PEG-블록-PLA 폴리머좀을 이용한 신생아 돼지 췌도 유사 세포 클러스터의 효율적인 나노 캡슐화

초록

본 연구는 폴리에틸렌 글리콜-블록-폴리락타이드(PEG-b-PLA)로 형성된 폴리머좀(PSome)을 사용하여 신생아 돼지 췌도 유사 세포 클러스터(NPCC)의 나노 캡슐화 방법을 입증합니다. NPCC의 손실과 손상을 최소화하는 효율적인 나노 캡슐화 절차를 제시합니다. 폴리머좀의 N-말단에 N-하이드록시석시나이미드(NHS)를 도입하여 NPCC 주변 세포외 기질(ECM)의 아민기와 결합을 유도했습니다. 나노 캡슐화 과정에서 소 혈청 알부민(BSA)을 첨가한 F-10 배양 배지를 사용하여 NPCC의 손상과 손실을 최소화했습니다. 마지막으로 이중 기능성 폴리머좀(NHS-/NH₂-PSome) 간의 가교 결합을 유도했습니다.

pH 7.3의 0.25% BSA 함유 F-10 배양 배지는 염기성 HBSS 완충액(pH 8.0) 사용 시에 비해 나노 캡슐화 후 NPCC의 손상과 손실을 유의미하게 감소시켰습니다. 또한 이중 기능성 폴리머좀(NHS-/NH₂-PSome)의 결합을 통해 효율적인 나노 캡슐화를 달성했습니다.

서론

제1형 당뇨 치료를 위한 동종 췌도 이식은 적합한 공여자 부족으로 제한됩니다. 대신 이종 췌도 이식에 동물 췌도 사용이 점차 증가하고 있으며, 돼지가 최적의 공여 동물로 부상하고 있습니다[1]. 돼지를 공여자로 사용할 때 연령에 따라 별도의 췌도를 사용할 수 있습니다. 신생아 돼지 췌도 유사 세포 클러스터(NPCC)는 성체 돼지 췌도(API)보다 저렴하고 분리가 용이하여 선호됩니다. 또한 NPCC는 이식 후 점차 증식하여 체내에서 기능을 연장할 수 있습니다[1, 2]. 그러나 NPCC를 인간이나 비인간 영장류(NHP)의 문맥에 이식할 때 종간 차이로 인해 즉시 혈액 매개 염증 반응(IBMIR)이나 초급성 거부 반응 같은 면역 반응이 발생하여 조기 이식편 손실을 초래합니다[3]. 이 문제를 해결하기 위해 다양한 면역 반응을 억제할 수 있는 NPCC의 캡슐화가 필요합니다.

캡슐화에는 거대 캡슐화, 미세 캡슐화, 나노 캡슐화 세 가지 유형이 있습니다. 거대 캡슐화는 췌도를 포함한 장치를 혈관 주위에 이식하여 반투과성 막을 통해 혈당 수준에 반응하여 인슐린을 분비하게 합니다. 미세 캡슐화는 소수의 췌도를 다공성 캡슐에 포장합니다. 이러한 캡슐화는 췌도를 면역 거부로부터 보호할 수 있지만, 생체 내 시험에서 막 붕괴나 혈전 생성 같은 부작용이 보고되었습니다. 또한 확산 거리 증가로 인해 호르몬, 영양소, 산소의 흐름을 방해합니다. 나노 캡슐화는 주로 수혈에서 세포와 외인성 단백질(주로 폴리에틸렌 글리콜, PEG) 간의 부착을 유도하는 세포 표면 개질 전략입니다[4].

PEG를 이용한 나노 캡슐화는 표적 단백질이나 펩타이드의 효능과 물리화학적 특성을 개선하는 개질 방법으로 널리 사용되어 왔습니다[5]. 특히 췌도의 나노 캡슐화는 면역 세포 공격과 항체 인지에 대한 억제 효과를 가질 수 있습니다. PEG는 비면역원성, 항원 마스킹, 비오염 효과 같은 생체적합성 때문에 세포 코팅에 널리 사용됩니다[6]. NPCC 나노 캡슐화에 사용되는 나노입자 중 PEG-블록-폴리락타이드(PEG-b-PLA) 기반 '폴리머좀(PSome)'이 가장 적합한데, 이는 안정적이고 수정이 간편하며 친수성 및 소수성 시약을 모두 조립에 포함할 수 있기 때문입니다[7, 8]. 폴리머(PEG 포함)를 이용한 췌도 표면 개질은 췌도의 세포외 기질(ECM)과 작용기 결합 폴리머 간의 공유 결합 또는 비공유 결합을 통해 이루어집니다[9].

