 보여줍니다. 단독요법의 한계를 극복하기 위해 복합적인 나노플랫폼을 탐색하여 시너지 치료 효율을 실현하고 있습니다. 여기에서 우리는 잘 설계된 PLGA 코어-쉘 구조에서 chlorin e6(Ce6, SDT용), 퍼플루오로펜탄(PFP, 초음파 영상용) 및 도세탁셀(DTX, 화학요법용)을 캡슐화하는 새로운 다기능 나노 시스템을 설정합니다. 우수한 생체 적합성과 안정성을 특징으로 하는 시너지 Ce6/PFP/DTX/PLGA 나노 입자(CPDP NP)는 주로 추가 적용을 가능하게 합니다. 저강도 집속 초음파(LIFU) 조사 시 향상된 초음파 영상이 시험관 내 및 생체 내 모두에서 드러날 수 있습니다. 더 중요하게는, LIFU와 결합된 나노입자는 Ce6에 의해 유도된 세포독성 활성 산소 종과 DTX 방출을 통해 흥미로운 항종양 능력을 보여 공동 치료 효율을 생성합니다. 또한, 이 치료 전략은 폐 전이성 결절이 현저히 감소된 강력한 항전이 능력을 활성화합니다. 결과는 화학 요법과 결합된 SDT 지향 나노 플랫폼이 효과적인 시너지 요법을 높이고 유방암의 폐 전이를 억제하는 유망한 접근 방식으로 제공될 수 있음을 나타냅니다.
소개
유방암은 가장 위협적인 악성 종양 중 하나로 수년 동안 여성들을 괴롭혀 왔습니다. 높은 이질성과 높은 전이 능력으로 인해 유방암의 원격 전이는 사망률의 90% 이상을 차지하는 것으로 보고되고 있지만 진행성 또는 전이된 환자의 5년 생존율은 26%에 불과하여 결과적으로 열악한 임상 결과[1,2,3]. 유방암의 부정적인 특성은 완전한 치료를 어렵게 만들고, 원발성 종양과 원격 전이를 제거하는 데 더 도전적인 치료 전략을 추진합니다.
수술과 화학요법과 같은 전통적인 치료 접근법은 여전히 유방암 치료에 효과적인 것으로 간주됩니다[4]. 모든 화학요법 약물 중에서 도세탁셀(DTX)은 전이성 유방암(MBC) 및 진행성 유방암(ABC) 치료에 중요한 역할을 하고 있습니다[5]. 주목나무의 화학물질에 의해 합성되는 1차 항종양제로 DTX의 항종양 효과는 주로 유사분열과 세포 증식을 파괴함으로써 달성된다[6]. 광범위한 항종양 효율을 보유한 DTX는 유방암 치료에 있어 가장 효과적인 화학요법제 중 하나가 되고 있습니다[7]. 그러나 화학요법제는 일반적으로 전신독성 뿐만 아니라 바람직하지 않은 효과를 유발하여 치료효율을 크게 제한하고 있다[8]. 게다가, 다양한 임상 단계와 다양한 개인 상태는 단일 치료 접근법이 유방암 치료에 대한 모든 기대를 충족시키기에 충분히 효율적이지 않을 수 있음을 보여줍니다. 따라서 향후 적용 요건에서 DTX의 독성 부작용을 억제하고 치료 효과를 향상시키는 것이 시급합니다.
초음파는 방사선이 없고, 비침습적이며, 비용 효율성과 같은 탁월한 이점으로 인해 임상 진단에서 처음 탐색되었습니다[9, 10]. 위에서 언급한 독특한 특징에도 불구하고 나노구조 물질을 기반으로 한 치료적 전망에서도 많은 주목을 받고 있다[11]. 초음파 역학 요법은 처음에 초음파에 의해 유발된 캐비테이션 및 '소노포레이션 효과'에 의해 실현되었습니다. 이 과정에서 생성되는 ROS는 암세포에 대한 세포독성을 효과적으로 유도하여 종양세포의 빠른 DNA 손상과 세포사멸을 유도한다[9]. 광역학 요법(PDT)의 피상적 사용과 달리 SDT는 치료 중 바람직하지 않은 열 손상을 예방할 수 있는 장점이 있는 저강도 집속 초음파(LIFU)로 심부 종양을 치료할 때 보다 쾌적한 치료 결과를 얻습니다[12, 13]. SDT의 필수 요소 중 하나인 sonosensitizer는 다양한 종양 치료에서 탐구되었습니다[14]. Chlorine e6(Ce6)은 원래 일반적인 감광제로 사용되었지만 바람직한 치료 능력과 종양 조직에 대한 우수한 친화력으로 인해 초음파 감작제로도 적용할 수 있습니다[15]. 2세대 염소 계열로 활동하는 Ce6은 바람직한 ROS 생성을 위해 종양 치료에서 광범위한 관심을 불러일으켰습니다[16]. 그러나 Ce6의 단일 적용은 지속적으로 불안정성을 유발하고 바람직하지 않은 피부 독성을 유발하여 광범위한 SDT 탐색을 제한했습니다.
