콘드로이틴 황산염/폴리카프로락톤/젤라틴 전기방사 나노섬유는 항혈전성 및 혈관 조직 공학을 위한 잠재적 스캐폴드로서 강화된 내피 세포 친화력을 가지고 있습니다.

초록

전기방사된 고분자 나노섬유는 혈관 조직 공학에서 많은 관심을 받아왔다. 그러나, 느린 내피화 및 혈전증의 결핍을 갖는 기존의 나노섬유 재료는 혈관 조직 복구 및 재생 촉진에 효과적이지 않다. 본 연구에서는 다양한 양의 콘드로이틴 설페이트(CS)를 포함하는 생체모방 젤라틴(Gt)/폴리카프로락톤(PCL) 복합 나노섬유를 전기방사 기술을 통해 개발하여 항혈전성 및 내피 세포 친화도에 미치는 영향을 조사했습니다. PG 나노섬유의 다양한 CS 농도는 섬유 형태와 직경에 영향을 미칩니다. CS/Gt/PCL 나노섬유는 적절한 다공성(~ 80%)과 PBS 용액 흡수(최대 650%)를 가지고 있습니다. Gt/PCL 나노섬유에 CS를 도입하면 항응고 특성이 크게 향상되고 응고 시간이 연장되며 세포 반응이 촉진됩니다. 특히, 10%CS/Gt/PCL 나노섬유는 양호한 세포 부착, 신장 및 증식을 나타낸다. 따라서 일정량의 CS를 포함하는 Gt/PCL 나노섬유는 혈관 복구 및 재생에서 유망한 조직 공학 스캐폴드로서 우수한 후보가 될 수 있습니다.

소개

나노섬유 물질의 개발은 세포외 기질(ECM)과 같은 극세 섬유 구조, 우수한 기계적 특성, 큰 비표면적, 높은 다공성과 상호 연결성 [1, 2]. 나노섬유 구조는 접촉 유도를 통한 세포 접착, 형태(예:퍼짐, 정렬, 연장 등), 배열, 이동, 증식, 표현형 및 분화와 같은 세포 반응을 매개하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 입증되었습니다. ,4,5]. 수많은 나노 제조 전략(예:나노스카이빙, 템플릿 합성, 상 분리 등)이 나노섬유 재료를 제조하는 데 사용할 수 있는 기술을 제공했지만 전기방사는 다양한 재료(금속, 세라믹, 폴리머)에서 나노섬유를 제조하는 가장 효과적인 방법 중 하나입니다. , 복합 재료 등) 산업적 규모[6,7,8].

(생체)물리적 신호에 추가하여, 적절한 생체 재료의 선택은 조직 복구 및 재생뿐만 아니라 세포 활동에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다[9]. 생체 적합성, 생체 흡수성, 기계적 특성 및 생체 기능과 같은 일부 주요 기능을 고려해야 합니다[9, 10]. 천연/천연 및 합성/합성 복합 재료에 비해 천연 고분자와 합성 고분자로 구성된 복합 나노섬유 재료는 천연 고분자의 우수한 생물학적 특성과 합성 고분자의 기계적 강도의 결합으로 인해 더 많은 관심을 받고 있다[9]. 이 중 젤라틴(Gt)/폴리카프로락톤(PCL) 조합은 가장 대표적으로 연구된 천연 합성 하이브리드 시스템 중 하나로 혈관 조직 공학에 널리 사용된다[11,12,13,14]. 그러나 Gt/PCL 복합 나노섬유는 느린 내피화 및 혈전증과 같은 몇 가지 한계가 있습니다. 최근 콘드로이틴 설페이트(CS)는 글리코사미노글리칸과 갈락토사민을 함유하는 황산화 다당류로, 내피 세포(EC)에 대한 높은 접착력, 단백질 및 혈소판에 대한 약한 상호작용, 음으로 하전된 혈액 성분의 정전기적 반발력을 갖는 것으로 입증되었습니다[15 ,16,17]. 또한 CS는 세포 사멸을 억제하고 혈관 상처의 치유를 촉진할 수 있습니다[18, 19]. 따라서 CS를 포함하는 Gt/PCL(PG) 전기방사 나노섬유는 혈관 복구 및 재생을 위한 생체-지시적 조직 공학 스캐폴드로서 탁월한 후보가 될 것입니다.

