전기방사 고분자 나노섬유는 혈관 조직공학에서 많은 주목을 받아왔습니다. 그러나 느린 내피화와 혈전증이라는 결함을 가진 기존 나노섬유 소재는 혈관 조직 복구 및 재생을 촉진하는 데 효과적이지 않습니다. 이에 생체모방 젤라틴(Gt)/폴리카프로락톤(PCL) 복합 나노섬유에 다양한 양의 콘드로이틴 황산(CS)을 전기방사 기술로 도입하여 항혈전성과 내피 세포 친화성에 미치는 영향을 조사했습니다. PG 나노섬유 내 다양한 CS 농도는 섬유 형태와 직경에 영향을 미칩니다. CS/Gt/PCL 나노섬유는 적절한 기공률(~80%)과 PBS 용액 흡수율(최대 650%)을 가집니다. Gt/PCL 나노섬유에 CS 도입은 항응고 특성을 크게 향상시키고 응고 시간을 연장하며 세포 반응을 촉진합니다. 특히 10%CS/Gt/PCL 나노섬유는 우수한 세포 부착, 신장, 증식을 보입니다. 따라서 일정량의 CS를 함유한 Gt/PCL 나노섬유는 혈관 복구 및 재생을 위한 유망한 조직공학 스캐폴드 후보가 될 수 있습니다.
나노섬유 소재의 개발은 세포외 기질(ECM)과 유사한 초미세 섬유 구조, 우수한 기계적 특성, 큰 비표면적, 상호 연결된 높은 기공률 등 독특한 (생리)물리화학적 특성으로 인해 조직 복구 및 재생을 위한 생체모방 스캐폴드로서 많은 주목을 받아왔습니다[1, 2]. 나노섬유 구조가 접촉 유도를 통해 세포 부착, 형태(예: 퍼짐, 정렬, 신장 등), 배열, 이동, 증식, 표현형, 분화 등 세포 반응을 매개하는 데 핵심적임이 입증되었습니다[3,4,5]. 나노스키빙, 템플릿 합성, 상분리 등 다양한 나노제작 전략이 나노섬유 소재 제작에 이용 가능한 기술을 제공했지만, 전기방사는 금속, 세라믹, 고분자, 복합 소재 등 다양한 소재로부터 산업적 규모로 나노섬유를 제작하는 가장 효과적인 방법 중 하나입니다[6,7,8].
(생리)물리적 신호 외에도 적절한 생체소재 선택은 세포 활성뿐만 아니라 조직 복구 및 재생에 큰 영향을 미칠 수 있습니다[9]. 생체적합성, 생체흡수성, 기계적 특성, 생물학적 기능과 같은 주요 특징들을 고려해야 합니다[9, 10]. 천연/천연 및 합성/합성 복합체에 비해 천연 고분자와 합성 고분자로 구성된 복합 나노섬유 소재는 천연 고분자의 우수한 생물학적 특성과 합성 고분자의 기계적 강도를 결합할 수 있어 더 많은 주목을 받아왔습니다[9]. 그중에서 젤라틴(Gt)/폴리카프로락톤(PCL) 조합은 가장 대표적으로 연구된 천연-합성 하이브리드 시스템 중 하나로 혈관 조직공학에서 널리 사용됩니다[11,12,13,14]. 그러나 Gt/PCL 복합 나노섬유는 여전히 느린 내피화, 혈전증 등의 한계가 있습니다. 최근 콘드로이틴 황산(CS)은 글리코사미노글리칸과 갈락토사민을 함유한 황산화 다당류로, 내피 세포(EC)에 대한 높은 부착력, 단백질 및 혈소판과의 약한 상호작용, 음전하 혈액 성분에 대한 정전기적 반발력이 있음이 입증되었습니다[15,16,17]. 또한 CS는 세포 세포자살을 억제하고 혈관 상처 치유를 촉진할 수 있습니다[18, 19]. 따라서 CS를 도입한 Gt/PCL(PG) 전기방사 나노섬유는 혈관 복구 및 재생을 위한 생체 지시성 조직공학 스캐폴드로서 훌륭한 후보가 될 것입니다.