최근 몇 년간 나노기술의 발전은 바이오센싱, 환경오염, 오염물질 분해 등 많은 분야에서 매우 중요한 역할을 해왔다[17,18,19,20,21,22,23]. 나노기술 기반 나노입자는 더 작은 직경, 더 큰 외부 표면적, 더 낮은 내부 확산 저항과 같은 많은 장점을 가지고 있다[24]. 이전에 나노입자는 MOF[25], 이산화티타늄[26], 그래핀[21]과 같은 다양한 재료의 응용에 관여해 왔다. 암 치료와 결합된 나노기술의 급속한 성장 추세도 광범위하게 탐구되어 결합 치료 전략을 촉진하는 실행 가능한 방법을 제시했습니다[27]. 효과적인 종양 치료 적용을 실현하기 위해 정교하게 설계된 나노 입자는 주로 EPR(Enhanced Permeability and Retention) 효과를 통해 독성 화학 요법제 수송 효율을 개선하도록 설정되어 종양 부위에 축적을 증가시킬 수 있습니다[28, 29]. 또한, 화학 요법의 캡슐화를 통해 원치 않는 부작용을 줄일 수도 있습니다. 퍼플루오로펜탄(PFP)은 조사 시 액상에서 기상으로 전환하는 뛰어난 능력을 보유하고 있는 것으로 보고되었으며, 특히 초음파 이미징 및 치료에서 새로운 초음파 분자 프로브로 적용될 수 있습니다[30]. 더 중요한 것은 초기 액상이 PFP를 다양한 재료로 쉽게 캡슐화할 수 있다는 것입니다[31]. 게다가, PFP의 캡슐화는 위에서 언급한 EPR 효과에 따라 종양 부위의 초음파 영상 능력을 크게 향상시킬 수 있고 더 큰 마이크로미터 크기의 미세 기포로 인한 크기 제한을 피할 수 있습니다. 종양 이미징을 제외하고 여러 치료 접근법의 조합은 나노 시스템 지향 암 치료에서 엄청난 가치가 있습니다. 특히, 초음파 역학 요법과 화학 요법의 통합을 포함한 관행은 전통적인 치료 효율성을 혁신하는 데 중점을 두었습니다. Xu et al. [32]는 SDT로 인해 향상된 치료 결과가 화학 요법 약물로 밝혀져 미토콘드리아 표적 종양 세포 사멸의 활성화로 이어질 수 있음을 입증했습니다. 이 패턴은 시너지 효과를 내며 향후 활용도가 매우 높다.
여기서 우리는 위에서 언급한 영감을 바탕으로 CPDP NPs(all-in-one nanoparticles)를 활용하여 SDT 중심의 화학요법과 결합된 시너지 요법으로 구현되는 진단 및 치료 시스템을 구축하고 향상된 기능을 발휘하고자 합니다. 초음파 영상. 바람직한 나노운반체로서 우수한 안전성과 이상적인 대사 안정성을 보유하고 있는 PLGA는 다양한 항종양 능력을 탐색하는 데 유리하다[33, 34]. 따라서 이 전략에서 PLGA를 외부 층 재료로 사용하면 PFP는 LIFU에 의해 트리거되는 위상 변이 기능을 통해 초음파 이미징을 크게 향상시킬 수 있는 반면 바람직한 2세대 초음파 증감제인 Ce6도 LIFU에 노출되어 ROS 생성을 유도할 수 있습니다. 또한 DTX 방출과 함께 화학 요법과 SDT를 모두 구현하여 궁극적으로 시너지 요법을 달성 할 것입니다. 중요한 것은 CPDP 나노입자의 코어-쉘 구조가 정상 조직이나 세포를 손상시키지 않고 꾸준히 투여될 수 있고 또한 나노입자가 상대적으로 더 높은 캡슐화 효율을 가질 수 있도록 한다는 점이다[35]. 더욱이, 이러한 코어-쉘 구조[36,37,38]에서 내용물이 잘 보호될 수 있으며, 특히 구조 존재로 인해 액체에서 기체로 효과적으로 변환될 수 있는 PFP의 경우. 이러한 코어-쉘 구조를 사용하면 시너지 전략을 보다 안정적인 방식으로 동시에 입증할 수 있습니다. 첫째, 시너지 전략은 효과적인 캡슐화에 의해 DTX의 부작용을 크게 줄이는 데 도움이 됩니다. 이는 악성 및 공격적인 종양 치료에서 고통을 완화하는 데 매우 중요합니다. 둘째, 단일 화학 요법에 비해 SDT와 화학 요법의 조합은 치료 효율성을 강화하는 유망한 전략으로 확인되었습니다. 셋째, PFP로 구현된 향상된 초음파 영상은 진단 전략을 최적화하고 항종양 효과를 검증하는 데 도움이 되었습니다. 마지막으로 전체 시스템이 우수한 생체 적합성으로 안전하고 안정적입니다. 이 전략에서 폐 전이와 종양 성장이 시험관 내 및 생체 내 모두에서 현저하게 억제되었다는 것이 강조됩니다. 결론적으로, 시너지 전략은 유방 악성 종양 및 원격 전이에 대한 생산적인 치료 효능을 입증했으며 초음파 영상 능력과 결합하여 향후 임상 적용에서 유망한 치료 전략이 될 수 있습니다.
자료 및 방법
자료
PLGA-COOH(Mw 12,000 Da)는 Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd(Jinan, China)에서 구입했습니다. 퍼플루오로펜탄(PFP) 및 아가로즈는 Sigma-Aldrich Co., Ltd.(St. Louis, MO)에서 구입했습니다. Chlorin e6(Ce6)은 Melone Pharmaceutical Co., Ltd.(Dalian, China)에서 구입했습니다. Cell Counting Kit-8(CCK-8) 세포독성 분석 키트는 Dojindo Molecular Technologies(Tokyo, Japan)에서 구입했습니다. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(H2DCFDA)는 MedChemExpress Co., Ltd.(미국 뉴저지주)에서 구입했습니다. Propidium iodide(PI)는 Solarbio Science and Technology Co. Ltd.(Beijing, China)에서 입수했습니다. Annexin V-FITC/PI는 BD Biosciences(USA)에서 입수했습니다. Docetaxel(DTX)은 MedChemExpress Co., Ltd.(NJ, USA)에서 구입했습니다. 다른 모든 시약은 추가 정제 없이 분석용 순수 제품이었습니다. Roswell Park Memorial Institute 1640 배지(DMEM), 태아 소 혈청 및 티리신은 Gibco(ThermoFisher Scientific, USA) 및 UV 분광 광도계(UV-Vis, Hitachi, Japan)에서 구입했습니다.
