폴리머솜을 사용한 신생아 돼지 섬과 같은 세포 클러스터의 나노 캡슐화 최적화

소개

제1형 당뇨병의 치료에서 동종섬 이식의 사용은 적절한 기증자가 없기 때문에 제한적입니다. 대신, 이종 섬 이식에서 동물 섬의 사용이 점진적으로 증가하고 있으며 돼지가 최적의 기증자 종으로 부상하고 있습니다[1]. 이식 시 돼지를 기증자로 사용하는 경우, 돼지의 나이에 따라 별도의 섬을 사용할 수 있습니다. 종종 신생아 돼지 섬 유사 세포 클러스터(NPCC)는 경제성과 분리 용이성으로 인해 성인 돼지 섬(API)보다 선호됩니다. 또한 NPCC는 이식 후 점진적으로 증식하여 생체 내에서 기능을 연장할 수 있습니다[1, 2]. 그러나 NPCC를 인간 또는 인간이 아닌 영장류(NHP) 간문맥에 이식할 때 종간 변이는 즉각적인 혈액 매개 염증 반응(IBMIR) 또는 과급성 거부 반응과 같은 면역 반응을 일으켜 조기 이식 손실을 유발할 수 있습니다[3]. 이 문제를 해결하기 위해서는 다양한 면역 반응을 억제할 수 있는 NPCC의 캡슐화가 필요합니다. 캡슐화에는 매크로, 마이크로 및 나노 캡슐화의 세 가지 유형이 있습니다. 매크로 캡슐화는 섬을 포함하는 장치를 사용하며, 이 장치는 혈당 수치에 반응하여 반투막을 통해 인슐린을 방출하기 위해 혈관 주위에 이식됩니다. 미세 캡슐화는 소수의 섬을 다공성 캡슐에 포장합니다. 이러한 캡슐화는 면역 거부 반응으로부터 섬을 보호할 수 있지만 생체 내 시험에서 막 붕괴 또는 혈전 생성과 같은 부작용이 보고되었습니다. 섬은 또한 확산 거리의 증가로 인해 호르몬, 영양소 또는 산소의 흐름을 방해합니다. 나노 캡슐화는 수혈 시 세포와 외인성 단백질(주로 폴리에틸렌 글리콜(PEG)) 사이의 부착을 유도하는 세포 표면 변형 전략입니다[4].

PEG를 이용한 나노 캡슐화는 표적 단백질 또는 펩타이드의 효능 및 이화학적 특성을 개선하기 위한 변형 방법으로 널리 사용되어 왔다[5]. 특히, 섬의 나노 캡슐화는 면역 세포 공격 및 항체 인식에 대한 반응으로 억제 효과를 가질 수 있다. PEG는 비면역원성, 항원 차폐성, 무파울링 효과와 같은 생체적합성 특성 때문에 세포 코팅에 널리 사용된다[6]. NPCC의 나노 캡슐화에 사용되는 나노 입자 중 PEG-블록-폴리 락타이드(PEG-b-PLA)를 기반으로 하는 "폴리머솜"(PSomes)은 안정적이고 변형이 간단하기 때문에 가장 적합합니다. 그들은 또한 어셈블리에 친수성 및 소수성 시약을 모두 통합할 수 있습니다[7, 8]. 폴리머(PEG 함유)를 사용한 섬의 표면 변형은 섬의 세포외 기질(ECM)과 작용기 접합 폴리머 사이의 공유 또는 비공유 결합을 통해 달성됩니다[9].

이전 연구에서 염기성 Hank의 평형염 용액(HBSS, pH 8.0)은 N-하이드록시숙신이미드(NHS)-NH₂를 촉진하는 능력 때문에 섬 나노 캡슐화 반응 완충제로 사용되었습니다. 바인딩 [10,11,12]. 그러나 나노 캡슐화 동안 NPCC에 대한 세포 손상을 최소화하기 위해 생리학적 pH(pH 7.3)의 F-10 배지(NPCC 배양 배지)를 사용했습니다. 또한, 정확한 양의 세포를 이식하기 위해서는 나노캡슐화 후 NPCC의 양을 보존하는 것이 중요하므로 세포 배양 접시 바닥을 장쇄 폴리머로 코팅하는 BSA(bovine serum albumin)를 추가하여 회수율을 높였습니다. 비율 [13]. 이전 연구에서 PSomes를 사용한 NPCC의 나노 캡슐화는 NHS 또는 NH₂와 같은 단일 작용기를 통해 수행되었습니다. , 각각 NPCC의 ECM과 공유 결합 또는 정전기 상호 작용을 유도하는 데 사용됩니다. 그러나 시간이 지남에 따라 결합 친화도가 감소함에 따라 결합 효율을 높이기 위한 전략이 필요합니다[14]. P2작용기를 갖는 일부는 응집 능력으로 인해 코팅 효율을 증가시키기 위한 후보로 사용될 수 있다. 따라서 우리는 이관능기(NHS-/NH₂ -PSome)은 NPCC의 ECM뿐만 아니라 공유 상호작용이나 정전기적 상호작용을 통해 각 PSome과 결합하여 나노 캡슐화 효율을 높일 수 있습니다.