본 연구에서는 원스텝 전기방사로 다양한 CS 비율을 함유한 생체모방 PG 복합 나노섬유를 개발했습니다. CS/PG 복합 나노섬유의 형태, 화학적 특성, 기공률, 분해도를 다양한 특성 분석 기술로 검출했습니다. PG/CS 복합 나노섬유의 항응고 특성을 평가했습니다. 또한 다양한 CS 비율의 복합 나노섬유에 인간 대동맥 내피 세포(HAECs)를 파종하여 세포 반응에 미치는 영향을 조사했습니다.
CS(소 기관, A형, 순도: 95%)는 상하이 맥클린 생화학 기술 유한공사(중국)에서 공급받았습니다. PCL은 알라딘 생화학 폴리트론 테크놀로지스(중국)에서 얻었습니다. Gt(소 피부, B형)는 시그마-알드리치 생화학 기술 유한공사(중국)에서 얻었습니다. 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT) 키트는 레이겐 생명공학 유한공사(중국)에서 구입했습니다. 초산(순도: 99.5%)은 신팜 화학 시약 유한공사(중국)에서 구입했습니다. 인간 대동맥 내피 세포(HAECs)는 청도대학 부속병원(중국)에서 얻었습니다. 배양 배지 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12), 태아 소 혈청(FBS), 0.25% 트립신-EDTA는 바이올로지컬 인더스트리즈(이스라엘)에서 구입했습니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 시약은 시그마-알드리치(중국)에서 구입했습니다. 모든 실험에 사용된 물은 탈염수였습니다.
PCL(10% w/v)을 실온에서 4시간 동안 기계적 교반 하에 초산에 용해했습니다. Gt(10% w/v)을 90% 초산에 넣고 2시간 동안 지속적으로 교반하며 용해했습니다. CS를 다양한 농도로 Gt 용액에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하여 총 고분자 농도 대비 5, 10, 15wt% CS를 함유한 균질 용액을 얻었습니다. 그런 다음 위 두 용액을 50/50(w/w) 중량비로 2시간 동안 교반하며 혼합하여 PG 용액을 제조했으며, 각각 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG로 명명했습니다.
준비된 균질 용액을 1mL 주사기와 21G 니들, 알루미늄 호일로 덮인 수집기를 장착한 전기방사 공정에 적용했습니다. 본 연구에서 수집판과 니들 팁 사이의 거리는 약 18cm로 고정했고, 전압은 23kV로 설정했으며, 고분자 용액은 1mL/h 속도로 펌핑했습니다. 모든 용액은 실온에서 습도(<40%)를 엄격히 제어하며 전기방사 장비(Technology, Tk602TH, 중국)로 전기방사했습니다. 추가 실험 전 샘플을 진공 건조 오븐에서 최소 72시간 동안 두어 잔류 용매를 제거했습니다.
CS@PG 나노섬유 스캐폴드의 형태를 SEM(VEGAS, TESCAN, 체코)으로 가속 전압 20kV, 실온에서 조사했습니다. 나노섬유 직경(n=100)은 SEM 이미지에서 이미지 분석 소프트웨어(Image J)를 사용하여 추가 측정했습니다.
TEM 관찰과 에너지 분산형 X선 분광법(EDS) 분석은 JEOL JEM-2100 plus(일본)를 사용하여 수행했습니다.
FTIR은 니코렛 iN10 FTIR 분광계(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 수행하여 CS, PG 나노섬유, CS@PG 나노섬유의 특징적인 작용기를 평가했습니다. 샘플 스펙트럼은 4000-500cm⁻¹ 파장 범위에서 2cm⁻¹ 해상도로 투과 모드로 기록했습니다.