본 연구에서, 상이한 CS 비율을 포함하는 생체모방 PG 복합 나노섬유는 1단계 전기방사를 통해 개발되었다. CS/PG 복합 나노섬유의 형태, 화학적 특징 다공도 및 분해는 다양한 특성화 기술에 의해 감지되었습니다. PG/CS 복합 나노섬유의 항응고제를 평가하였다. 또한, CS 비율이 다른 이러한 복합 나노섬유에 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)를 주입하여 세포 반응에 미치는 영향을 조사했습니다.

자료 및 방법

자료

CS(소 기관, A형, 순도:95%)는 Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.(중국)에서 공급했습니다. PCL은 Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc.(중국)에서 입수했습니다. Gt(소 피부, B형)는 Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd.(중국)에서 입수했습니다. 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT) 키트는 Leigen Biotechnology Co., Ltd(중국)에서 구입했습니다. 아세트산(순도:99.5%)은 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.(중국)에서 구입했습니다. 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)는 중국 칭다오 대학 부속 병원에서 입수했습니다. 배양 배지 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12), 태아 소 혈청(FBS), 0.25% 트립신-EDTA는 Biological Industries(Israel)에서 구입했습니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 시약은 Sigma Aldrich(중국)에서 구입했습니다. 모든 실험에 사용된 물은 탈이온화되었습니다.

나노섬유의 전기방사

PCL(10% w/v)을 실온에서 4시간 동안 기계적 교반 하에 아세트산에 용해시켰다. Gt(10% w/v)를 2시간 동안 일정하게 교반하면서 90% 아세트산에 용해시켰다. 상이한 농도의 CS를 Gt 용액에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하여 총 중합체 농도에 대해 5, 10 및 15 중량% CS를 함유하는 균질한 용액을 얻었다. 그런 다음, 5%CS@PG, 10%CS@PG 및 15%CS@PG로 명명된 위의 두 용액을 2시간 동안 교반하면서 50/50(w/w)의 중량비로 혼합하여 PG 용액을 제조했습니다. .

제조된 균질한 용액은 21G 바늘이 있는 1mL 주사기와 알루미늄 호일로 덮인 수집기를 갖춘 전기방사 공정을 거쳤습니다. 이 연구에서 집전판과 바늘 끝 사이의 거리는 약 18cm로 고정되었고 전압은 23kV로 설정되었으며 고분자 용액은 1mL/h의 속도로 펌핑되었습니다. 모든 용액은 실온 및 주의 깊게 제어된 습도(<40%)에서 전기방사 기기(Technology, Tk602TH, 중국)에서 전기방사되었습니다. 추가 실험에 앞서 샘플을 최소 72시간 동안 진공 건조 오븐에 넣어 남아 있는 용매를 제거했습니다.

주사 전자 현미경(SEM) 및 투과 전자 현미경(TEM)

CS@PG 나노섬유 스캐폴드의 형태는 실온에서 20kV의 가속 전압에서 SEM(VEGAS, TESCAN, Czech)에 의해 조사되었습니다. 나노섬유의 직경(n =100)은 이미지 분석 소프트웨어(이미지 J)를 사용하여 SEM 이미지에서 추가로 측정되었습니다.

TEM 관찰 및 에너지 분산 X선 분광법(EDS) 분석은 JEOL JEM-2100 plus(일본)를 사용하여 수행되었습니다.

푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)

FTIR은 Nicolet iN10 FTIR 분광기(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 수행하여 CS, PG 나노섬유 및 CS@PG 나노섬유의 특징적인 작용기를 평가하였다. 샘플의 스펙트럼은 4000~500cm의 파장 범위에서 전송 모드로 기록되었습니다.⁻¹ 해상도 2cm⁻¹ .