CPDP NP의 합성
Ce6-PFP-DTX/PLGA 나노입자(CPDP NPs)는 이전 보고서[39, 40]에 따라 W/O/W 이중 에멀젼 방법으로 제조되었습니다. 간단히 말해서, 2mg Ce6을 먼저 500μL 메탄올에 용해했습니다. 다음으로 PLGA-COOH 50mg과 도세탁셀(2mg)을 디클로로메탄 4mL에 녹인 후, 이전 용액을 동시에 가하였다. 그런 다음 위의 용액에 200μL PFP를 추가했습니다. 결과적으로, 혼합물은 초음파 프로브(Sonics &Materials Inc., USA)에 의해 트리거되어 첫 번째 에멀젼을 얻었습니다(5초 켜기 및 5초 끄기, 3분). 두 번째 에멀젼을 얻기 위해 8mL의 폴리(비닐 알코올)(PVA) 용액(w/v =4%)을 동일한 초음파 프로브를 사용하여 2분 동안 위의 에멀젼에 첨가했습니다. 최종 에멀젼에 2% 이소프로필알코올 10mL를 첨가한 후, 용액을 실온에서 4시간 이상 기계적으로 혼합하여 디클로로메탄을 완전히 휘발시켰다. 마지막으로 CPDP NP를 3회(12,000rpm, 5분) 원심분리한 다음 수집하여 추가 사용을 위해 4°C에서 보관했습니다. Ce6을 제외하고 동일한 방법으로 PDP NP를 제조하였다. 모든 실험 과정은 얼음 위에서 운영되었으며 엄격하게 어둠 속에서 진행되었습니다.
CPDP NP의 특성
CPDP NP 및 PDP NP의 입자 크기 및 제타 전위는 Malvern Zetasizer Nano 기기(Malvern, UK)에 의해 실현되었습니다. 형태는 투과전자현미경(TEM)과 광학현미경으로 특징지어졌다. 안정성을 평가하기 위해 CPDP 나노입자를 PBS(phosphate-buffered solution)에 녹여 각각 7일의 크기를 측정했습니다. 각 샘플을 3중으로 측정했습니다. CPDP NP의 캡슐화 효율은 다음 공식을 통해 계산되었습니다.
캡슐화 효율(%) =(로드 DTX 또는 Ce6의 무게/총 DTX 또는 Ce6의 무게) × 100%. 다양한 재료의 캡슐화를 확인하기 위해 다양한 샘플의 UV-Vis 스펙트럼을 조사했습니다(UH5300, Hitachi). 효과적인 캡슐화도 TEM으로 분석했습니다.
CPDP NP의 약물 방출 비율
CPDP 나노입자에서 Ce6 및 DTX의 약물 방출 능력을 평가하기 위해 pH가 다른 두 가지 용액(인산염 완충 용액, PBS:7.4, 아세트산 완충 용액, ABS:5.6)을 사용하여 누적 방출 효율을 테스트했습니다. 간단히 말해서, 혼합물을 투석 백(Mw:10,000)에 밀봉한 후 CPDP NP를 1mL PBS 또는 ABS로 먼저 분산시켰습니다. 그런 다음 전체 용액을 유리병(총 부피:150mL)에 옮기고 여기에 149mL PBS 또는 ABS를 첨가하여 총 용액 부피를 150mL로 유지했습니다. 그런 다음 유리병을 37°C 항온 진탕기에 넣고 다른 기간(0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72시간)에 용액을 수집하고 즉시 동일한 것으로 보충했습니다. 매체의 양. 각 그룹은 세 번 반복되었습니다. 마지막으로 Ce6과 DTX의 농도는 Synergy Hybrid Multi-Mode Read(BioTek, USA)로 각각 403과 229 nm에서 측정하였고, 각 시점에서의 약물 방출 속도를 계산하였다.
체외 초음파 영상
CPDP NP의 초음파 기능을 조사하기 위해 에멀젼(1 mg/mL)이 먼저 저강도 집속 초음파(LIFU) 변환기 장비(Ronghai Ultrasonic Medical Engineering Research Center, Chongqing, China)에 의해 트리거되었으며 전도 패턴은 다음과 같습니다. 50% 듀티 사이클로 설정, 다양한 강도에서 1초 펄스 지속 시간(1–2 W/cm
2
) 다른 지속 시간 동안. 초음파 이미징의 경우 2D 및 CEUS 이미징을 모두 관찰하기 위해 Philips EPIQ5 초음파 진단 기기(프로브 주파수:12MHz, MI:0.06)를 사용하여 조사된 CPDP NP를 이전에 준비된 아가로스 모델에 각각 추가했습니다. 한편, ImageJ 소프트웨어를 적용하여 각 그룹의 회색조 값을 분석했습니다.