나노섬유의 기공률은 액체 치환법으로 수행했습니다. 먼저 나노섬유의 건조 중량을 W₁로 측정했습니다. 그런 다음 네 그룹의 나노섬유를 25°C에서 2시간 동안 에탄올에 담그고 W₂로 측정했습니다. 샘플 표면의 에탄올을 여과지로 제거하고 무게를 W₃로 기록했습니다. 나노섬유의 기공률은 다음 공식으로 계산했습니다:
기공률(%) = (W₃ - W₁) / (W₃ - W₂) × 100
PBS 용액 흡수 테스트를 위해 얻어진 나노섬유를 건조 상태에서 무게를 측정하여 Wd로 기록했습니다. 그런 다음 나노섬유를 25°C에서 24시간 동안 PBS에 담그고 샘플 표면의 과도한 액체를 제거한 후 습윤 상태 무게를 Ww로 기록했습니다. 팽윤 비율은 다음 방정식으로 측정했습니다:
PBS 흡수율(%) = (Ww - Wd) / Wd × 100
위 실험의 모든 값은 평균±SD(n=3)로 표현했습니다.
얻어진 나노섬유의 리소자임에 대한 저항성을 결정하기 위해 예정된 시간(1, 4, 7, 10, 14일)에 샘플의 분해도를 측정했습니다. 나노섬유의 초기 무게를 Wᵢ로 기록했습니다. 그런 다음 샘플을 리소자임(500µg/mL)을 함유한 PBS 용액(pH 7.4)에 담그고 37°C에서 체외 배양했습니다. 미리 정해진 분해 간격마다 각 그룹의 샘플을 꺼내 탈염수로 세척하고 동결건조하여 최종 무게(Wf)를 얻었습니다. 리소자임 용액은 주 3회 교체했습니다. 나노섬유 스캐폴드의 잔존 질량(%)은 다음 공식으로 추정했습니다:
잔존 질량(%) = (1 - (Wᵢ - Wf) / Wᵢ) × 100%
7일 후 샘플의 분해 거동을 평가하기 위해 SEM으로 나노섬유 형태를 관찰했습니다.
활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)은 전기방사 나노섬유가 커버슬립에 배양된 후 혈소판 결핍 혈장(PPP)의 응고 시간을 테스트하여 내인성 및 공통 응고 경로의 활성을 평가하는 데 사용되었습니다. 이를 위해 항응고 혈액(약 10mL)을 채취하고 3000rpm에서 20분간 원심분리하여 혈소판 결핍 혈장(PPP)을 얻었습니다. 각 샘플을 37°C에서 10분간 200µL PPP와 배양하고 제조사 지침에 따라 APTT 키트로 분석했습니다(n=3).
용혈률은 전기방사 나노섬유에 노출된 희석 전혈에서 적혈구로부터 용액상으로 방출된 헤모글로빈 농도를 측정하여 평가했습니다. 커버슬립 위의 샘플을 개별적으로 24웰 플레이트에 넣고 37°C에서 30분간 2mL PBS에 담갔습니다. 음성 대조군은 2mL PBS만 포함했고, 양성 대조군은 적혈구의 최대 용혈을 유도하기 위해 2mL 탈염수로 구성했습니다(n=3 각 테스트 그룹). 그런 다음 앞서 언급한 항응고 신선 전혈 40µL를 각 웰에 첨가하고 37°C에서 60분간 배양한 후 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고 100×g에서 5분간 원심분리했습니다. 상층액을 마이크로플레이트 리더(SynergyH1/H1M, BioTek, 중국)로 570nm에서 흡광도를 측정했습니다.