이 연구에서는 돼지섬 이종이식 분야에서 최적화된 방법을 통해 NPCC에 나노 캡슐화의 적용 가능성을 조사했습니다.

재료 및 방법

동물

모든 동물 실험은 MGENPLUS co.의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 주식회사 (#2019–1), 모든 절차는 위원회에서 정한 지침에 따라 수행되었습니다. 수술은 전신 마취하에 수행되었으며 동물이 최소한의 통증을 경험하도록 노력했습니다. 돼지는 췌장 절제술 전에 도살되었습니다.

신생아 돼지 섬과 같은 세포 클러스터(NPCC)의 분리

NPCC는 3-5일 된 새끼 돼지에서 분리되었습니다. 간단히 말해서, 새끼 돼지를 대퇴부 근육에 케타민(10 mg/kg, 유한양행)과 자일라진 염산염(1 mg/kg, Rompun; Bayer Korea, Seoul, Korea)을 주사하여 마취시킨 후 염화칼륨( Sigma-Aldrich, MO, USA)를 심장에 삽입합니다. 복부 절개를 통해 췌장을 노출시키고, 채취한 후 8.3mM 중탄산나트륨, 10mM N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-( 2-에탄설폰산)(HEPES)(Sigma-Aldrich, MO, USA) 및 0.5% 항생제-항진균제(Biowest, MO, USA). 췌장은 1~2mm ³ 로 잘게 썰었습니다. 조각을 만들고 10분 동안 HBSS에서 콜라게나아제 유형 V(1mg/ml, Sigma-Aldrich, MO, USA)로 분해합니다. 10% 소태아혈청(FBS)(Biowest, MO, USA)을 함유하는 저온 HBSS를 소화된 췌장 조직에 첨가하여 효소 활성을 정지시켰다. 소화된 췌장 조직을 HBSS로 세척하고, 재현탁 후 pluriStrainer 500μm(pluriSelect, Leipzig, Germany)를 통해 조직을 여과하고 HBSS로 세척하였다. 마지막으로 NPCC는 5% CO₂에서 시딩되고 배양되었습니다. 0.25% 소 혈청 알부민(BSA)(genDepot, TX, USA), 10mM 니코틴아미드, 10mM D-글루코스, 2mM L-글루타민이 보충된 F-10 배지(Gibco, CA, USA)에서 37°C, 2mM 염화칼슘 이수화물, 50μM 이소부틸메틸크산틴(IBMX), 20μg/ml 시프로플록사신(Sigma-Aldrich, MO, USA), 1% 항생제-항진균제. NPCC는 5일 동안 배양되었으며[15] 매일 10nM exendin-4(Prospec, Ness-Ziona, Israel)가 배양 배지에 추가되었습니다.

NPC 및 나노 캡슐화된 NPCC의 체외 평가

배양 후 NPCC의 수는 안구의 접안렌즈 레티클을 사용하여 IEQ(islet equivalent)로 계산되었습니다. 생존력은 acridine orange(AO, 0.67μM, Sigma-Aldrich, MO, USA) 및 propidium iodide(PI, 75μM, Sigma-Aldrich, MO, USA) 염색을 사용하여 평가되었습니다. 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS) 분석을 수행하기 위해 20~30개의 NPCC를 선택하고 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액(KRBB)에서 낮은 D-포도당(2.8mM) 농도로 1시간 동안 사전 인큐베이션했습니다. 그런 다음 NPCC를 KRBB 완충액에서 1시간 동안 낮은 D-포도당(2.8mM)과 함께 배양한 다음 KRBB에서 1시간 동안 높은 D-포도당 용액(28.0mM)과 함께 배양했습니다. 낮거나 높은 포도당 농도에서 인슐린 분비를 측정하기 위해 상등액을 수집했습니다[11]. 각 시료에서 분비되는 인슐린의 양은 Human/Canine/Porcine Insulin Quantikine ELISA Kit(R&D systems, MN, USA)를 사용하여 측정하였다. 자극 지수(SI)는 고포도당(28.0mM)의 인슐린 양을 저포도당(2.8mM) 농도의 인슐린 양으로 나누어 계산했습니다.