인산염 완충 식염수(PBS) 용액의 다공성 및 흡수

나노섬유의 다공성은 액체 치환법을 사용하여 수행되었다. 먼저 나노섬유의 건조중량은 W₁로 칭량하였다. . 그런 다음, 4개의 나노섬유 그룹을 25°C에서 2시간 동안 에탄올에 담그고 무게를 W₂로 지정했습니다. . 시료 표면의 에탄올을 여과지로 제거한 후 시료의 무게를 W₃로 기록하였다. . 나노섬유의 다공성은 다음 공식으로 계산되었습니다.

$${\text{공극률}}\left( \% \right) =\left( {W_{3} - W_{1} } \right)/\left( {W_{3} - W_{2} } \오른쪽) \times 100$$

PBS 용액 흡수 시험을 위해 얻어진 나노섬유를 건조 상태에서 칭량하여 Wd로 기록하였다. 그런 다음, 나노섬유를 25°C에서 24시간 동안 PBS에 담그고 샘플 표면의 과잉 액체를 제거한 후 젖은 상태의 무게를 Ww로 기록했습니다. 팽윤율은 다음 방정식으로 측정할 수 있습니다.

$${\text{PBS}}\;{\text{흡수}}\left( \% \right) =\left( {W_{{\text{W}}} - W_{{\text{d} }} } \right)/W_{{\text{d}}} \times 100$$

위 실험의 모든 값은 평균 ± SD(n =3).

체외 분해 행동

얻어진 나노섬유의 라이소자임 저항성을 확인하기 위해 예정된 시간(1일, 4일, 7일, 10일, 14일)에 샘플의 분해성을 측정했습니다. 나노섬유의 초기 중량은 W_i로 기록되었습니다. . 그런 다음, 샘플을 리소자임(500μg/mL)이 포함된 PBS 용액(pH 7.4)에 담그고 37°C에서 시험관 내 인큐베이션했습니다. 미리 정해진 분해 간격으로 각 샘플 그룹을 제거하고 탈이온수로 세척하고 동결 건조하여 최종 중량(W _f ). 라이소자임 용액은 일주일에 세 번 교체되었습니다. 나노섬유 스캐폴드의 남은 질량(%)은 다음 공식으로 정의된 대로 추정되었습니다.

$${\text{질량}}\;{\text{나머지}}\left( \% \right) =\left( {1 - \frac{{w_{i} - w_{f} }}{{ w_{i} }}} \right) \times 100\%$$

7일 후 샘플의 분해 거동을 평가하기 위해 나노섬유의 형태를 SEM으로 관찰했습니다.

혈액 적합성 분석

응고 시간

활성 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)을 사용하여 커버슬립에서 전기방사된 나노섬유와 함께 배양 후 혈소판 결핍 혈장(PPP)의 응고 시간을 테스트하여 고유하고 일반적인 응고 경로의 활성을 평가했습니다. 이를 위해 항응고된 혈액(약 10mL)을 채취하고 3000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 혈소판 결핍 혈장(PPP)을 얻었다. 각 샘플을 200μL의 PPP와 함께 37°C에서 10분 동안 배양하고 제조업체의 지침에 따라 APTT 키트를 사용하여 분석했습니다(n =3).

용혈 테스트

용혈율은 전기방사된 나노섬유에 노출된 희석된 전혈에서 적혈구로부터 용액상으로 방출되는 헤모글로빈의 농도를 측정하여 평가하였다. 커버슬립의 샘플을 24웰 플레이트에 개별적으로 놓고 30분 동안 37°C에서 2mL PBS에 담궜습니다. 음성 대조군에는 2mL의 PBS만 포함된 반면 양성 대조군은 적혈구의 최대 용해를 유도하기 위해 2mL의 탈이온수로 구성되었습니다(n =각 테스트 그룹에 대해 3). 그런 다음, 앞서 언급한 항응고 처리된 신선한 전혈 40μL를 각 웰에 첨가하고 37°C에서 60분 동안 배양한 후 현탁액을 원심분리 튜브로 제거하고 100× g에서 원심분리했습니다. 5분 동안 상층액은 마이크로플레이트 리더(SynergyH1/H1M, BioTek, China)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정했습니다.