혈전 생성 가능성은 전기방사 샘플을 혈소판 풍부 혈장(PRP)과 배양한 후 체외에서 평가했습니다. PRP는 원심분리(1500rpm, 20분)로 제조하고 상층 혈장의 절반을 버렸습니다. 그런 다음 커버슬립 위의 나노섬유를 37°C에서 2시간 동안 100µL PRP에 배양하고 PBS로 3회 부드럽게 세척하여 후속 실험에 사용했습니다. PRP 배양 후 혈소판 활성을 평가하기 위해 전기방사 나노섬유를 10% FBS가 첨가된 DMEM에 2시간 및 24시간 동안 보관한 후 CCK-8 분석 키트로 나노섬유 상의 혈소판 생존율을 측정했습니다. CCK-8(20µL)을 24웰 플레이트의 200µL 무혈청 DMEM 배지에 첨가하고 1시간 배양했습니다. 마지막으로 마이크로플레이트 리더로 450nm 파장에서 현탁액을 측정했습니다.
인간 대동맥 내피 세포(HAECs)를 10% FBS(v/v), 1% 스트렙토마이신/페니실린(v/v)이 첨가된 DMEM에서 37°C, 5% CO₂ 분위기로 배양했습니다. 배양 배지는 주 3회 교체했습니다. 세포는 일반적으로 0.05% 트립신/EDTA로 3분간 분리하고 1000rpm에서 원심분리한 후 신선한 배지에 현탁하여 세포 계대나 세포 파종을 수행했습니다.
세포 파종 전 24웰 플레이트의 모든 나노섬유 소재를 자외선 조사로 1시간 멸균하고 75% 에탄올(v/v, %)에 1시간 담갔습니다. 그런 다음 나노섬유를 PBS 용액으로 4회 세척하고 CO₂ 인큐베이터에서 12시간 동안 DMEM에 담갔습니다. 세포를 나노섬유에 웰당 1×10⁴ cells 밀도로 파종하고 배지를 매일 교체했습니다. 24시간 공동 배양 후 세포를 PBS 용액으로 3회 세척한 후 Calcein-AM/PI 이중 염색 키트(YEASEN 생화학 기술 유한공사, 중국 상하이)로 염색했습니다. PI는 죽은 세포를, Calcein-AM은 살아있는 세포를 염색했습니다.
나노섬유 위 세포 부착을 관찰하기 위해 24시간 공동 배양 후 형광 현미경(Nikon A1 MP, 일본)으로 세포 형태를 관찰했습니다. 먼저 세포를 실온에서 4% 파라포름알데히드로 30분간 고정했습니다. 그런 다음 0.5% 트리톤 X-100 용액으로 5분간 세포막을 투과시켰습니다. 마지막으로 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 세포핵을 염색하고 로다민-팔로이딘으로 F-액틴을 염색했습니다. Image J로 정량적 분석(세포 밀도, 단일 세포 면적, 세포 신장)을 추가로 수행했습니다.
복합 나노섬유 위 세포 증식 활성은 CCK-8 분석 키트로 수행했습니다. HAECs를 나노섬유에 웰당 8×10³ cells 밀도로 파종했습니다. 배양 배지는 이틀마다 교체했습니다. 1, 4, 7일 공동 배양 후 세포를 PBS 용액으로 세척하여 비부착 세포를 제거했습니다. 그런 다음 20µL CCK-8과 완전 배지를 1:10 부피비로 24웰 플레이트에 첨가하고 인큐베이터에서 1시간 배양했습니다. 흡광도는 ELISA 리더로 450nm에서 측정했습니다.
DAPI와 로다민-팔로이딘 염색을 형광 현미경으로 수행하여 다양한 나노섬유와 2일 및 6일 공동 배양 후 세포 수 변화를 직접 관찰했습니다.
실험의 모든 샘플을 3중으로 처리했습니다. 모든 데이터는 평균±표준편차(SD)로 표현했습니다. 샘플의 통계적 분석은 일원 분산 분석(ANOVA)으로 수행하여 p<0.05에서 유의성 차이를 비교했습니다.