이전 연구에서는 N-하이드록시석시나이미드(NHS)-NH₂ 결합을 촉진하기 위해 염기성 한크스 균형 염 용액(HBSS, pH 8.0)을 나노 캡슐화 반응 완충액으로 사용했습니다[10,11,12]. 그러나 나노 캡슐화 중 NPCC의 세포 손상을 최소화하기 위해 생리적 pH(pH 7.3)의 F-10 배지(NPCC 배양 배지)를 사용했습니다. 또한 나노 캡슐화 후 NPCC의 양을 보존하는 것이 정확한 세포 이식량에 중요하므로, 긴 사슬 폴리머로 세포 배양 접시 바닥을 코팅하는 소 혈청 알부민(BSA)을 첨가하여 회수율을 높였습니다[13]. 이전 연구에서는 NHS 또는 NH₂ 같은 단일 기능기를 사용하여 NPCC의 ECM과 공유 결합 또는 정전기적 상호작용을 유도하는 방식으로 PSome을 이용한 NPCC 나노 캡슐화를 수행했습니다. 그러나 결합 친화력이 시간이 지남에 따라 감소하므로 결합 효율을 높이는 전략이 필요했습니다[14]. 이중 기능기를 가진 PSome은 응집 능력으로 인해 코팅 효율을 높일 후보가 될 수 있습니다. 따라서 NPCC의 ECM에 결합할 뿐만 아니라 공유 결합 또는 정전기적 상호작용을 통해 각 PSome 간에도 결합할 수 있는 이중 기능기(NHS-/NH₂-PSome)를 가진 PSome 간의 가교 결합을 유도하여 나노 캡슐화 효율을 높였습니다.

본 연구에서는 돼지 췌도 이종 이식 분야에서 NPCC에 대한 나노 캡슐화의 최적화된 방법을 통한 적용 가능성을 조사했습니다.

재료 및 방법

동물

모든 동물 실험은 MGENPLUS 주식회사의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(#2019–1)의 승인을 받았으며, 위원회가 정한 지침에 따라 수행되었습니다. 수술은 전신 마취 하에 진행되었으며, 동물의 고통을 최소화하기 위해 노력했습니다. 췌장 절제 전 돼지를 안락사시켰습니다.

신생아 돼지 췌도 유사 세포 클러스터(NPCC) 분리

NPCC는 생후 3~5일 된 돼지에서 분리했습니다. 간단히 말해, 돼지를 케타민(10 mg/kg, 유한, 서울, 한국)과 자일라진 염산염(1 mg/kg, 롬푼; 바이엘 코리아, 서울, 한국) 대퇴근 주사로 마취시킨 후 염화칼륨(시그마-알드리치, MO, 미국) 심장 주사로 안락사시켰습니다. 복부 절개를 통해 췌장을 노출, 적출하여 8.3 mM 탄산수소나트륨, 10 mM HEPES(시그마-알드리치, MO, 미국), 0.5% 항생제-항진균제(바이오웨스트, MO, 미국)가 포함된 HBSS(바이오세상, 경기도, 한국)에 담갔습니다. 췌장을 1-2 mm³ 크기로 잘라 콜라게나아제 타입 V(1 mg/ml, 시그마-알드리치, MO, 미국)를 HBSS에 녹여 10분간 소화했습니다. 10% 태아 소 혈청(FBS)(바이오웨스트, MO, 미국)이 포함된 차가운 HBSS를 소화된 췌장 조직에 첨가하여 효소 활성을 중단했습니다. 소화된 췌장 조직을 HBSS로 세척하고, 재현탁 후 500 μm 플루리스트레이너(플루리셀렉트, 라이프치히, 독일)로 여과한 후 HBSS로 세척했습니다. 마지막으로 NPCC를 5% CO₂, 37°C에서 0.25% BSA(젠디포, TX, 미국), 10 mM 니코틴아미드, 10 mM D-글루코스, 2 mM L-글루타민, 2 mM 염화칼슘 이수화물, 50 μM 이소부틸메틸크산틴(IBMX), 20 μg/ml 시프로플록사신(시그마-알드리치, MO, 미국), 1% 항생제-항진균제가 첨가된 F-10 배지(깁코, CA, 미국)에 배양했습니다. NPCC를 5일간 배양[15]했으며, 매일 10 nM 엑센딘-4(프로스펙, 네스-지오나, 이스라엘)를 배양액에 첨가했습니다.