LIFU 조사에 의한 CPDP NP의 세포 흡수 및 체외 ROS 생성
뮤린 유방암 세포주 4T1은 중국 과학 아카데미(중국 상하이)의 상하이 세포 은행에서 입수했으며 10% FBS 및 1% 스트렙토마이신/페니실린이 혼합된 RPMI 1640 배지에서 37°C, 5% CO에서 배양되었습니다. 2 가습 인큐베이터.
4T1 세포는 1 × 10
4
의 밀도에서 이전 조건으로 먼저 배양되었습니다. 다양한 시간 간격(1시간, 2시간, 4시간, 8시간)에서 CLSM을 사용하여 세포 흡수를 테스트하기 위해 접시당 세포. ROS 생성을 확인하기 위해 세포를 대조군, CPDP NPs, LIFU, Ce6 + LIFU, CPDP NPs + LIFU의 5개 그룹으로 분리했습니다. 24시간의 기존 배양 후 배지를 각각 CPDP NP(200μL, 0.8mg/mL) 또는 Ce6 용액(200μL)으로 교체하고 세포를 추가로 3시간 동안 공동 배양했습니다. 그런 다음 LIFU 조사(2 W/cm
2
, 120초)는 각각 다른 그룹에 따라 수행되었습니다. 공동 배양 및 LIFU 처리 후 100 μL 희석된 DCFH-DA 용액을 첨가하고 각 그룹을 이전 배양기에서 15분 동안 배양했습니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 활성 산소종 생성 결과를 확인하고 해당 형광 강도를 ImageJ 소프트웨어로 측정했습니다.
CPDP NP의 시험관 세포독성 및 공동 치료 능력
CCK-8 분석을 적용하여 CPDP NP의 세포독성을 평가했습니다. 간단히 말해서, 4T1 뮤린 유방암 세포는 밀도가 1 × 10
4
인 96웰 플레이트에서 배양되었습니다. 웰당 24시간 동안 그런 다음, CPDP NP를 다양한 농도(0,0.2,0.4,0.6,0.8 mg/mL, n)에서 무혈청 RPMI 1640 배지로 희석했습니다. =3), LIFU 조사 유무(2 W/cm
2
) , 120초). 또 다른 24시간의 공배양 과정 후, 4T1 세포의 세포 생존력이 수행되었습니다.
공동 치료의 세포 사멸 효율을 평가하기 위해 4T1 세포를 이전과 같이 24시간 동안 공배양한 후 (1) 대조군(치료 없음), (2) LIFU(2W/cm에서 LIFU 노출만 있음)의 5개 그룹으로 분리했습니다.
2
), (3) CPDP NPs(0.8 mg/mL의 CPDP NPs 용액만 사용), (4) PDP NPs + LIFU 및 (5) CPDP NPs + LIFU. 다양한 나노입자 공동 배양(200μL) 및 LIFU 노출 후 각 그룹에 annexin V(5μL) 및 propidium iodide(5μL) 이중 염색을 20분 동안 처리하고 유세포 분석 프로토콜을 통해 분석했습니다.
체외 세포 전이 억제
세포 전이 능력의 억제를 조사하기 위해 상처 치유 분석 및 트랜스웰 분석을 설계했습니다. 상처 치유 분석을 위해, 4T1 세포를 6-웰 플레이트에서 이전과 같이 통상적으로 배양하였다. 세포가 80% confluency로 성장한 후 피펫 팁(10μL)을 적용하여 6웰 플레이트의 중앙을 따라 인공 스크래치를 수행했습니다. 그런 다음 위에서 언급한 동일한 그룹에서 세포를 처리했습니다. 24시간 동안 지속적으로 공동 배양한 후 세포를 PBS로 3회 세척하고 광학 현미경(Olympus, Japan)으로 관찰했습니다.
트랜스웰 분석의 경우, 트랜스웰 챔버(미국 샌디에고 코닝 소재)의 상단 구획은 생체 내에서 세포외 기질을 모방하기 위해 주로 적용되었습니다. 1 × 10
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밀도의 4T1 세포 웰당 세포를 무혈청 RPMI 1640 배지의 상부 챔버에 접종하고, 하부 구획은 10% FBS와 혼합된 완전한 배양 배지로 채웠다. 그런 다음 위의 그룹과 동일하게 세포를 분리하여 각각 24시간 동안 처리하였다. 그 후, 바닥면의 세포를 파라포름알데히드로 고정하고 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 광학현미경으로 관찰한 결과입니다(Olympus, Japan).
체내 초음파 영상
건강한 암컷 BALB/c 마우스(4주)와 Kunming 마우스(4주)는 Ningxia Medical University Laboratory Animal Center에서 입수했습니다. 모든 동물 실험은 Ningxia Medical University의 동물 복지 윤리 검토 위원회에서 승인한 지침에 따라 수행되었습니다. 마우스 종양 보유 모델을 확립하기 위해 BALB/c 마우스에 4T1 유방암 세포를 접종했습니다(1 × 10
7
/mL) 오른쪽 측면에 있습니다. 종양 크기가 60~80mm로 성장한 후
3
, BALB/c 마우스에 꼬리 정맥을 통해 CPDP NP(200μL, 1mg/mL)를 정맥 주사했습니다. 24시간 후, 마우스의 종양 부위를 LIFU(2 W/cm
2
, 120초) 그런 다음 앞서 언급한 Philips EPIQ5 초음파 진단기를 통해 2D 및 CEUS 영상을 획득했습니다. 회색조 분석은 ImageJ 소프트웨어로 측정되었습니다.