혈전성

혈소판 풍부 혈장(PRP)과 함께 전기방사 샘플을 배양한 후 시험관 내에서 혈전 생성 가능성을 평가했습니다. 원심분리(1500rpm, 20분)에 의해 PRP를 제조하고 혈장의 상한 절반을 버렸다. 그런 다음, 커버슬립의 나노섬유를 37°C에서 2시간 동안 100μL의 PRP에서 배양하고 후속 실험을 위해 PBS로 3회 부드럽게 헹구었습니다. PRP와 함께 인큐베이션한 후 혈소판 활성을 평가하기 위해 전기방사된 나노섬유를 10% FBS가 보충된 DMEM에 2시간 및 24시간 동안 보관한 다음 CCK-8 분석 키트를 사용하여 나노섬유의 혈소판 생존율을 측정했습니다. CCK-8(20μL)을 24웰 플레이트에 있는 200μL의 무혈청 DMEM 배지에 첨가하고 1시간 동안 배양했습니다. 마지막으로 현탁액은 450nm의 파장에서 마이크로플레이트 판독기로 측정되었습니다.

세포 배양 및 세포 생존력

인간 대동맥 내피 세포(HAEC)를 37°C 및 5% CO2의 분위기에서 FBS(10%, v/v) 및 스트렙토마이신/페니실린(1%, v/v)이 보충된 DMEM에서 배양했습니다. . 배양 배지는 일주일에 세 번 교체되었습니다. 일반적으로 세포를 0.05% 트립신/EDTA로 3분 동안 분리하고 1000rpm에서 원심분리한 다음 신선한 배지에 현탁하여 세포 계대 또는 세포 파종을 수행했습니다.

세포 시딩 전에 24웰 플레이트의 모든 나노섬유 재료를 UV 조사 하에 1시간 동안 멸균하고 75% 에탄올(v/v, %)에 1시간 동안 담그었습니다. 그런 다음, 나노섬유를 PBS 용액으로 4회 헹구고 CO₂에서 12시간 동안 DMEM에 담가두었습니다. 부란기. 세포는 1 × 10⁴ 의 밀도로 시딩되었습니다. 나노섬유의 웰당 세포 수와 배지는 매일 교체되었습니다. 24시간 공배양 후 세포를 PBS 용액으로 3회 세척한 후 Calcein-AM/PI Double stain Kit(YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China)로 염색하였다. PI는 죽은 세포를 염색하고 Calcein-AM은 살아있는 세포를 염색하는 데 사용했습니다.

나노섬유의 세포 형태

나노섬유에 대한 세포 부착을 관찰하기 위해 Fluorescence Microscope(Nikon A1 MP, Japan)로 24시간 공배양 후 세포의 형태를 관찰하였다. 먼저, 세포를 실온에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정했습니다. 그런 다음 0.5% Triton X-100 용액을 5분 동안 사용하여 세포막을 투과화했습니다. 마지막으로, 4'6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 사용하여 세포 핵을 염색하고 로다민-팔로이딘을 사용하여 F-액틴을 염색했습니다. 정량적 분석(세포 밀도, 단일 세포 면적, 세포 신장)을 Image J로 추가로 수행했습니다.

세포 증식

복합 나노섬유에 대한 세포 증식 활성은 CCK-8 Assay Kit를 이용하여 수행하였다. HAEC는 8 × 10³ 의 밀도로 나노섬유에 시딩되었습니다. 세포/웰. 배양 배지는 2일마다 교체하였다. 1, 4, 7일의 공배양 후 PBS 용액으로 세포를 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 그런 다음, 20μL CCK-8과 1:10의 부피 비율의 완전 배지를 인큐베이터에서 1시간 동안 24웰 플레이트에 첨가했습니다. 흡광도는 450nm에서 Elisa Reader로 테스트되었습니다.