그림 1은 CS@PG 나노섬유 스캐폴드 전기방사 공정의 개략도와 항응고 및 세포적합성 체외 평가를 보여줍니다. 내피 세포 증식을 촉진하기 위한 공학적 혈관 조직 스캐폴드를 개발하기 위해 PG(10%, v/v) 용액에 다양한 비율의 CS(5, 10, 15wt%)를 도입하여 전기방사 공정으로 복합 나노섬유를 제작했습니다.
CS@PG 전기방사 나노섬유의 구조를 관찰하기 위해 SEM을 수행했습니다. 그림 2에 나타난 바와 같이 PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG 나노섬유의 SEM 이미지는 전기방사 기술로 연속적이고 매끄러운 나노스케일 섬유를 포함하는 치밀한 섬유 구조를 보여줍니다. PG 나노섬유(그림 2a)는 전기방사 공정에서 나노섬유에 많은 불규칙한 비드를 보이며 평균 직경 406.01±146.28nm를 가집니다. 이는 10% w/v 전기방사 용액의 낮은 점도로 인해 비드를 포함하는 불균질 나노섬유가 형성되었기 때문일 수 있습니다[20]. 폴리머 용액 내 CS 양을 5~10wt%로 증가시키면 용액 점도 증가로 인해 비드 없는 균질 나노섬유를 얻을 수 있습니다(그림 2b, c). 이에 따라 5%CS@PG와 10%CS@PG는 각각 382.35±152.99nm와 300.29±100.85nm의 더 작은 평균 직경을 보였습니다. 이 결과는 주로 CS 함량 증가가 전기방사 용액의 전도도를 향상시켰기 때문입니다[20]. 그러나 고분자 농도가 15%까지 올라가면 폴리머 용액 점도가 너무 높아 전기장에서 늘어나기 어렵습니다. 이전 그룹과 동일한 1mL/h 유속에서 23kV 전압 하에서 니들 팁 막힘 현상이 나타나 테일러 콘을 관찰할 수 없었습니다. 따라서 전기방사 용액 유속과 가전압을 각각 0.9mL/h와 20kV로 조정했습니다. 15%CS@PG 나노섬유는 평균 직경 266.92±105.43nm로 성공적으로 제작되었습니다.
그림 3a에서 볼 수 있듯이 CS는 5%CS@PG와 10%CS@PG 나노섬유에 균일하게 분포되어 있었습니다. 그러나 15%CS@PG 섬유에서는 CS 응집이 검출되었습니다. 그림 3b에서 나타낸 바와 같이 제조된 섬유의 황 함량을 검출하기 위해 EDX 원소 분석을 수행했습니다. 예상대로 CS 농도 증가에 따라 얻어진 섬유의 황 함량이 증가했습니다.
FTIR 스펙트럼 분석을 수행하여 제조된 나노섬유 스캐폴드의 화학적 작용기 특징적 흡수 피크를 확인했습니다. PG와 CS의 FTIR 스펙트럼을 대조군으로 하여 CS@PG 나노섬유 그룹과 비교했습니다. PG 스펙트럼에서 3300cm⁻¹과 2935cm⁻¹에 나타난 강한 흡수 밴드는 각각 -NH₂와 -OH 신축 진동, CH₂ 비대칭 신축에 기인할 수 있습니다. 여러 특징적 흡수 피크가 1652cm⁻¹(아미드 I, C=O 신축 진동), 1542cm⁻¹(아미드 II, N-H 굽힘 진동), 1441cm⁻¹(CH₂ 신축), 1267cm⁻¹(아미드 III, C-N 신축 진동)에서 나타났습니다[21, 22]. CS 스펙트럼은 1245cm⁻¹에서 특징적 흡수 밴드를 보였으며, 이는 음전하를 띤 SO₄²⁻의 S=O 신축 진동을 나타냅니다[23, 24].
그림 4에 나타난 바와 같이 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG 나노섬유의 FTIR 스펙트럼은 PCL, Gt, CS의 특징적 피크를 함께 보였습니다. PG 그룹 스펙트럼과 비교하여 CS@PG 그룹은 1245cm⁻¹에서 CS의 특징적 밴드를 보였고, 나노섬유 내 CS 존재로 인해 CS 밴드 강도가 증가했습니다. 이 결과는 다양한 함량의 CS가 CS@PG 전기방사 나노섬유에 존재함을 확인했습니다.