폴리머솜(PSome)의 준비

PSomes를 준비하려면 N-하이드록시숙신이미드-폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(락타이드) 공중합체(10mg/ml, NHS-PEG-b-PLA) 또는 아민-폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(락타이드) ) 공중합체(10mg/ml, NH₂ -PEG-b-PLA; Nanosoft polymers, NC, USA)를 1ml의 디메틸 설폭사이드(DMSO, Sigma-Aldrich, MO, USA)에 용해했습니다. 이관능성 PSome을 준비하는 것 외에도 각 공중합체(NHS 또는 NH₂ -PEG-b-PLA)를 DMSO에 녹인 비율로 혼합하였다. 증류수(DH2O)를 폴리머 용액에 첨가하여 최종 농도가 1mg/ml가 되도록 했습니다. 폴리머 용액을 초음파 발생기(Sea han 초음파, 서울, 한국)에서 5분 동안 초음파 처리했습니다. 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt(DiD; Biotium, CA, USA)를 초음파 처리하는 동안 고분자 용액에 첨가하여 시각화를 가능하게 했습니다. 마지막으로 혼합물을 DH2O에서 3일 동안 투석했습니다.

나노 캡슐화

PSome은 나노 캡슐화 반응 완충액(HBSS(pH 7.3 또는 pH 8.0) 또는 보충제가 없는 일반 F-10 배지(pH 7.3 또는 pH 8.0), 0.25% BSA 포함 또는 미포함)에서 희석되었습니다. 나노 캡슐화는 배양 배지의 NPCC에 PSome을 추가하여 수행되었습니다. 이를 위해 NPCC의 IEQ 10,000개를 6웰 세포 배양 접시(SPL, 경기도, 한국)에 접종하고 희석된 PSome을 NPCC에 첨가하고 5% CO₂에서 배양했습니다. 37°C에서 1시간 음성 대조군(NC) 그룹(PSomes가 없는 코팅되지 않은 NPCC)은 실험 그룹과 동일한 조건에서 인큐베이션되었습니다. 배양 후, 나노 캡슐화된 NPCC를 수확하고 F-10 배양 배지에서 배양했습니다.

나노 캡슐화 NPCC의 효율성

DiD-접합 PSome 나노 캡슐화 NPCC는 형광 현미경(Leica, Wetzlar, Germany) 또는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 시각화되었습니다. ImageJ 소프트웨어(NIH, Bethesda, USA)를 사용하여 평균 형광 강도(MFI)를 계산하여 DiD-접합 PSome-결합 NPCC의 강도를 정량화했습니다. 세포의 핵은 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 대조염색되었습니다.

고분자 투과성 분석

F-10 또는 F-10(0.25% BSA)의 NHS-PSome 나노 캡슐화 NPCC를 다양한 분자량(10, 20, 70, 250kDa)의 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 접합 덱스트란과 함께 2시간 동안 배양했습니다. . FITC가 결합된 덱스트란이 NHS-PSome 나노 캡슐화 NPCC에 침투하는 것을 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 통해 각 분자량에 대해 확인했습니다.

폴리머솜 세포 생존력 분석

RPMI 1640(Biowest, MO, USA)의 NHS-PSome 나노 캡슐화된 THP-1(인간 단핵구 세포주)을 1시간 동안 배양했습니다. NHS-PSome nano-encapsulated THP-1의 생존율은 MTT 세포 증식 분석 키트(iNtRon Biotechnology, 성남시, 한국)에 제시된 프로토콜에 따라 측정되었습니다.

통계 분석

Unpaired t-test는 GraphPad Prism 6.0에서 수행되었습니다. 통계적 유의성은 P를 나타내는 *, ** ***, ****로 표현하였다. ≤ 0.05, ≤ 0.01, ≤ 0.001 및 ≤ 0.0001의 값.