CPDP NP의 생체 내 시너지 치료 효율성
4T1 암세포 접종 후 2일마다 종양의 크기를 기록하고 다음 공식으로 종양의 부피를 계산했습니다. 부피 =1/2 × 길이 × 너비 . 종양 크기와 마우스 체중은 2일마다 기록하고 종양 성장 사진은 3일마다 기록했습니다. 종양 부피가 60–80 mm에 도달한 경우
3
, 유사한 종양 크기를 가진 마우스를 대조군, LIFU, CPDP NP, PDP + LIFU 및 CPDP NPs + LIFU(n =3). 각 그룹은 대조군(대신 200μL PBS)을 제외하고 꼬리 정맥을 통해 다양한 NP(200μL)를 정맥 주사했습니다. 24시간 후, 종양 부위는 LIFU 조사(2 W/cm
2
) 120초 동안 전체 SDT 투여는 3일마다 반복되었고 18일 동안 지속되었습니다. 마우스의 체중과 종양 부피를 측정하고 계산했습니다. 처리 후 마우스를 죽이고 종양 조직을 H&E, TUNEL 및 PCNA로 보내 추가 조직학적 분석을 수행했습니다.
생체 내 CPDP NP의 생물학적 안전성
생체 내에서 CPDP 나노입자의 생물학적 안전성을 조사하기 위해 건강한 암컷 쿤밍 마우스(n =3) 대조군, 5mg/mL, 10mg/mL 및 20mg/mL의 4개 그룹으로 분리되었습니다. CPDP NP(200μL)를 마우스 꼬리 정맥을 통해 주입했습니다. 그런 다음, 마우스는 추가 투여 없이 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 2일마다 마우스의 체중을 측정했습니다. 30일 후 마우스를 죽이고 혈액 세포 및 생화학 분석을 위해 혈액 샘플을 수집했습니다. 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐 및 신장)를 각각 수집하여 H&E 염색에 대해 조사했습니다.
폐 전이의 생체내 억제
각 군의 폐전이 억제를 평가하기 위해 폐의 전이성 결절의 수와 H&E 염색 조직학적 평가를 관찰하여 전 과정을 진행하였다. 모든 마우스를 안락사시킨 후, 폐 조직을 제거하고 고정시켰다. 그런 다음 암 결절의 사진을 찍고 H&E 염색으로 폐 조직을 추가로 분석했습니다.
통계 분석
측정 데이터는 모두 3회 수행되었으며 평균 ± 표준편차(SD)로 표현되었으며 일원 ANOVA 또는 표준 Student의 t로 분석되었습니다. SPSS 소프트웨어(버전:19.0)를 통해 테스트하는 동안 p value <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
<섹션 데이터-제목="결과">
결과
CPDP NP 및 약물 방출 효율의 특성화
이중 에멀젼 방법은 상전이 물질 PFP, 초음파감작제 Ce6 및 화학약품 DTX를 동시에 캡슐화한 CPDP 나노입자 제조에 적용되었습니다. PBS 또는 탈이온수에 분산될 때 용액은 밝은 회색을 나타냅니다. CPDP 나노입자는 광학현미경 또는 투과전자현미경을 통해 관찰하든지 간에 균일한 구형과 명확한 코어-쉘 구조를 나타냈습니다(그림 1a, b). CPDP NP와 PDP NP의 평균 직경은 249.5 ± 77.46 nm 및 246.6 ± 81.01 nm이고, 평균 표면 제타 전위는 각각 -6,dm. CPDP 나노입자의 크기는 EPR 효과를 통해 수동적으로 종양 부위에 축적될 수 있음을 보장합니다[40]. CPDP 나노입자와 PDP 나노입자 사이의 전하가 다른 것은 주로 음전하를 띤 Ce6 때문이다[41]. 또한, CPDP NP의 음의 제타 전위는 더 낮은 혈장 단백질 흡착을 나타내어 나노입자의 상대적 안정성을 확인했습니다. 입자 크기 분포는 7일 동안 249.5~385.1nm 범위에서 유지되었으며(그림 1e), CPDP NP의 상대적인 안정성을 보여줍니다. 표준 곡선에 따르면 DTX와 Ce6의 캡슐화 효율은 각각 83.84 ± 1.39%와 60.54 ± 3.79%였습니다.
<그림>
아 TEM(축척 막대:500nm) 및 b CPDP NP의 광학 현미경 이미지(스케일 막대:20μm). ㄷ 크기 분포 및 d PDP NP 및 CPDP NP의 제타 전위. 이 7일 이내의 CPDP NP 크기 분포 에 Ce6 및 g의 출시율 다양한 조건(pH 7.4 및 pH 5.6, n)에서 DTX의 방출 속도 =3). 아 Ce6, DTX, PFP/PLGA 및 CPDP NP의 UV-Vis 스펙트럼. CPDP NP의 화살표는 Ce6과 DTX의 특징적인 피크를 보여 두 재료의 효과적인 캡슐화를 나타냅니다. 나 두 나노입자의 TEM 결과. PFP/PLGA 나노 입자는 얇은 껍질과 둥근 코어를 나타냅니다(왼쪽). Ce6과 DTX를 모두 캡슐화한 CPDP 나노 입자는 훨씬 두꺼운 껍질과 타원형 코어를 보여줍니다(오른쪽)
도 1f,g에 표시된 CPDP NP로부터의 Ce6 및 DTX의 약물 방출 효율과 같이 pH 7.4에 용해된 나노입자와 비교하여 pH 5.5에서 DTX 방출 지수의 거의 2배 증가가 기록되었으며, 이는 합리적인 약물 방출을 나타냅니다. DTX의 비율은 산성 종양 미세 환경에서 효과적으로 달성될 수 있습니다. 위의 결과는 모두 섬세하게 설계된 CPDP NP가 산성 종양 환경에서 안정적이고 시기 적절한 화학 요법 약물 방출을 발휘할 수 있으며 SDT를 준비하는 것이 기본적으로 바람직하다는 것을 보여주었습니다.