DAPI와 rhodamine-phalloidin으로 세포 염색을 하여 형광현미경으로 2일과 6일 동안 서로 다른 나노섬유와 공배양한 후 세포수의 변화를 직접 관찰하였다.

통계 분석

실험의 모든 샘플은 3중으로 처리되었습니다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시됩니다. 샘플의 통계적 분석은 p에 할당된 유의성과 차이를 비교하기 위해 일원 분석 분산(ANOVA)에 의해 결정되었습니다. <0.05.

결과 및 토론

CS@PG 나노섬유의 제조 및 특성화

그림 1은 CS@PG 나노섬유 스캐폴드의 전기방사 과정과 항응고 및 세포 적합성의 시험관 내 평가의 개략도를 보여줍니다. 내피 세포의 증식을 촉진하기 위한 조작된 혈관 조직 스캐폴드를 개발하기 위해 다양한 비율의 CS(5, 10 및 15wt%)를 전기방사 공정을 통해 합성 나노섬유를 제조하는 PG(10%, v/v) 용액에 통합했습니다.

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나노섬유 제조 및 시험관 내 평가의 개략도

CS@PG 전기방사 나노섬유의 구조를 관찰하기 위해 SEM을 수행하였다. 그림 2와 같이 PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG 나노섬유의 SEM 이미지는 전기방사 기술에 의해 연속적이고 매끄럽고 나노 크기의 섬유를 포함하는 조밀한 섬유 구조를 나타냅니다. . PG 나노섬유(그림 2a)는 평균 직경이 406.01 ± 146.28 nm인 전기방사 과정을 통해 나노섬유에 불규칙한 비드를 많이 보였다. 10% w/v의 전기방사 용액은 낮은 점도를 나타내어 비드를 포함하는 불균일한 나노섬유를 형성하는 것으로 설명될 수 있다[20]. 고분자 용액에서 CS의 양이 5에서 10%로 증가함에 따라 용액 점도가 증가하여 비드가 없는 균질한 나노섬유를 얻을 수 있었습니다(그림 2b, c). 이에 따라 5%CS@PG 및 10%CS@PG는 각각 382.35 ± 152.99nm 및 300.29 ± 100.85nm의 더 작은 평균 직경을 보여주었습니다. 이 결과는 주로 CS 함량의 증가가 전기방사 용액의 전도도를 향상시켰기 때문입니다[20]. 그러나, 폴리머 농도가 15%까지일 경우, 폴리머 용액의 점도가 너무 높아 전기장에서 늘어나지 않는다. 이전 그룹과 동일한 1mL/h의 유속에서 23kV의 인가 전압에서 바늘 끝 막힘 현상이 나타나고 Taylor 콘을 관찰할 수 없음을 관찰했습니다. 따라서 전기방사 용액의 유속과 인가 전압을 각각 0.9mL/h와 20kV로 조정하였다. 15%CS@PG 나노섬유는 266.92 ± 105.43nm의 평균 직경으로 성공적으로 생산되었습니다.

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CS의 다른 비율에서 CS@PG 전기방사 지지체의 SEM 이미지 및 직경 분포. 아 PG, b 5%CS@PG, c 10%CS@PG, d 15%CS@PG

도 3a에 도시된 바와 같이 CS가 5%CS@PG 및 10%CS@PG 나노섬유에 균일하게 분포되어 있음을 알 수 있다. 그러나 15%CS@PG 섬유에서 CS 응집이 감지되었습니다. 그림 3b와 같이 EDX 원소 분석을 수행하여 준비된 섬유의 황 함량을 검출했습니다. 예상대로, 얻어진 섬유에서 CS의 농도가 증가함에 따라 유황 함량이 증가했습니다.