결과

NPC의 문화 및 기능 평가

NPCC를 5일 동안 배양하고 생존도 및 GSIS를 포함한 품질 관리를 수행했습니다. NPCC의 총 수는 21,014.0 IEQ/g/췌장이었다. AO/PI 염색을 사용한 생존율은 89.9%였습니다. 포도당 농도에 대한 NPCC의 반응성을 확인하기 위해 수행된 GSIS는 2.3의 평균 자극 지수(SI)를 제공했습니다(표 1, 추가 파일 1:그림 S1).

PNPC의 효율적인 나노 캡슐화에 필요한 농도

효율적인 나노 캡슐화에 필요한 PSome의 농도를 결정하기 위해 다양한 농도의 NHS-PSome을 NPCC에 추가했습니다. NHS-PSome은 DH₂에서 1mg/ml의 농도로 보관되었습니다. O 및 1:5, 1:10, 1:20 및 1:40으로 희석하여 0.2~0.025mg/ml 범위의 최종 농도를 제공합니다. 나노 캡슐화 효율은 DiD가 로딩된 PSome 나노 캡슐화 NPCC의 MFI에 의해 측정되었습니다. 0.1mg/ml(1:10 희석)의 최종 농도는 나노 캡슐화 후 2일째에 가장 높은 형광 강도를 보였고(그림 1a 및 b) 이 농도에서 NPCC의 후속 나노 캡슐화가 수행되었습니다.

0일과 2일에 효과적인 나노 캡슐화를 위한 PSome 농도 최적화. 효과적인 나노 캡슐화를 위한 PSome 농도 최적화 아 DiD가 로딩된 NHS-PSome은 NPCC에서 다양한 농도(BF, 명시야)로 처리되었습니다. 눈금 막대는 200μm를 나타냅니다. ㄴ DiD가 로드된 PSome 나노 캡슐화 NPCC의 MFI(n =3) 및 NC 제어(n =1)

생리학적 pH가 있는 F-10 배지에서 나노 캡슐화의 효율성 향상

췌도(NPCC 함유)의 나노 캡슐화는 종종 기본 HBSS 완충액(pH 8.0 이상)에서 수행되어 췌도의 ECM에 있는 NH2와 폴리머에 접합된 NHS 사이의 결합 친화도를 향상시킵니다. 그러나 기본 HBSS 버퍼의 나노 캡슐화는 잠재적으로 NPCC를 손상시킬 수 있습니다. 따라서 NPCC의 손상을 최소화하고 NHS-NH₂에 대한 pH의 영향을 결정하기 위해 결합, NPCC는 각각 pH 7.3(생리학적) 또는 pH 8.0(기본)의 HBSS 완충액 또는 일반 F-10 배양 배지(NPC를 배양하기 위해 이 연구에서 사용됨)에서 NHS-PSome을 통해 나노캡슐화되었습니다. F-10에서 NPCC를 나노캡슐화한 경우, NPCC의 정상적인 형태는 유지되었고(Fig. 2a), MFI 기반 나노캡슐화 효율은 0일째 pH에 관계없이 HBSS군에 비해 유의하게 증가하였다. 및 6(그림 2b). HBSS군은 6일째 pH 7.3과 8.0에서 유의한 차이를 보였으나, F-10군에 비해 나노캡슐화 강도가 유의하게 감소하였다. 따라서 우리는 NPCC의 잠재적인 손상을 최소화하기 위해 후속 실험에서 생리학적 F-10 배양 배지(pH 7.3)를 나노 캡슐화 반응 완충제로 사용했습니다.

1일과 6일에 다양한 반응 완충액에서 나노 캡슐화의 코팅 효율 비교. 다양한 반응 완충액에서 나노 캡슐화의 코팅 효율 비교. 아 DiD-접합 NHS-PSome(BF, 명시야)을 사용하여 HBSS(pH 7.3 및 pH 8.0) 또는 F-10(pH 7.3 및 pH 8.0)의 나노 캡슐화된 NPCC. 눈금 막대는 200um을 나타냅니다. ㄴ DiD-접합 NHS-PSome(모든 그룹, n)을 사용하여 HBSS(pH 7.3 및 pH 8.0) 또는 F-10(pH 7.3 및 pH 8.0)에서 나노 캡슐화된 NPCC의 MFI =3). 데이터는 평균 ± S.D.를 나타냅니다. *p <0.05, ***p <0.001 및 ****p <0.0001 대 다른 그룹