UV-Vis가 나타난 것처럼 DTX와 Ce6은 각각 229nm와 403nm에서 고유한 흡수 피크를 나타냈고 반대로 PFP/PLGA는 피크를 나타내지 않았습니다. CPDP NP의 스펙트럼은 위의 두 파장 근처에서 유사한 피크를 나타냈고 나머지는 PFP/PLGA 스펙트럼의 동일한 경향을 보여 다양한 재료의 성공적인 캡슐화를 나타냅니다(그림 1h). 효과적인 캡슐화를 추가로 확인하기 위해 그림 1i는 PFP/PLGA 나노 입자가 훨씬 더 얇은 쉘과 둥근 코어를 소유하는 반면 CPDP 나노 입자는 DTX와 Ce6의 캡슐화로 인해 상대적으로 두꺼운 쉘과 타원형 코어를 나타냅니다.
체외 초음파 영상
PFP가 우수한 위상 변이 능력을 보유하고 있음이 강조됩니다. 액체에서 기체로의 변환은 나노입자가 종양 부위 내에서 응집하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 초음파 영상의 효율성을 향상시키는 능력을 부여합니다[42]. 이를 입증하기 위해 LIFU 조사가 PFP의 상 변형, 즉 음향 액적 기화(ADV) 효과를 유도하는 방아쇠로 적용되었습니다[43]. 그 결과 LIFU 조사 전에는 회색조 강도가 상대적으로 낮은 수준으로 유지되었지만 LIFU의 강도와 조사 시간이 증가한 후에는 2D와 CEUS 모두에서 향상된 초음파 영상의 경향이 나타났습니다(그림 2a). ImageJ의 음향 분석은 이미징 결과와 일치하는 상승된 그레이스케일 값(그림 2b, c)으로 결과를 더욱 확신시켰습니다. LIFU 강도가 2W/cm
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에 도달했을 때 얻은 2D 및 CEUS의 가장 중요한 결과에 유의해야 합니다. 120초 동안 지속되었습니다. 위의 결과는 PFP가 CPDP NP에 성공적으로 캡슐화되었으며 더 높은 강도와 더 긴 LIFU 투여 시간 하에서 초음파 이미징 기능이 크게 향상되었음을 보여줍니다.
<그림>
아 서로 다른 LIFU 강도 및 지속 시간에 따른 2D 및 CEUS의 초음파 이미지. ㄴ 2D 이미징 및 c의 서로 다른 강도와 시간에서 해당 그레이스케일 강도 CEUS 이미징(**p <0.01, n =3)
LIFU 조사에 의한 CPDP NP의 세포 흡수 및 체외 ROS 생성
CLSM 결과가 그림 3에서 볼 수 있듯이 CPDP NP의 세포 흡수는 다른 시간 간격에서 향상된 경향을 나타내어 8시간 공동 배양에서 가장 유의한 응집에 도달했습니다.
<그림>
다양한 시간 간격 동안 CPDP NP의 4T1 세포 흡수(파란색:DAPI로 염색된 4T1 세포. 빨간색:DiR 표지 CPDP NP, 눈금 막대는 50μm임)
Sonodynamic Therapy(SDT)의 주요 전략은 ROS(일련의 단일 전자 환원 산물)를 생성하여 암세포의 세포 사멸을 유도하고 세포 증식을 억제하는 것입니다[44]. 초음파에 노출되면 초음파 감작제가 ROS 생성을 촉발하는 경향이 있음이 강조됩니다. 한편, 전체 과정에서 상당한 양의 에너지가 방출될 것입니다[45]. 초음파와 초음파 증감제는 SDT를 촉진하기 위한 필수 요소이므로 세포 내 ROS 생성을 설계하고 분석하여 분할된 그룹 간의 차이점을 조사했습니다. 그림 4a에 따르면 유리 Ce6 + LIFU 조사 그룹에 의해 생성된 ROS의 양은 무시할 수 있었는데, 이는 유리 Ce6의 빠른 대사가 불만족스러운 ROS 생성으로 이어지기 때문일 수 있습니다. 반대로, CPDP NPs + LIFU 군에서 가장 강한 형광 강도를 나타냈다. 캡슐화된 Ce6은 잘 보호되어 대사되지 않는 것으로 가정되었습니다. 그 결과, LIFU 자극 후 Ce6이 방출되어 풍부한 ROS를 생성하였다. 이에 비해 다른 그룹에서는 유의한 형광 신호가 발견되지 않았습니다(그림 4b).
<그림>
아 다양한 처리와 b를 사용한 ROS 생성의 CLSM 이미지 해당 FL 강도 분석(****p <0.0001, n =3). 눈금 막대는 50μm
입니다.
CPDP NP의 시험관 세포독성 및 공동 치료 능력
Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석은 CPDP NP의 시험관 내 세포독성을 테스트하기 위해 도입되었습니다. 이와 관련하여 서로 다른 농도에서 LIFU 조사가 있거나 없는 다른 그룹을 설계했습니다. 결과는 LIFU 노출 없이 24시간 공동 배양 후 최고 농도(0.8mg/mL)에서도 CPDP NP의 생존율에 대한 명백한 효과가 없음을 나타내어 CPDP NP의 바람직한 생물학적 안전성을 보여줍니다(그림 1a). 5a). By contrast, it showed that there was a striking decrease of cell viability after LIFU irradiation, showing the combination of CPDP NPs and LIFU has remarkably triggered 4T1 cell death, which was consistent with the in vitro ROS generation.