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TEM 이미지(a ) 및 CS의 다른 비율, 즉 PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG 및 15%CS@PG에서 CS@PG 전기방사 지지체의 EDX 원소 분석

FTIR 스펙트럼 분석

제조된 나노섬유 지지체의 화학적 그룹의 특성 흡수 피크를 결정하기 위해 FTIR 스펙트럼 분석을 수행하였다. PG 및 CS의 FTIR 스펙트럼을 CS@PG 나노섬유 그룹과 비교하기 위해 대조군으로 간주하였다. PG 스펙트럼에서 3300cm⁻¹ 에서 나타나는 강한 흡수 밴드 및 2935cm⁻¹ –NH₂에 기인할 수 있습니다. 및 -OH 신축 진동 및 CH₂ 비대칭 스트레칭. 1652cm⁻¹ 에서 몇 가지 특징적인 흡수 피크가 나타났습니다. (아미드 I) C=O 신축 진동용, 1542cm⁻¹ (아미드 II) N–H 굽힘 진동용, 1441cm⁻¹ CH₂용 스트레칭, 1267cm⁻¹ (아미드 III) C-N 신축 진동 [21, 22]. CS 스펙트럼은 1245cm⁻¹ 에서 특성 흡수 대역을 수행했습니다. , 음으로 대전된 SO₄에서 S=O 신축 진동을 나타냅니다. ²⁻ [23, 24].

그림 4에서 보는 바와 같이 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG 나노섬유의 FTIR 스펙트럼은 PCL, Gt, CS의 특징적인 피크를 보였다. PG 그룹의 스펙트럼과 비교하여 CS@PG 그룹은 1245cm^-1 에서 CS의 특성 밴드를 나타냈습니다. , 그리고 CS 밴드의 강도는 나노섬유에서 CS의 존재에 의해 증가하였다. 이 발견은 CS@PG 전기방사 나노섬유에서 다양한 CS 함량의 존재를 확인시켜주었다.

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CS@PG 전기방사 지지체의 FT-IR 스펙트럼

나노섬유의 다공성, 팽윤율 및 분해성

섬유의 높은 다공성은 재료가 우수한 상호 연결성을 가지고 있음을 나타내며, 이는 산소와 영양소가 기공으로 확산되고 세포 침투를 촉진합니다[25, 26]. 그림 5a는 나노섬유 필름의 다공성을 보여줍니다. 상이한 CS 비율을 함유하는 수득된 나노섬유의 다공성은 대략 80%까지였다. 전기방사된 나노섬유에 의해 얻어진 높은 다공성 구조는 자연적인 ECM을 모방할 수 있어 세포에 유리한 3D 미세환경을 제공한다[27]. 최대 80%의 다공성을 갖는 조직 공학의 스캐폴드는 영양소와 대사 산물의 수송에 유익한 것으로 보고되었습니다.

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아 제조된 나노섬유의 다공성. ㄴ 준비된 나노섬유의 PBS 흡수. ㄷ 최대 14일 동안 PBS 용액에서 분해 후 CS@PG 나노섬유의 남은 질량. d 37°C에서 7일 동안 PBS 용액에서 나노섬유 필름의 SEM 현미경 사진

CS@PG 나노섬유 스캐폴드의 PBS 흡수율을 비교하여 필름의 PBS 흡수에 대한 CS의 효과를 평가하였다. 도 5b에 나타난 바와 같이, PG 지지체의 PBS 흡수율은 586.34 ± 49.44%이고, 5%CS@PG 및 10%CS@PG 나노섬유는 각각 492.86 ± 21.99% 및 510.04 ± 6.5%이다. PBS 흡수율은 15%CS@PG군(665.07 ± 59.81%)이 5% CS@PG 및 10%CS@PG보다 유의하게 높았다. 이 결과는 복합 나노섬유에서 CS의 증가된 함량이 필름의 PBS 흡수 특성을 향상시킬 수 있음을 나타내며, 이는 친수성 그룹(카르복실 및 히드록실)을 함유하는 CS 분자의 높은 친수성 때문일 수 있습니다[28].