나노 캡슐화 후 NPCC의 복구율 증가

F-10에서는 NPCC의 세포 손상이 최소화되었지만 나노 캡슐화 후 수집된 NPCC의 양이 현저히 감소했습니다. 이 문제를 해결하기 위해 NHS-PSome을 사용하여 NPCC의 배양 및 나노 캡슐화 동안 F-10 배지에 0.25% BSA를 추가했습니다. 우리는 처음에 F-10 배지에 0.25% BSA를 추가하는 것이 코팅 효율과 선택적 투과성에 영향을 미치는지 여부를 확인하여 더 큰 분자(70 및 250kDa FITC-결합 dextran), PSome의 필수 기능. 그 결과, 컨포멀 코팅이 CLSM(Fig. 3a, Mid)의 이미지에서 나타났고 선택적 투과성은 0.25를 함유하는 F-10을 갖는 NHS-PSome 나노 캡슐화 NPCC에서 정상적으로 유지되었다(Fig. 3b, FITC-conjugated dextran). MFI가 약간 감소했지만 F-10과 비교한 % BSA(그림 3b). 나노 캡슐화 후 수집된 NPCC의 양은 BSA가 없는 F-10(42.3%)보다 0.25% BSA를 포함하는 F-10에서 훨씬 더 높은 회수율(71.9%)을 나타냈습니다(그림 3c). 0.25% BSA를 포함하는 F-10에서 NPCC의 생존율(NC:89.5%, NHS-PSome:90.3%) 및 포도당 자극 인슐린 분비(NC:2.1, NHS-PSome:1.6)도 나노 캡슐화 후에도 유지되었습니다(그림 2a). . 4a, b, 추가 파일 1:그림 S2). 우리의 결과는 0.25% BSA의 첨가가 나노 캡슐화 후 NPCC의 회수율을 크게 향상시킬 수 있으며 PSome의 코팅 효율이나 기능에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다.

회수율 증가를 위한 나노캡슐화 반응 완충액에 0.25% BSA 첨가 후 코팅 효율 비교. 회수율 증가를 위한 나노캡슐화 반응 완충액에 0.25% BSA 첨가 후 코팅 효율 비교. 아 0.25% BSA가 있는 F-10 또는 F-10에서 NHS-PSome을 포함하는 나노 캡슐화된 NPCC의 코팅 효율성 및 선택적 투과성(BF, 명시야, 중간, DiD-컨쥬게이션된 NHS-PSome 나노 캡슐화된 NPCC의 CLSM을 사용한 중간 이미지, FITC 결합 덱스트란, NHS-PSome 나노 캡슐화된 NPCC에서 FITC 결합 덱스트란의 CLSM을 사용한 중간 이미지. 중앙의 파란색은 DAPI 염색을 통해 세포를 나타냅니다. 눈금 막대는 200(BF 및 DiD) 및 100(Mid 및 FITC-접합 덱스트란) μm입니다. ㄴ DiD-접합 NHS-PSome을 사용하는 나노 캡슐화된 NPCC의 MFI; ㄷ F-10(n)에서 나노 캡슐화 후 NPCC의 회수율 =12) 또는 0.25% BSA가 있는 F-10(n =12). 데이터는 평균 ± S.D.를 나타냅니다. *p <0.05 대 F-10

0.25% BSA가 포함된 F-10을 사용하는 NHS-PSome 나노 캡슐화된 NPCC의 생존 가능성 및 기능. 0.25% BSA가 포함된 F-10을 사용하는 NHS-PSome 나노 캡슐화된 NPCC의 생존 가능성 및 기능. 아 NHS-PSome 나노 캡슐화 NPCC의 생존 가능성(n =6) 및 NC 제어(n =6); ㄴ NHS-PSome 나노 캡슐화 NPCC의 SI(n =5) 및 NC 제어(n =5). 데이터는 평균 ± S.D