NPCC 및 나노 캡슐화된 NPCC의 체외 평가

배양 후 안구 망막 척도 안경으로 NPCC 수를 췌도 당량(IEQ)으로 계산했습니다. 생존율은 아크리딘 오렌지(AO, 0.67 μM, 시그마-알드리치, MO, 미국)와 요오화 프로피디움(PI, 75 μM, 시그마-알드리치, MO, 미국) 염색으로 평가했습니다. 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS) 분석을 위해 20-30개의 NPCC를 채취하여 저농도 D-글루코스(2.8 mM)가 포함된 크렙스-링거 중탄산염 완충액(KRBB)에서 1시간 전처리했습니다. 이후 저농도 D-글루코스(2.8 mM) KRBB에서 1시간, 고농도 D-글루코스 용액(28.0 mM) KRBB에서 1시간 배양했습니다. 상층액을 수집하여 저농도와 고농도 포도당 조건에서 인슐린 분비량을 측정[11]했습니다. 인슐린 분비량은 인간/개/돼지 인슐린 Quantikine ELISA 키트(R&D systems, MN, 미국)로 측정했습니다. 자극 지수(SI)는 고농도 포도당(28.0 mM)에서의 인슐린 양을 저농도 포도당(2.8 mM)에서의 양으로 나누어 계산했습니다.

폴리머좀(PSome) 제조

PSome 제조를 위해 N-하이드록시석시나이미드-폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(락타이드) 공중합체(10 mg/ml, NHS-PEG-b-PLA) 또는 아민-폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(락타이드) 공중합체(10 mg/ml, NH₂-PEG-b-PLA; 나노소프트 폴리머, NC, 미국)를 디메틸 설폭사이드(DMSO, 시그마-알드리치, MO, 미국) 1ml에 녹였습니다. 이중 기능성 PSome 제조를 위해 각 공중합체(NHS 또는 NH₂-PEG-b-PLA)를 DMSO에 녹인 후 비율대로 혼합했습니다. 증류수(DH₂O)를 첨가하여 최종 농도 1 mg/ml로 맞췄습니다. 폴리머 용액을 초음파 분쇄기(세한 초음파, 서울, 한국)로 5분간 초음파 처리했습니다. 시각화를 위해 1,1'-디오크타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카르보시아닌, 4-클로로벤젠설포네이트 염(DiD; 바이오티움, CA, 미국)을 초음파 처리 중 폴리머 용액에 첨가했습니다. 마지막으로 혼합물을 DH₂O에서 3일간 투석했습니다.

나노 캡슐화

PSome을 나노 캡슐화 반응 완충액(HBSS pH 7.3 또는 8.0, 또는 무보충 F-10 배지 pH 7.3 또는 8.0, 0.25% BSA 유무)에 희석했습니다. 배양 배지의 NPCC에 PSome을 첨가하여 나노 캡슐화를 수행했습니다. 6웰 세포 배양 접시(SPL, 경기도, 한국)에 10,000 IEQ의 NPCC를 접종하고 희석된 PSome을 첨가한 후 5% CO₂, 37°C에서 1시간 배양했습니다. 음성 대조군(NC)은 PSome 없이 동일한 조건에서 배양했습니다. 배양 후 나노 캡슐화된 NPCC를 수확하여 F-10 배양 배지에서 배양했습니다.

