산화아연 나노입자(ZnO NPs)는 산업, 상업 제품 및 의약 분야를 포함한 광범위한 응용 분야에서 사용됩니다. ZnO NP의 독성에 대한 수많은 기계론적 연구가 깨끗한(신선한) NP에 대해 수행되었습니다. 그러나 변형된(노화) ZnO 나노입자에 의해 유도된 세포독성과 기본 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 여기에서 우리는 시간이 지남에 따라 ZnO NP의 물리화학적 변형을 관찰한 후 신선하고 오래된 NP의 세포 독성을 평가했습니다. 우리는 신선한 ZnO 나노입자가 노화된 나노입자보다 더 높은 세포자멸사 수준을 유도한다는 것을 발견했습니다. 따라서 노화된 ZnO NP 처리 인간-햄스터 잡종(A L ) 세포는 p53, PI3k-Akt, FoXO, 글루타티온, ErbB, HIF-1, Oxytocin 및 Jak-STAT 신호 전달 경로가 풍부하지만 세포 사멸 경로는 없음을 보여주었습니다. 정량적 PCR 결과 IL1B의 mRNA 수준이 유의하게 높음이 밝혀졌습니다. 및 CD69 오래된 ZnO NP 및 염화아연 처리군과 비교하여 신선한 NP 처리군에서. 위의 결과는 노화된 ZnO 나노입자의 낮은 세포독성이 부분적으로 세포자멸사 유도의 감소된 효능에 기인함을 나타냅니다. 노화된 NP에 의해 활성화된 다중 신호 경로의 전사 조절은 세포 항상성을 구축하는 데 도움이 될 수 있습니다. 종합하면, 우리의 연구 결과는 ZnO 나노입자의 독성 및 생물학적 결과에 대한 노화(환경 변화) 과정의 영향을 강조합니다.
지난 수십 년간 나노기술의 급속한 발전으로 나노입자(NPs)는 산업, 인간의 일상, 나노의약 등 다양한 분야에 응용되고 있다[1, 2]. 나노기술 소비자 제품 인벤토리(CPI)는 762개의 건강(피트니스) 제품, 72개의 식품(음료) 및 23개의 유아 제품을 포함하여 나노 제품의 수가 2005년에서 2015년 사이에 30배 증가한 것으로 나타났습니다[2]. 소비재 및 다양한 분야에서 나노입자의 적용이 증가함에 따라 나노입자가 환경에 유입될 가능성이 높아져 잠재적인 역효과에 대한 안전 문제가 제기되었습니다. 산화아연(ZnO) 나노입자는 가장 일반적으로 사용되는 나노입자 중 하나이며 전 세계 연간 생산량은 거의 3400톤에 달한다[3, 4]. 이전에 생물학적으로 불활성인 것으로 간주되었던 일부 물질은 나노미립자 상태에서 독성이 될 수 있습니다. ZnO 나노입자가 상당한 독성을 유발하여 포유동물 세포와 동물에 심각한 위험을 초래할 수 있다는 연구가 증가하고 있습니다[5,6,7].
코팅, 표면 기능화 및 산화 상태 수정을 포함한 다양한 전략이 NP의 물리적 및 화학적 특성(예:세포막의 용해, 응집 및 섭동)을 수정하여 NP의 잠재적 독성을 약화시키는 데 사용되었습니다[8,9,10, 11]. 이러한 나노입자의 변형은 독성 효과를 어느 정도 약화시키지만 나노입자의 사용은 특히 특정 노출 조건 및 환경에서 항상 안전한 것은 아닙니다[12,13,14]. 실제로 많은 종류의 나노입자는 고의 또는 비의도적으로 자연환경으로 방출된 후 안정되지 않고 "노화" 또는 "환경적 변형"을 겪는 경향이 있다[14,15,16,17]. 최근 몇 년 동안 NPs의 환경 변환 과정을 탐색하기 위해 많은 작업이 수행되었습니다. 그러나 "변형된(노화)" 나노입자의 독성 효과에 대한 연구는 독성 메커니즘은 고사하고 여전히 매우 제한적입니다.