PSomes 교차 연결을 통한 나노 캡슐화의 안정성 향상

NPCC의 보다 안정적인 나노 캡슐화를 유도하기 위해 우리는 두 개의 다른 작용기를 갖는 PSomes를 접합하려고 시도했습니다. 먼저, NHS와 NH₂를 포함하는 PSomes의 다른 비율을 동시에 추가하여 NPCC의 나노 캡슐화를 수행했습니다. 이중작용기(NHS-/ NH₂ -PSome) 하나의 PSome(Scheme 1). 나노 캡슐화의 효율성은 PSome 나노 캡슐화 NPCC에 접합된 DiD의 MFI에 의해 확인되었습니다. 형광 현미경의 결과 이미지는 0일째에 NHS-/NH2-PSome 나노 캡슐화 NPCC(9:1, 5:5, 1:9)의 9:1, 5:5 및 1:9 그룹 간에 유의미한 차이를 나타내지 않았습니다. 및 요일(그림 5a). 그러나 CLSM 결과에서 5:5 그룹은 과도하게 코팅된 것처럼 보였고 1:9 그룹은 불충분한 코팅을 보였고 9:1 그룹은 1일차에 등각 코팅을 형성했습니다(그림 5b). 따라서 우리는 PSome에서 NHS-/NH2의 최적 비율을 9:1로 결정했습니다. 9:1 ​​그룹에 대해 기능적 분석을 수행한 결과 9:1 그룹의 생존율은 NC 대조군(92.1%)에 비해 유의하게 감소했지만 생존율은 정상 수준(87.8%)에서 유지되는 것으로 나타났습니다. %). 9:1 ​​그룹의 SI 기능은 NC 대조군(3.7)과 비교할 때 정상(3.0)이었습니다(그림 5c,d).

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PSomes의 가교에 의한 나노 캡슐화의 안정성 향상 그림

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NHS-/NH₂의 코팅 효율 및 기능성 -P 일부 나노 캡슐화 NPCC. NHS-/NH₂의 코팅 효율 및 기능성 -P 일부 나노 캡슐화 NPCC. 아 NHS-/NH₂의 9:1, 5:5, 1:9 접합된 DiD -P 일부 나노 캡슐화 NPCC(9:1, 5:5, 1:9)(NC, 코팅되지 않은 NPCC). MFI는 DiD-접합 PSome 나노 캡슐화 NPCC의 강도를 보여줍니다(n =3) 및 NC 제어(n =3). 눈금 막대는 200um을 나타냅니다. ㄴ DiD-접합 NHS-/NH₂의 CLSM -PSome nano-encapsulated NPCCs (Mid; DiD-conjugated NHS-/NH₂의 CLSM을 사용하는 중간 이미지 -P 일부 나노 캡슐화 NPCC). 중앙의 파란색은 DAPI 염색을 통해 세포를 나타냅니다. 눈금 막대는 100um을 나타냅니다. C. 9:1의 실행 가능성(n =9) 및 NC 제어(n =3). 데이터는 평균 ± S.D.를 나타냅니다. **p <0.01 대 NC; D. 9:1의 SI(n =9) 및 NC 제어(n =3). 데이터는 평균 ± S.D

를 나타냅니다.

토론

일반적으로 당뇨병으로 알려진 당뇨병은 높은 혈당 수치를 특징으로 하는 대사성 질환입니다. 제1형 당뇨병은 췌장의 베타 세포가 충분한 인슐린을 생산하지 못하여 발생합니다[16]. 인슐린 생산 β 세포를 포함하는 췌도 이식은 최근 제1형 당뇨병을 치료하는 데 사용되었습니다. 그러나 동종 섬 이식은 기증자의 부족으로 인해 제한적입니다. 대신, 인간이 아닌 동물의 섬을 사용하는 이종이식이 기증자 조직의 대체 소스로 등장했습니다. 돼지는 인간과 생리학적 유사성, 대량 사육의 용이성, 병원균이 없는 시설에서의 사육 가능성으로 인해 이종섬 이식을 위한 최적의 동물 모델로 간주됩니다[1]. 특히 NPCC는 API만큼 가치있게 사용되었습니다. NPCC의 성숙도는 API보다 낮지만, NPCC는 API에 비해 비교적 간단하고 저렴한 섬 분리 절차, 저산소 환경에 대한 내성 및 이식 후 생체내 증식에 대한 내성을 개발할 수 있는 능력을 포함하여 몇 가지 이점이 있습니다[1,2,3] . 이러한 이유로 본 연구에서는 3-5일 된 신생아 돼지를 섬 소스로 사용했습니다.