나노 캡슐화된 NPCC의 효율성

DiD 결합 PSome으로 나노 캡슐화된 NPCC를 형광 현미경(라이카, 베츨라어, 독일) 또는 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM; 칼 자이스, 오버코헨, 독일)으로 관찰했습니다. ImageJ 소프트웨어(NIH, 베데스다, 미국)로 평균 형광 강도(MFI)를 계산하여 DiD 결합 PSome이 부착된 NPCC의 강도를 정량화했습니다. 세포 핵은 DAPI(4′,6-디아미디노-2-페닐인돌)로 대조 염색했습니다.

폴리머좀 투과성 분석

F-10 또는 F-10(0.25% BSA) 배지의 NHS-PSome 나노 캡슐화된 NPCC를 다양한 분자량(10, 20, 70, 250 kDa)의 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 결합 덱스트란과 2시간 배양했습니다. 공초점 레이저 주사 현미경으로 각 분자량별 FITC 결합 덱스트란의 NHS-PSome 나노 캡슐화된 NPCC 내 침투를 확인했습니다.

폴리머좀 세포 생존율 분석

RPMI 1640(바이오웨스트, MO, 미국) 배지의 NHS-PSome 나노 캡슐화된 THP-1(인간 단구 세포주)을 1시간 배양했습니다. MTT 세포 증식 분석 키트(아이엔트론 바이오테크놀로지, 성남시, 한국) 프로토콜에 따라 NHS-PSome 나노 캡슐화된 THP-1의 생존율을 측정했습니다.

통계 분석

GraphPad Prism 6.0으로 비대응 t-검정을 수행했습니다. 통계적 유의성은 *, **, ***, ****로 표시하며 각각 P ≤ 0.05, ≤ 0.01, ≤ 0.001, ≤ 0.0001을 나타냅니다.

결과

NPCC의 배양 및 기능 평가

NPCC를 5일간 배양하고 생존율과 GSIS 등 품질 관리를 수행했습니다. 총 NPCC 수는 21,014.0 IEQ/g/췌장이었습니다. AO/PI 염색으로 측정한 생존율은 89.9%였습니다. 포도당 농도에 대한 NPCC 반응성을 확인하기 위해 수행한 GSIS에서 평균 자극 지수(SI)는 2.3이었습니다(표 1, 추가 파일 1: Fig. S1).

NPCC의 효율적인 나노 캡슐화를 위한 PSome 농도

효율적인 나노 캡슐화를 위한 PSome 농도를 결정하기 위해 다양한 농도의 NHS-PSome을 NPCC에 첨가했습니다. NHS-PSome을 DH₂O에서 1 mg/ml 농도로 비축하고 1:5, 1:10, 1:20, 1:40으로 희석하여 0.2~0.025 mg/ml의 최종 농도 범위를 만들었습니다. DiD 탑재 PSome으로 나노 캡슐화된 NPCC의 MFI로 나노 캡슐화 효율을 측정했습니다. 나노 캡슐화 2일 후 0.1 mg/ml(1:10 희석) 최종 농도에서 가장 높은 형광 강도를 보였습니다(Fig. 1a, b). 이후 NPCC 나노 캡슐화는 이 농도에서 수행했습니다.

생리적 pH의 F-10 배지에서 나노 캡슐화 효율 향상

췌도(NPCC 포함)의 나노 캡슐화는 종종 췌도 ECM의 NH₂와 폴리머에 결합된 NHS 간의 결합 친화력을 높이기 위해 염기성 HBSS 완충액(pH 8.0 이상)에서 수행됩니다. 그러나 염기성 HBSS 완충액에서의 나노 캡슐화는 NPCC에 잠재적 손상을 줄 수 있습니다. 따라서 NPCC 손상을 최소화하고 pH가 NHS-NH₂ 결합에 미치는 영향을 확인하기 위해 HBSS 완충액 또는 일반 F-10 배양 배지(pH 7.3 생리적, pH 8.0 염기성)에서 NHS-PSome으로 NPCC를 나노 캡슐화했습니다.