아 Relative cell viability with or without LIFU irradiation under different CPDP NPs concentrations. ㄴ 4T1 tumor cell apoptosis and necrosis by flow cytometry assay and c the data of corresponding necrosis and apoptosis rate analysis (****p < 0.0001, ***p < 0.001, n =3)
To further evaluate SDT efficacy, a flow cytometry assay was introduced. As the results shown in Fig. 5b, c, the index of cell necrosis and apoptosis was highest observed in CPDP NPs + LIFU group, while other groups showed no obvious and necrosis and apoptosis. Notably, the necrosis and apoptosis rate of CPDP NPs + LIFU group was threefold higher than that of CPDP NPs only group, which ensured the significant tumor cell death efficiency of SDT from another respect. Intriguingly, compared with PDP NPs + LIFU group, cell necrosis and apoptosis rate in CPDP NPs + LIFU group was significantly increased, exhibiting the synergistic therapy efficiency of SDT and chemotherapy.
In Vitro Inhibition of Cell Metastasis
The invasive and migration capability of tumor cells are indispensable in tumor progression [46, 47]. As shown in Fig. 6a, the closure between the physical gap of CPDP NPs + LIFU group was significantly wider than other groups, indicating a relatively slower speed of migrating efficiency. According to the ImageJ software analysis (Fig. 6c), the migration rate of CPDP NPs + LIFU group was also remarkably reduced compared with other groups.
아 The wound healing and b The transwell assay after various treatments. ㄷ The corresponding migration rate of wound-healing assay. d The corresponding migration number of tranwell assay (****p < 0.0001, n =3)
Similarly in the transwell assay, compared with the swift migration speed of other groups, CPDP NPs + LIFU group revealed a significant reduction of cell number (Fig. 6b), which demonstrated an excellent anti-migration capability of the synergistic therapy. Specifically, with the absence of SDT (CPDP NPs only and LIFU only group), the number of tumor cells was mildly decreased (Fig. 6d). On the whole, due to the combination of SDT as well as chemotherapy, metastasis of 4T1 cells has been remarkably inhibited in vitro.
In Vivo Ultrasound Imaging
Since PFP was encapsulated in CPDP NPs, it is also necessary to evaluate the characteristic ultrasound imaging capability in vivo. After the injection via the tail vein of CPDP NPs, LIFU was then applied to the tumor site to acquire both 2D and CEUS imaging (Fig. 7a). The clear graphic difference between the two groups indicated that after LIFU irradiation, the corresponding intensity of CPDP NPs was elevated obviously compared with the pre-irradiation group. Further data of the average echo intensity also confirmed this result, which was also consistent with the in vitro imaging result previously (Fig. 7b, c).
아 2D and CEUS images with and without LIFU irradiation. ㄴ , ㄷ The corresponding grayscale intensity analysis measured by ImageJ (**p < 0.01, *p < 0.05, n =3)
In Vivo Synergistic Therapeutic Efficiency of CPDP NPs
Seeing from Fig. 8a, b, the tumor volume of CPDP NPs + LIFU group was significantly smaller after 18 days of treatment than that of other groups, which may attribute to the effectiveness of ROS originated from SDT treatment as well as chemotherapy to exert a valid synergistic therapy efficiency. Similarly, photographs of mice-bearing tumors (Fig. 8a) also showed the same trend, verifying the cooperative treating efficacy of CPDP NPs triggered by LIFU exposure. Furthermore, there was no obvious weight reduction of mice between different groups (Fig. 8c). The results above all indicated a much higher inhibition rate of CPDP NPs + LIFU group, revealing that the synergistic therapy could significantly prevent tumor growth.
아 Images of tumor-bearing mice under various treatments within the certain 18 days (n =3). ㄴ Tumor volume analysis according to various treatments (**p <0.01). ㄷ Weights of tumor-bearing mice under various treatments (ns no significance, n =3). d H&E, PCNA and TUNEL results under various treatments (scale bar:200 μm). 이 Analysis of PCNA proliferation index of tumors under various treatments. f Analysis of TUNEL apoptotic index of tumors under various treatments (****p <0.0001, n =3)
To further testify the therapeutic results of all groups, both H&E, PCNA, and TUNEL staining were utilized (Fig. 8d). The proliferate rate of PCNA in CPDP NPs + LIFU group was only 20.50%, which was fourfold lower than control group, threefold lower than LIFU and CPDP NPs only group and twofold lower than PDP + LIFU group, respectively, demonstrating a significant anti-tumor proliferation rate (Fig. 8e). As it is shown in Fig. 8d, f, the TUNEL results indicated CPDP NPs + LIFU group exhibited an obvious apoptosis index of 72.86%, which was much higher than control (9.66%), LIFU (12.86%), CPDP NPs (19.59%), and PDP NPs + LIFU (37.06%) group. The results above all demonstrated the effectiveness of synergistic therapy exerted in vivo, which was also proved consistent with the previous in vitro results.
Biosafety of CPDP NPs In Vivo
Despite the effective therapeutic outcome, it is of great importance to explore the biosafety of the novel established nanoparticles as well. On behalf of the safe distribution of CPDP NPs in vivo, the metabolic safety was conducted. The results showed that instead of apparent body weight loss, the mice body weight elevated gradually in all the groups of mice (Fig. 9a), which indicated a negligible negative influence of CPDP NPs. In addition, as various organs and the blood samples exhibited in Fig. 9b, no significant changes were observed in blood cell, biochemistry analysis index, and H&E staining (Fig. 9c) among different treating groups, indicating the excellent biosafety of CPDP NPs in vivo.