불행히도 돼지 섬이 인간 또는 비인간 영장류 혈관에 이식되면 IBMIR 또는 초급성 거부 반응과 같은 심각한 면역 반응이 종종 발생합니다. IBMIR은 일반적으로 외부 경로의 활성화를 통해 인간 혈관의 응고를 매개하는 돼지 섬에서 발현되는 여러 조직 인자(TF)로 인해 발생합니다. 돼지 세포의 표면에 발현된 알파-갈락토스 또는 비-gal 항원은 천연 인간 항체의 표적이 될 수 있으며, 그 다음에는 초급성 거부라고 하는 보완적인 캐스케이드 활성화가 뒤따릅니다. 그 결과, 이식편은 응고 경로로부터의 응괴 형성에 의한 저산소증 및 숙주에서의 보체 활성화에 의한 세포 사멸에 따라 손실된다[3]. 이러한 문제를 해결하기 위해 췌도를 생체적합성 물질로 코팅하여 항체 또는 보체 반응의 공격으로부터 보호하는 방법인 캡슐화(encapsulation)가 시도되고 있다. 첫째, 거대 캡슐화(macro-encapsulation)는 섬을 포함하는 반투막이 있는 장치를 사용하고 혈당 수준에 반응하여 인슐린을 혈류로 방출하는 혈관 옆에 이식됩니다[4]. 둘째, 주로 알지네이트를 사용하는 마이크로 캡슐화는 선택적 투과성을 가지며 산소와 영양소가 다공성 표면을 통과하도록 허용하면서 다중 사이토카인 및 면역 세포 침투를 차단합니다. 하지만, 췌도의 크기에 관계없이 같은 크기의 캡슐을 사용하기 때문에 도를 컨포멀하게 코팅하기 어렵다. 또한 이식 후 이식편을 둘러싸는 섬유화가 발생할 수 있습니다[17]. 마지막으로, 섬의 표면 개질(나노 캡슐화)은 "스텔스" 폴리머(PEG)로 코팅된 물질과 혈액 내 성분(면역 세포)의 상호 작용을 차단하는 "스텔스 효과" 특성을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 주로 사용합니다. 생체 [11, 18]. 우리 NPCC의 나노 캡슐화 전략은 변형된 PEG 공중합체(PEG-b-PLA, Polymersome, PSome)를 사용합니다. 또한 Psome은 친수성과 소수성을 모두 가지고 있으며 면역억제제나 세포 분화 또는 성장에 관여하는 인자를 포함할 수 있습니다[8].

PEG를 사용한 섬의 나노 캡슐화는 기본 HBSS 완충액(pH 8.0 이상)에서 수행되어 PEG의 NHS와 NH₂ 간의 결합 친화도를 향상시킵니다. 섬의 ECM에서 [10,11,12]. 그러나 이러한 조건은 적절한 세포 배양 환경을 제공할 수 없기 때문에 NPCC 배양 조건을 모방한 환경에서 나노 캡슐화를 시도했습니다. 위의 문제를 해결하기 위해 나노 캡슐화 반응 버퍼로 사용되는 생리학적 pH(보충제 없음)를 사용하여 일반 F-10 배지인 NPCCs 배양 기본 배지를 테스트했습니다. 생리학적 pH를 갖는 F-10의 나노 캡슐화는 염기성 HBSS 완충액을 사용한 배양 조건과 비교할 때 유사한 코팅 효율을 보였고 NPCC의 정상적인 형태를 유지했다(그림 3). 따라서 NPCC 문화 모방 환경에서 나노 캡슐화 시 NPCC 손상을 최소화하는 플랫폼을 제안할 수 있습니다.

NPCC 손상을 최소화하기 위한 나노 캡슐화 방법이 확립되었지만, 페트리 접시에서 나노 캡슐화를 수행할 때 나노 캡슐화 후 수집된 NPCC의 잔류량이 감소했습니다. 이는 이식을 위한 나노 캡슐화를 위해 더 많은 NPCC가 필요함을 의미합니다. 이전 보고서에 따르면 격리 동안 BSA를 사용하여 일부 마우스 계통에서 섬 수율이 향상되었습니다[19]. 또한 BSA는 쥐의 간암 세포 배양에서 세포 배양 접시의 표면을 미리 코팅하여 현탁 배양으로 사용했습니다[13]. 따라서, 나노 캡슐화 후 NPCC의 양을 증가시키기 위해 F-10 나노 캡슐화 반응 완충액에 NPCC 배양에 사용된 BSA의 농도와 동일한 0.25% BSA를 첨가하였다. 그 결과 나노 캡슐화 후 NPCC 회수율이 크게 증가했습니다(그림 4). 이는 나노 캡슐화 후 정확한 수의 섬(NPC를 포함) 손실을 최소화하여 섬(NPC 포함) 손실을 최소화하여 예측하고 이식할 수 있음을 의미합니다. 요약하면, 나노 캡슐화를 위해 0.25% BSA가 포함된 F-10을 사용한 이 연구는 (i) NPCC의 정상적인 형태가 유지되고, (ii) NPCC의 ECM에서 NHS-접합 PSome과 NH2 간의 결합이 방해받지 않았으며, (iii) 나노 캡슐화 후 NPCC의 회수율이 증가했습니다.