F-10에서 나노 캡슐화 시 NPCC의 정상 형태가 유지되었습니다(Fig. 2a). pH에 관계없이 HBSS 그룹에 비해 F-10 그룹에서 MFI 기준 나노 캡슐화 효율이 0일과 6일에 유의미하게 증가했습니다(Fig. 2b). HBSS 그룹은 6일째 pH 7.3과 8.0 간에 유의미한 차이를 보였으나, 나노 캡슐화 강도는 F-10 그룹에 비해 유의미하게 감소했습니다. 따라서 이후 실험에서는 NPCC 잠재적 손상을 최소화하기 위해 생리적 F-10 배양 배지(pH 7.3)를 나노 캡슐화 반응 완충액으로 사용했습니다.

나노 캡슐화 후 NPCC 회수율 증가

F-10에서 세포 손상이 최소화되었음에도 나노 캡슐화 후 수집된 NPCC 양이 현저히 감소했습니다. 이를 해결하기 위해 NHS-PSome을 사용한 NPCC 배양 및 나노 캡슐화 중 F-10 배지에 0.25% BSA를 첨가했습니다. 먼저 F-10 배지에 0.25% BSA 첨가가 코팅 효율과 선택적 투과성(10, 20 kDa FITC-덱스트란 통과 허용, 70, 250 kDa 차단)에 미치는 영향을 확인했습니다. 그 결과, F-10 단독 대비 0.25% BSA 함유 F-10에서 CLSM 이미지(Fig. 3a, Mid)로 밀착 코팅이 확인되었고 선택적 투과성도 정상적으로 유지되었습니다(Fig. 3b, FITC-덱스트란), 비록 MFI는 약간 감소했습니다(Fig. 3b). 나노 캡슐화 후 수집된 NPCC 양은 BSA 무첨가 F-10(42.3%) 대비 0.25% BSA 함유 F-10에서 유의미하게 높은 회수율(71.9%)을 보였습니다(Fig. 3c). 0.25% BSA 함유 F-10에서 NPCC의 생존율(NC: 89.5%, NHS-PSome: 90.3%)과 포도당 자극 인슐린 분비(NC: 2.1, NHS-PSome: 1.6)도 나노 캡슐화 후 유지되었습니다(Fig. 4a, b, 추가 파일 1: Fig. S2). 본 결과는 0.25% BSA 첨가가 나노 캡슐화 후 NPCC 회수율을 유의미하게 향상시키며 PSome의 코팅 효율이나 기능에 영향을 주지 않음을 보여줍니다.

PSome 간 가교 결합을 통한 나노 캡슐화 안정성 향상

보다 안정적인 NPCC 나노 캡슐화를 위해 두 가지 다른 기능기를 가진 PSome의 결합을 시도했습니다. 먼저 NHS와 NH₂ 이중 기능기를 가진 PSome(NHS-/NH₂-PSome)을 다양한 비율로 동시에 첨가하여 NPCC를 나노 캡슐화했습니다(Scheme 1). 나노 캡슐화 효율은 PSome에 결합된 DiD의 MFI로 확인했습니다. 형광 현미경 결과 9:1, 5:5, 1:9 비율의 NHS-/NH₂-PSome 나노 캡슐화 NPCC 그룹 간에 0일과 1일에 유의미한 차이가 없었습니다(Fig. 5a). 그러나 CLSM 결과 5:5 그룹은 과도한 코팅, 1:9 그룹은 불충분한 코팅을 보인 반면 9:1 그룹은 1일째 밀착 코팅을 형성했습니다(Fig. 5b). 따라서 PSome 내 NHS-/NH₂의 최적 비율을 9:1로 결정했습니다. 9:1 그룹의 기능 분석 결과, 생존율은 NC 대조군(92.1%)에 비해 유의미하게 감소했으나 정상 수준(87.8%)을 유지했습니다. 9:1 그룹의 SI 기능도 NC 대조군(3.7)과 비교하여 정상(3.0)이었습니다(Fig. 5c, d).