높은 기공률은 소재가 우수한 상호 연결성을 가짐을 나타내며, 이는 산소와 영양분이 기공으로 확산되고 세포 침투를 촉진하는 데 도움이 됩니다[25, 26]. 그림 5a는 나노섬유 막의 기공률을 보여줍니다. 다양한 CS 비율을 함유한 얻어진 나노섬유의 기공률은 약 80%까지였습니다. 전기방사 나노섬유로 얻은 높은 다공성 구조는 천연 ECM을 모방하여 세포에 유리한 3D 미세환경을 제공할 수 있습니다[27]. 기공률이 80%까지인 스캐폴드가 조직공학에서 영양소와 대사산물 수송에 유익함이 보고되었습니다.
CS@PG 나노섬유 스캐폴드의 PBS 흡수율을 비교하여 CS가 막의 PBS 흡수 특성에 미치는 영향을 평가했습니다. 그림 5b에 나타난 바와 같이 PG 스캐폴드의 PBS 흡수율은 586.34±49.44%였고, 5%CS@PG와 10%CS@PG 나노섬유는 각각 492.86±21.99%, 510.04±69.55%였습니다. 15%CS@PG 그룹의 PBS 흡수율(665.07±59.81%)은 5%CS@PG와 10%CS@PG보다 유의하게 높았습니다. 이 결과는 복합 나노섬유 내 CS 함량 증가가 막의 PBS 흡수 특성을 개선할 수 있음을 나타내며, 이는 CS 분자에 친수기(카복실기 및 하이드록실기)가 포함되어 높은 친수성 때문일 수 있습니다[28].
체외 분해 실험 데이터는 그림 5c에 나타나며, CS 비율 증가에 따라 CS@PG 나노섬유 스캐폴드의 분해 속도도 증가함을 알 수 있습니다. 이는 SO₄²⁻ 기의 존재 때문일 수 있습니다[29]. 그림 5c에 나타난 바와 같이 대부분의 스캐폴드 분해 속도는 7일 후부터 증가하기 시작했으며, 14일째 분해 결과는 PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG 나노섬유 스캐폴드 각각 8.45%, 11.39%, 13.97%, 15.10%였습니다. 나노섬유 스캐폴드의 SEM 이미지(그림 5d)는 PBS 용액에 7일간 담근 후 약간의 팽윤을 보였습니다. SEM 이미지는 개발된 나노섬유가 7일까지 심각한 분해와 팽윤을 피할 만큼 충분히 안정적임을 나타내며, 이는 체내 또는 체외에서 세포 반응에 영향을 미칩니다.
APTT는 내인성 응고 메커니즘을 통해 혈액 또는 혈장을 검출하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 전기방사 나노섬유가 혈액 응고 지연 가능성에 미치는 영향을 측정하기 위해 APTT를 테스트했습니다. 대조군 PG와 5%CS@PG, 10%CS@PG 나노섬유 사이의 응고 시간은 통계적으로 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다. 대조적으로 15%CS@PG 나노섬유를 PPP와 배양 후 APTT가 연장되어 항응고 특성이 개선됨을 나타냈습니다. 그림 6a에 제시된 바와 같이 혈액 응고에 미치는 영향은 나노섬유 샘플의 직경에 의존했습니다. 5%CS@PG 나노섬유와 상호작용 후 가장 낮은 APTT 응고 시간이 나타났고, 전기방사 10%CS@PG와 가장 높은 APTT가 유사하게 나타났으며, 용혈 정도와도 유사했습니다. 응고 시간은 CS 비율 증가에 따라 연장되었습니다.