시험관 내 분해성 실험의 데이터는 그림 5c에 나타나 있으며, CS 비율이 증가함에 따라 CS@PG 나노섬유 지지체의 분해율도 증가함을 알 수 있었다. 이것은 SO₄의 존재로 인한 것일 수 있습니다. ²⁻ 그룹 [29]. 도 5c에 나타난 바와 같이 대부분의 지지체의 분해율은 7일 이후에 증가하기 시작했고 14일째 분해 결과는 PG, 5% CS@PG, 10의 경우 8.45%, 11.39%, 13.97%, 15.10%였다. 각각 %CS@PG 및 15%CS@PG 나노섬유 스캐폴드. 나노섬유 스캐폴드의 SEM 이미지(그림 5d)는 PBS 용액에 7일 동안 담근 후 약간의 팽창을 보였습니다. SEM 이미지는 개발된 나노섬유가 최대 7일 동안 심각한 분해 및 팽창을 피할 수 있을 정도로 안정적이어서 생체 내 또는 시험관 내 세포 반응에 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.

혈액 적합성 평가

APTT는 고유 응고 메커니즘을 통해 혈액 또는 혈장을 검출하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법입니다. APTT는 혈액 응고의 지연 가능성에 대한 전기방사 나노섬유의 영향을 측정하기 위해 테스트되었습니다. APTT에 의해 검출된 응고 시간은 대조군 PG와 5%CS@PG 및 10%CS@PG 나노섬유 사이의 응고 시간의 통계적으로 유의한 감소를 나타냈습니다. 대조적으로, 연장된 APTT는 15% CS@PG 나노섬유를 PPP와 함께 배양한 후에 발견되어 개선된 항응고 특성을 나타냅니다. 도 6a에 나타난 바와 같이 혈액 응고의 영향은 나노섬유 샘플의 직경에 의존적이었다. 가장 낮은 APTT 응고 시간은 5%CS@PG nanofibrous와 상호작용 후 발견되었으며, 가장 높은 APTT는 electrospun 10%CS@PG와 상호작용하여 용혈 정도와 유사하게 나타났습니다. CS ratio가 증가할수록 응고시간이 길어졌다.

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아 CS@PG 나노섬유의 APTT. ㄴ 샘플의 용혈 속도. ㄷ 나노섬유에 대한 혈소판 대사 활성. n =3, *p <0.05

ASTM F756-00(2000)에 따르면 생체 재료의 용혈률은 <5%가 되어야 합니다[30]. 이 연구에서 용혈 정도는 적혈구에서 방출된 헤모글로빈의 비색 분석을 사용하여 수행되었으며 다음 방정식으로 계산할 수 있습니다. 용혈(%) =(OD_sam − OD_음수 )/(OD_위치 − OD_음수 ) × 100%. 도 6b에 나타난 바와 같이, 모든 샘플은 비용혈성이었고 현저한 용혈을 일으키지 않았다(용혈율은 5% 미만).

혈소판 생존율 실험의 데이터는 그림 6c에 나와 있습니다. 2시간 후 부착된 혈소판의 대사 활성은 PRP와 나노섬유, 특히 PG 나노섬유의 상호작용 후 도달한 최대값으로 가장 높았습니다. 흥미롭게도 24시간 후 모든 샘플에서 혈소판 활성이 감소했습니다. 이 결과는 나노섬유의 구조에 의한 혈소판 활성화가 빠르기 때문에 매끄러운 표면과 접촉 시 안정적이고 장기간 혈소판 활성화에 비해 성장 인자의 빠른 소비 및 방출이 발생할 수 있습니다[31]. 혈소판의 정상적인 수명은 약 8~10일이며 혈소판이 활성화되기 시작하면 수명이 단축됩니다.

살아있는/죽은 세포 염색

나노섬유의 세포적합성에 대한 CS의 영향은 6일 동안 나노섬유에 대한 HAEC 평가의 세포 생존력, 접착 형태 및 증식에 의해 조사되었습니다. Calcein-AM/PI 이중염색 키트, DAPI 염색, CCK-8 assay kit를 이용하여 부착된 세포를 평가하였다.