토론

당뇨병은 높은 혈당 수치를 특징으로 하는 대사성 질환입니다. 제1형 당뇨는 췌장 베타 세포가 충분한 인슐린을 생산하지 못해 발생합니다[16]. 인슐린 생산 β 세포를 포함한 췌도 이식이 최근 제1형 당뇨 치료에 사용되고 있습니다. 그러나 공여자 부족으로 동종 췌도 이식은 제한적이며, 대신 비인간 동물의 췌도를 이용한 이종 이식이 대체 공여 조직 공급원으로 부상했습니다. 인간과 생리적 유사성, 대량 사육 용이성, 무병원체 시설 사육 가능성으로 돼지가 이종 췌도 이식의 최적 동물 모델로 간주됩니다[1]. 특히 NPCC는 API만큼 가치 있게 사용되어 왔습니다. NPCC의 성숙도는 API보다 낮지만, 비교적 간단하고 저렴한 췌도 분리 절차, 저산소 환경에 대한 내성 발달 능력, 이식 후 체내 증식 등 API보다 몇 가지 장점이 있습니다[1,2,3]. 이러한 이유로 본 연구에서는 3-5일령 신생아 돼지를 췌도 공급원으로 사용했습니다.

불행히도 돼지 췌도를 인간이나 영장류 혈관에 이식하면 IBMIR이나 초급성 거부 반응 같은 심각한 면역 반응이 자주 발생합니다. IBMIR은 보통 돼지 췌도에서 발현되는 여러 조직 인자(TF)가 외부 경로 활성화를 통해 인간 혈관에서 응고를 매개하여 발생합니다. 돼지 세포 표면의 알파-갈락토스 또는 비갈 항원이 인간의 자연 항체 표적이 되어 보체 연쇄 활성화인 초급성 거부 반응을 유발할 수도 있습니다. 결과적으로 응고 경로의 혈전 형성에 의한 저산소증과 숙주 내 보체 활성화에 의한 세포 사멸로 이식편이 손실됩니다[3]. 이 문제를 해결하기 위해 생체적합성 물질로 췌도를 코팅하여 항체나 보체 반응의 공격으로부터 보호하는 캡슐화 방법이 시도되었습니다. 첫째, 거대 캡슐화는 반투과성 막을 가진 장치에 췌도를 넣고 혈관 옆에 이식하여 혈당 수준에 반응하여 혈류로 인슐린을 방출합니다[4]. 둘째, 주로 알긴산을 이용한 미세 캡슐화는 선택적 투과성을 가지며 다공성 표면을 통해 산소와 영양소는 통과시키면서 다양한 사이토카인과 면역 세포 침투를 차단합니다. 그러나 캡슐 크기가 췌도 크기와 관계없이 동일하여 밀착 코팅이 어렵고, 이식 후 섬유화가 발생하여 이식편을 감쌀 수 있습니다[17]. 마지막으로 췌도 표면 개질(나노 캡슐화)은 주로 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하는데, 이는 생체 내에서 '스텔스 효과' 특성을 가져 PEG로 코팅된 물질과 혈액 성분(면역 세포) 간의 상호작용을 차단합니다[11, 18]. 본 연구의 NPCC 나노 캡슐화 전략은 변형된 PEG 공중합체(PEG-b-PLA, 폴리머좀, PSome)를 사용합니다. 또한 PSome은 친수성과 소수성 특성을 모두 가지며 면역억제제나 세포 분화/성장 인자를 포함할 수 있습니다[8].

PEG를 이용한 췌도 나노 캡슐화는 췌도 ECM의 NH₂와 PEG의 NHS 간 결합 친화력을 높이기 위해 염기성 HBSS 완충액(pH 8.0 이상)에서 수행되어 왔습니다[10,11,12]. 그러나 이러한 조건은 적절한 세포 배양 환경을 제공하지 못하므로, NPCC 배양 조건을 모방한 환경에서 나노 캡슐화를 시도했습니다. 이를 위해 NPCC 배양 기초 배지인 일반 F-10 배지(보충제 없음)를 생리적 pH로 하여 나노 캡슐화 반응 완충액으로 사용했습니다. 생리적 pH의 F-10에서 나노 캡슐화 시 염기성 HBSS 완충액 사용 배양 조건과 비교하여 유사한 코팅 효율을 보이며 NPCC의 정상 형태를 유지했습니다(Fig. 3). 따라서 NPCC 배양 모방 환경에서 나노 캡슐화 시 NPCC 손상을 최소화하는 플랫폼을 제안할 수 있습니다.