아 The weights of healthy Kunming mice under various concentrations of CPDP NPs (n =3). ㄴ The blood biochemistry and blood routine examination under various concentrations of CPDP NPs within a certain period of 30 days (n =3). ㄷ H&E results of different organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of mice under the same treatment (scale bar:50 μm)
In vivo Inhibition of Lung Metastasis
It is well established that the lung is the main target organ for distant metastasis of breast cancer [48]. In order to evaluate the suppressing efficiency of metastasis, lung tissues of mice were utilized for anti-metastatic investigation. As seen from Fig. 10a, b, compared with control, LIFU, CPDP NPs, and PDP + LIFU group, the CPDP NPs + LIFU group exhibited the most remarkable decrease of lung nodules, which suggested its desirable lung metastatic inhibition efficiency. A similar trend of decreasing also further indicated by H&E staining (Fig. 10c), which in all demonstrated this synergistic therapy strategy could exert effective effort in eliminating lung metastasis in mice.
아 Images of the general appearances of lung tissues. ㄴ The analysis of the metastatic lung nodules between various treatments (**p < 0.01, n =3). ㄷ Corresponding images of lung metastatic H&E staining results (scale bar:50 μm)
Discussion
It has been greatly acknowledged that the metastasis of breast cancer will extensively influence its poor prognosis [3, 49]. As a desirable therapeutic approach, SDT may serve for its high efficiency and deep penetrating capability has been extensively convinced [11, 50]. Admittedly, since certain limitations exist in the single application of sonosensitizers, using SDT alone may still be less sufficient in further cancer exploration. The development of nanotechnology combined with clinical medicine has been promoted significantly in recent years, owning to the inspiring merits such as negligible toxicity, none invasiveness, and excellent biocompatibility. Using this novel approach, researchers have made many efforts in exploring multifunctional therapeutic strategies to enhance antitumor efficiency.
The biosafety is the priority of nano-agents. As a widely accepted material approved by the Food and Drug Administration (FDA) certification, it is highlighted that PLGA could be performed as a desirable carrier in application [51, 52]. Based on its advantages, we established a nano-system to realize multifunctional therapy efficiency, exploiting PLGA as the outer structure to encapsulate sonosensitizer Ce6, phase-shift material PFP and chemotherapeutic agent DTX. The CPDP nanoparticles (CPDP NPs) were primarily observed by the core–shell structure and appropriate size so that a desirable aggregation through the EPR effect could be achieved. The cell viability of CPDP NPs has been proved to be above 80% after 24-h coincubation, indicating the well safety of this nanoplatform. Besides, the phase transformation of encapsulated PFP has also guaranteed CPDP NPs as a contrast-enhanced agent when activated by LIFU. The enhanced ultrasound imaging capability will not only ensure the ideal therapeutic window but also promote the promising future for CPDP NPs to realize an integration of accurate diagnosis and precise treatment.
The key strategy in SDT is the generation of ROS. Compared with the single employment of Ce6, the encapsulated Ce6 in PLGA exerted a desirable protection, which could be verified by the ROS result. In our study, there was only a negligible amount of ROS generated by single use of Ce6, while nanoparticle-encapsulated Ce6 produced a considerable amount of ROS, which was further proved by SDT efficiency. The result indicated that ROS generation was preserved by the encapsulated Ce6 in CPDP NPs, which could lay a firm foundation for later tumor inhibition. Besides, the drug-releasing rate showed even at pH 5.5, little Ce6 was released from nanoparticles, demonstrating a well protection of sonosensitizer by PLGA, which was further proved by the ROS production and SDT outcome with high efficiency. Interestingly, the drug-releasing efficiency of DTX and Ce6 at pH 5.5 was quite different according to the results (more than 40% and around 20%, respectively), which may possibly cause by the diverse encapsulation efficiency of the two drugs. The minor releasing rate of Ce6 demonstrated that it could be effectively protected in PLGA so that substantial ROS generation through LIFU stimulation could be reached to get a more convinced SDT efficiency. Another reason for this difference may be due to the different solvents of the two drugs during the preparation process. Specifically, DTX and PLGA were directly dissolved in dichloromethane, while Ce6 needed to be first dissolved in methanol and then added dropwise to dichloromethane, due to its poor solubility in the latter [53]. Since drug release in nanoparticles is directly related to the effectiveness of subsequent combination therapy, the assessment of drug-releasing rate as well as ROS generation result has mutually proved this point. Current researches have suggested that using chemotherapy alone may not significantly reverse tumor progression [41]. In this study, the nanoplatform we designed demonstrated strong evidence that compared with the single employment of chemotherapy, the synergistic treatment has remarkably elevated therapeutic efficiency both in vitro and in vivo. Since LIFU stimulation optimized the therapeutic strategy, an increased cell apoptosis rate was remarkably elevated. It is worth noting that due to this synergistic strategy, lung metastasis could be significantly inhibited both at tumor cell level and inoculated mice model, which is consistent with previous reports [16, 52].
Conclusion
In conclusion, the safe and stable CPDP NPs we designed and prepared plus LIFU irradiation could remarkably eliminate breast tumor progression and its lung metastasis. With an enhanced imaging capability, this nanoplatform was also considered to be a promising contrast-enhanced agent in clinical. Hence, the novel synergistic strategy combined with LIFU might be considered as an effective treating application to reverse the poor outcome of metastatic breast cancer.