그림 7a–e는 다른 나노섬유에 부착된 살아있는 HAEC와 죽은 HAEC의 형광 이미지를 보여줍니다. Calcein-AM(녹색)과 PI(빨간색)는 각각 살아있는 세포와 죽은 세포를 염색하는 데 사용되었습니다. 살아있는 세포가 CS@PG 복합 나노섬유에 부착된 것을 관찰할 수 있었으며, 상이한 비율의 CS를 함유하는 나노섬유가 HAEC에 대한 독성이 없음을 나타내었다. 나노섬유의 살아있는/죽은 세포 수에 대한 추가 정량적 분석은 Image J에 의해 조사되었습니다(그림 7f). PG 나노섬유의 살아있는 세포와 죽은 세포의 비율과 비교하여, 다른 CS 비율을 포함하는 다른 3개의 PG 그룹, 특히 10%CS@PG 및 15%CS@PG 그룹이 더 큰 비율의 살아있는 세포를 나타내었고 백분율이 증가했습니다. CS 농도의 증가와 함께. 이 결과는 나노섬유에 CS의 존재가 세포 생존력을 유지하는 데 유리하다는 것을 보여주었다[32].

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CS@PG 스캐폴드에서 HAEC의 세포 생존력. 아 조직 배양 플레이트(TCP), b PG, c 5%CS@PG, d 10%CS@PG, e 15%CS@PG, f 다양한 나노섬유 스캐폴드의 살아있는/죽은 세포 수의 백분율, n =3

나노섬유의 세포 접착 거동

생체적합성이 좋은 나노섬유 스캐폴드는 혈관 생성을 위한 기본 요건으로 간주됩니다. 생분해성이 좋은 PCL과 생체적합성이 우수한 천연 Gt는 하이드로겔, 전기방사 나노섬유, 3차원 지지체 등 다양한 구조의 조직 공학에 널리 사용되었습니다[21, 33, 34]. 복합 나노섬유에 대한 HAEC의 형태와 24시간에서의 세포-물질 상호작용을 형광현미경으로 관찰하였다. 세포 밀도 10%CS@PG 및 15%CS@PG는 PG 및 5%CS@PG보다 통계적으로 유의하였고, 더 높은 수준에서 CS의 첨가가 세포 접착을 촉진함을 나타내었다. 도 8c에 도시된 바와 같이, 5%CS@PG 및 15%CS@PG의 단일 셀 면적은 다른 나노섬유 그룹보다 컸다. 그러나 10%CS@PG의 세포 신장은 PG, 5%CS@PG 및 15%CS@PG보다 유의하게 높았습니다(그림 8d). 이 결과는 10% 농도의 CS를 추가하면 HAEC의 확산을 촉진할 수 있다고 설명할 수 있습니다. HAEC가 복합 나노섬유, 특히 10%CS@PG 및 15%CS@PG에서 잘 접착, 확산 및 성장할 수 있음이 발견되었습니다. 따라서 이 두 나노섬유 재료는 임상 적용에서 안전하고 유망한 후보 혈관 재료로 간주될 수 있습니다.

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아 CS@PG 스캐폴드에서 HAEC의 세포 접착 형태(DAPI:세포 핵, 로다민-팔로이딘:세포골격). ㄴ 세포 밀도. ㄷ 단일 셀 영역, d 다양한 나노섬유 그룹의 세포 신장

세포 증식

CS@PG 나노섬유의 세포 성장과 생존력은 형광 현미경과 CCK-8 테스트를 통해 시험관 내에서 조사되었습니다(그림 9a-c). The electrospun PG scaffold was selected as the positive control. The results of the CCK-8 assay for different nanofibrous films are displayed in Fig. 9c. In 2, 4, 6 days of cells culturing, the cell number increased with the culture time for all groups. On day 6, the OD value of 10%CS@PG nanofibers was significantly higher than that of the PG scaffold. The cell proliferation comparison of 5%CS@PG, 10%CS@PG, and 15%CS@PG indicated that the cell proliferation rate was increased as the CS presence in composite nanofibers in a certain range. However, the cell proliferation capability was also influenced by the surface morphology of nanofibrous materials. Since the 15%CS@PG nanofiber exhibited strong viscosity due to the higher CS ratio in electrospinning polymeric solution, cell proliferation might be affected.