ASTM F756-00(2000)에 따르면 생체소재의 용혈률은 <5%여야 합니다[30]. 본 연구에서 용혈 정도는 적혈구로부터 방출된 헤모글로빈의 비색 분석으로 수행되었으며 다음 방정식으로 계산할 수 있습니다: 용혈(%) = (ODsam - ODneg) / (ODpos - ODneg) × 100%. 그림 6b에 나타난 바와 같이 모든 샘플은 비용혈성이었으며 현저한 용혈을 초래하지 않았습니다(용혈률 5% 미만).
혈소판 생존율 실험 데이터는 그림 6c에 나와 있습니다. 2시간 후 부착된 혈소판의 대사 활성은 나노섬유 구조에 의한 빠른 혈소판 활성화로 인해 최대값에 도달했으며, 특히 PG 나노섬유에서 그러했습니다. 흥미롭게도 24시간 후 모든 샘플에서 혈소판 활성이 감소했습니다. 이 결과는 나노섬유 구조에 의한 빠른 혈소판 활성화로 인해 성장 인자의 빠른 소비와 방출이 매끄러운 표면 접촉 시 안정적이고 장기적인 혈소판 활성화에 비해 발생하기 때문일 수 있습니다[31]. 혈소판의 정상 수명은 약 8-10일이며, 혈소판이 활성화되기 시작하면 단축됩니다.
CS가 나노섬유의 세포적합성에 미치는 영향을 6일간 HAECs의 세포 생존율, 부착 형태, 증식 평가로 탐구했습니다. 부착된 세포는 Calcein-AM/PI 이중 염색 키트, DAPI 염색, CCK-8 분석 키트로 평가했습니다.
그림 7a-e는 다양한 나노섬유에 부착된 살아있는/죽은 HAECs의 형광 이미지를 보여줍니다. Calcein-AM(녹색)과 PI(빨간색)로 살아있는 세포와 죽은 세포를 각각 염색했습니다. CS@PG 복합 나노섬유에 살아있는 세포가 부착된 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 다양한 CS 비율을 함유한 나노섬유가 HAECs에 독성이 없음을 나타냅니다. Image J로 나노섬유 위 살아있는/죽은 세포 수의 정량적 분석을 추가로 수행했습니다(그림 7f). PG 나노섬유 위 살아있는/죽은 세포 비율과 비교하여 다른 세 그룹의 PG(다양한 CS 비율 함유), 특히 10%CS@PG와 15%CS@PG 그룹에서 살아있는 세포 비율이 더 높았으며, CS 농도 증가에 따라 비율이 증가했습니다. 이 결과는 나노섬유 내 CS 존재가 세포 생존율 유지에 유리함을 보여줍니다[32].
우수한 생체적합성을 가진 나노섬유 스캐폴드는 혈관 생성을 위한 1차적 요구사항으로 간주됩니다. 우수한 생분해성을 가진 PCL과 우수한 생체적합성을 가진 천연 Gt는 하이드로겔, 전기방사 나노섬유, 3차원 스캐폴드 등 다양한 구조로 조직공학에 널리 사용되어 왔습니다[21, 33, 34]. 복합 나노섬유 위 HAECs 형태와 24시간 세포-소재 상호작용을 형광 현미경으로 관찰했습니다. 10%CS@PG와 15%CS@PG의 세포 밀도가 PG와 5%CS@PG보다 통계적으로 유의하게 높았으며, 이는 더 높은 수준의 CS 첨가가 세포 부착을 촉진함을 나타냅니다. 그림 8c에 나타난 바와 같이 5%CS@PG와 15%CS@PG의 단일 세포 면적이 다른 나노섬유 그룹보다 컸습니다. 그러나 10%CS@PG의 세포 신장은 PG, 5%CS@PG, 15%CS@PG보다 유의하게 높았습니다(그림 8d). 이 결과는 10% 농도에서 CS 첨가가 HAECs 퍼짐을 촉진할 수 있음을 설명할 수 있습니다. HAECs가 복합 나노섬유, 특히 10%CS@PG와 15%CS@PG에서 잘 부착, 퍼짐, 성장할 수 있음을 발견했습니다. 따라서 이 두 나노섬유 소재는 임상 응용에서 안전하고 유망한 혈관 소재 후보로 고려될 수 있습니다.