마지막으로 (i) PSomes 간의 접합 및 (ii) PSomes와 NPCC의 ECM 간의 결합을 통해 나노 캡슐화의 안정성을 향상시키려고 했습니다. 먼저 NHS- 및 NH2-PEG-b-PLA 중합체를 비례적으로 혼합하여 NPCC의 PSome 및 ECM 모두에 결합할 수 있는 이관능성 PSome(NHS-/NH2-PSome)을 형성했습니다. 우리는 접합이 동일한 기능 그룹(NHS-NHS 및 NH2-NH2)을 가진 PSomes 사이의 결합으로 인한 잠재적인 중단으로 인해 단일 기능 그룹과 두 개의 PSome을 접합하는 것보다 하나의 PSome 내의 이기능 그룹에 의해 효율적으로 달성될 수 있다고 가정했습니다. 결과에서 알 수 있듯이 NHS-/NH2-PSome 나노 캡슐화 NPCC의 9:1 비율에서 NPCC의 등각 코팅이 이루어졌으며 생존력과 기능이 유지되었습니다(그림 5). 그러나 이기능성 PSomes를 사용한 나노 캡슐화가 단일 기능성 PSomes보다 더 안정적인 캡슐화를 초래했음을 증명하기 위해 PSome 결합의 강도를 정량화하기 위한 추가 연구가 필요합니다. 따라서 NPCC 배양 환경을 모방한 효과적인 나노 캡슐화 조건이 NPCC를 포함하는 섬을 사용하는 나노 캡슐화 전략에 사용할 수 있음을 제안합니다(추가 파일 1).

결론

본 연구는 PEG 기반 폴리머솜(PSomes)을 사용하여 췌도(NPCC)를 나노 캡슐화하는 최적의 방법을 결정하기 위해 수행되었습니다. 첫째, pH 7.3의 F-10 배양 배지를 사용하면 기본 HBSS 완충액(pH 8.0)을 사용하는 경우에 비해 나노 캡슐화 후 NPCC의 정상적인 형태를 유지할 수 있어 캡슐화 중 NPCC의 손상을 최소화할 수 있습니다. 둘째, F-10 배지에 0.25% BSA를 첨가하면 나노캡슐화 후 NPCC의 수율이 약 1.7배 향상되었습니다. 마지막으로 이기능성 PSomes(NHS-/NH2-PSomes)의 접합을 통해 보다 안정적인 나노 캡슐화를 유도했습니다. 이 논문에서 제시된 나노 캡슐화 방법은 PEG 기반 나노 입자를 사용하여 췌도의 나노 캡슐화에 적용할 수 있습니다.

데이터 및 자료의 가용성

해당 없음.

약어

DiD:

1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt

AO:

Acridine orange

APIs:

Adult porcine islets

BSA:

소 혈청 알부민

BF:

Bright field

CLSM:

공초점 레이저 스캐닝 현미경

DAPI:

4′,6-Diamidino-2- phenylindole

DMSO:

디메틸설폭사이드

DH2O:

Distilled water

ELISA:

효소 결합 면역흡착 분석

FBS:

태아 소 혈청

FITC:

플루오레세인 이소티오시아네이트

GSIS:

Glucose-stimulated insulin secretion

HBSS:

Hank’s balanced salt solution

IBMIR:

Instant blood-mediated inflammatory reaction

IEQ:

Islet equivalent

IBMX:

Isobutylmethylxanthine

KRBB:

Krebs–Ringer bicarbonate buffer

MFI:

Mean fluorescence intensity

HEPES:

N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)

NC:

Negative control

NPCCs:

Neonatal porcine islet like cell clusters

NHS:

N-hydroxysuccinimide

NHP:

Non-human primate

PLA:

Poly lactide

PEG:

Polyethylene glycol

PSomes:

Polymersomes

PI:

Propidium iodide

SI:

Stimulation index

TF:

Tissue factor

내성 박테리아를 살균하기 위한 제자리 전기방사 커큐민 복합 나노섬유의 이중 항균 효과 리튬 황 배터리용 원자 층간 이온 채널 구축을 통한 리튬 금속 양극의 순환성 개선