NPCC 손상을 최소화하는 나노 캡슐화 방법을 확립했음에도, 페트리 접시에서 나노 캡슐화 수행 시 수집된 NPCC 잔여량이 감소했습니다. 이는 이식을 위해 더 많은 NPCC가 필요함을 의미합니다. 기존 보고에 따르면 BSA 사용 시 일부 마우스 계통에서 췌도 수율이 향상되었습니다[19]. 또한 BSA는 쥐 간암 세포 배양에서 세포 배양 접시 표면을 미리 코팅하여 부유 배양에 사용되었습니다[13]. 따라서 나노 캡슐화 후 NPCC 양을 늘리기 위해 NPCC 배양 시 사용하는 BSA 농도와 동일한 0.25% BSA를 F-10 나노 캡슐화 반응 완충액에 첨가했습니다. 그 결과 나노 캡슐화 후 NPCC 회수율이 유의미하게 증가했습니다(Fig. 4). 이는 나노 캡슐화 후 정확한 췌도(NPCC 포함) 수를 예측하고 이식할 수 있으며, 췌도(NPCC 포함) 손실을 최소화함을 의미합니다. 요약하면, F-10에 0.25% BSA를 사용한 나노 캡슐화에서 (i) NPCC의 정상 형태 유지, (ii) NHS 결합 PSome과 NPCC ECM의 NH₂ 간 결합 간섭 없음, (iii) 나노 캡슐화 후 NPCC 회수율 증가 효과를 확인했습니다.

마지막으로 (i) PSome 간 결합과 (ii) PSome과 NPCC ECM 간 결합을 통해 나노 캡슐화 안정성 향상을 시도했습니다. 먼저 NHS-와 NH₂-PEG-b-PLA 폴리머를 비례적으로 혼합하여 PSome과 NPCC ECM 모두에 결합할 수 있는 이중 기능성 PSome(NHS-/NH₂-PSome)을 형성했습니다. 단일 기능기를 가진 두 PSome 결합(NHS-NHS, NH₂-NH₂) 시 동일 기능기 간 결합으로 인한 잠재적 방해보다 한 PSome 내 이중 기능기로 결합이 더 효율적일 것으로 가정했습니다. 결과적으로 NHS-/NH₂-PSome 나노 캡슐화 NPCC에서 9:1 비율로 밀착 코팅이 달성되었으며 생존율과 기능성이 유지되었습니다(Fig. 5). 그러나 PSome 결합 강도를 정량화하고, 이중 기능성 PSome 나노 캡슐화가 단일 기능성 PSome보다 더 안정적인지 입증하기 위한 추가 연구가 필요합니다. 따라서 본 연구의 NPCC 배양 환경을 모방한 효과적인 나노 캡슐화 조건이 NPCC를 포함한 췌도의 나노 캡슐화 전략에 활용될 수 있음을 제안합니다(추가 파일 1).

결론

본 연구는 PEG 기반 폴리머좀(PSome)을 이용한 췌도(NPCC) 나노 캡슐화의 최적 방법을 결정하기 위해 수행되었습니다. 첫째, pH 7.3의 F-10 배양 배지 사용 시 염기성 HBSS 완충액(pH 8.0) 사용에 비해 나노 캡슐화 후 NPCC의 정상 형태를 유지하여 캡슐화 중 NPCC 손상을 최소화할 수 있습니다. 둘째, F-10 배지에 0.25% BSA 첨가 시 나노 캡슐화 후 NPCC 수율이 약 1.7배 향상되었습니다. 마지막으로 이중 기능성 PSome(NHS-/NH₂-PSome)의 결합을 통해 더 안정적인 나노 캡슐화를 유도했습니다. 본 논문에서 제시한 나노 캡슐화 방법은 PEG 기반 나노입자를 이용한 췌도 나노 캡슐화에 적용 가능할 것입니다.