CS@PG 나노섬유 위 세포 성장과 생존율을 형광 현미경과 CCK-8 테스트로 체외에서 조사했습니다(그림 9a-c). 전기방사 PG 스캐폴드를 양성 대조군으로 선택했습니다. 다양한 나노섬유 막의 CCK-8 분석 결과는 그림 9c에 표시되어 있습니다. 2, 4, 6일 세포 배양에서 모든 그룹의 세포 수는 배양 시간에 따라 증가했습니다. 6일째 10%CS@PG 나노섬유의 OD 값이 PG 스캐폴드보다 유의하게 높았습니다. 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG의 세포 증식 비교 결과, 복합 나노섬유 내 CS 존재가 일정 범위에서 세포 증식 속도를 증가시킴을 나타냈습니다. 그러나 세포 증식 능력은 나노섬유 소재의 표면 형태에도 영향을 받습니다. 15%CS@PG 나노섬유는 전기방사 폴리머 용액 내 높은 CS 비율로 인해 강한 점성을 나타내어 세포 증식에 영향을 미쳤을 수 있습니다.
요약하자면, 생체모방 CS@PG 복합 나노섬유가 전기방사 기술로 성공적으로 제작되었습니다. PG 나노섬유 내 다양한 CS 농도로 섬유 형태와 직경이 변화했습니다. CS@PG 나노섬유는 적절한 기공률(~80%)과 PBS 용액 흡수율(최대 650%)을 가졌습니다. PG 나노섬유에 CS 도입은 항응고 특성을 크게 개선하고 응고 시간을 연장하며 세포 반응을 향상시켰습니다. 특히 10%CS@PG 나노섬유는 우수한 세포 부착, 신장, 증식을 보였습니다. 따라서 일정량의 CS를 도입한 PG 복합 나노섬유는 항혈전성을 억제하고 내피 세포 반응을 향상시켜 혈관 복구 및 재생을 위한 유망한 조직공학 스캐폴드로 개발될 수 있습니다.
본 연구 동안 생성되거나 분석된 모든 데이터는 본 논문 내에 포함되어 있습니다.
나노물질
요약 탄소 점(CDs)은 활성 표면 덕분에 항균제로 널리 사용되어 왔으나, 일부 CDs는 불안정성이라는 단점을 가지고 있습니다. 따라서 항균 활성 등의 관련 응용이 장기 사용에 신뢰성을 담보하기 어려웠습니다. 본 연구에서는 수열 합성 공정을 통해 청색 형광을 나타내는 CDs를 합성한 후, 폴리에틸렌이민(PEI)을 이용해 CDs를 CDs 기반 프레임워크(CDFs)로 조립했습니다. CDFs는 형광이 소광되었으나, 주사전자현미경(SEM)과 제타 전위 분석을 통해 더 안정적인 특성을 보임이 확인되었습니다. CDs와 CDFs 모두 그람음성균
가혹 환경·무오염 생산 공정 모두 대응하는 6축 소형 로봇 ABB가 6축 IRB 1300 산업용 로봇에 새로운 보호 요소 추가해 까다로운 산업 애플리케이션과 오염 없는 생산 공정 모두 사용 가능하게 했습니다. 회사 측에 따르면 전자 조립, 자동차, 금속 가공 등 다양한 산업에서 생산성 향상, 제품 품질 개선, 사이클 타임 단축 새 기회 열림. 3가지 보호 버전으로 환경 적응성 확대 2020년 최초 출시된 IRB 1300이 이제 IP67, Foundry Plus 2, 클린룸 ISO 4 버전으로 제공. 고액체·분진 환경 등 가혹 조