ZnO 나노입자는 비지속성 나노입자의 대표적인 대표 물질로서 반응성이 매우 높고, 환경에 방출되거나 동물이 섭취한 후 물리적, 화학적 특성 및 발생 상태가 변형되기 쉬우므로 독성학적 효과에 큰 영향을 미칠 수 있다[17 , 18]. 예를 들어, 연구에 따르면 ZnO 나노입자의 황화 과정은 전하, 소수성 및 응집 상태를 변화시켜 인간의 타액, 땀 및 기관지폐포 세척액에서 황화물 상태 나노입자를 흡착시키는 것으로 나타났습니다. 게다가, ZnO 나노입자에 의해 흡착된 단백질은 일반적으로 생물학적 효과에 영향을 미치는 특별한 단백질 크라운을 형성합니다[19]. 생리학적 용액의 인산염은 ZnO 나노입자를 준안정 ZnHPO4로 전환할 수 있습니다. 및 Zn3 (PO4 )2 약 5~10시간 이내[20]. 체외 노출 시스템에서 인간 T 림프구(37°C, 24시간 동안 10% FBS를 포함하는 세포 배양 배지 RPMI1640)에 대한 ZnO 나노입자(≤3μg/mL)의 완전한 변환 과정은 싱크로트론 방사선 X-를 사용하여 조사되었습니다. 광선 흡수 근변 구조 분광법(XANES) [21]. 위의 연구는 깨끗한 (신선한) ZnO NP의 생물학적 효과를 단독으로 평가함으로써 ZnO NP의 환경 및 건강 위험을 과소 평가했음을 시사합니다. 이러한 문제에 비추어 볼 때 나노입자의 노화와 환경변화 과정을 종합적으로 이해할 필요가 있다[22].
우리의 이전 연구에 따르면 초순수에서 40~120일 동안 숙성된 ZnO NP는 물리화학적 변형을 거쳐 Zn5으로 변합니다. (CO3 )2 (OH)6 , Zn(OH)2 및 Zn 2+ [23]. 흥미롭게도 노화된 ZnO 나노입자는 신선한 나노입자보다 낮은 세포독성을 나타내었지만[23], 이러한 종류의 독성 메커니즘은 불분명합니다. 현재의 연구에서 우리는 신선하고 오래된 ZnO NP 사이의 다른 세포 독성의 근본적인 이유를 탐구하기 시작했습니다. 두 가지 다른 입자 크기(20nm 및 90-200nm)를 가진 ZnO NP가 체계적으로 적용되었습니다. 세포 독성 분석은 노화 된 ZnO NP가 신선한 대응 물보다 덜 뚜렷한 형태 학적 이상과 상대적으로 높은 세포 생존력을 유도한다는 것을 보여주었습니다. RNA 시퀀싱 데이터는 apoptotic 유전자가 신선한 ZnO NP 처리된 세포에서 풍부해진 반면 이들 유전자는 노화된 ZnO NP 처리에 의해 훨씬 덜 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 또한, 노화된 ZnO 나노입자에 노출된 세포는 절단된 Caspase-3 단백질 수준이 감소하여 배양된 세포에서 세포자멸사를 유도하는 데 신선한 ZnO 나노입자의 더 높은 효능을 나타냅니다. 우리의 이전 연구 결과와 결합하여, 이 연구는 노화된 ZnO 나노입자의 감소된 세포독성이 세포 사멸을 유발하는 능력이 약화되었기 때문이라고 제안했습니다.
제조업체에서 보고한 평균 크기가 20nm(99.5% 순도, 거의 구형)이고 90–200nm(99.9% 순도, 불규칙한 형태)가 있는 상업적으로 이용 가능한 ZnO 나노분말(ZnO NPs)은 Nanostructured &Amorphous Materials(Houston, TX)에서 구입했습니다. ). 달리 명시되지 않는 한, 이 연구에 사용된 모든 시약과 화학물질은 Sigma-Aldrich(중국 상하이)에서 구입했습니다.
ZnO NP 스톡 현탁액(1 mg/mL)은 Milli-Q에 건조 나노분말을 현탁하여 준비했습니다. H2 O(Millipore, 18MΩ cm) 및 고압멸균(120°C, 30분)으로 멸균한 다음 25°C에서 0~60일 범위의 자연 숙성 기간 동안 보관합니다. 0일 및 60일의 자연적으로 변형된 ZnO NP는 각각 신선 및 노화 NP로 지정되었습니다. 적절한 분산을 보장하기 위해 특성화 또는 세포 배양 전에 신선하고 숙성된 현탁액을 초음파 수조에서 30분 동안 초음파 처리(100W)했습니다. 신선 및 노화된 ZnO 나노입자의 형태, 입자 크기 및 응집은 투과 전자 현미경(TEM, JEOL JEM-2010, Tokyo, Japan)을 사용하여 특성화되었습니다. 신선하고 노화된 ZnO 나노입자의 결정 구조는 파워 X선 회절법(XRD, PANalytical B. V., Shanghai, China)을 사용하여 정통 표준과 비교하여 결정되었습니다. 자연 노화 과정과 ZnO 나노입자의 특성에 대한 자세한 내용은 이전에 설명한 바 있습니다[23].
A L 세포주, gly2A의 융합에 의해 형성된 일종의 인간-햄스터 하이브리드 세포 차이니즈 햄스터 난소(CHO)와 인간 섬유아세포의 돌연변이체가 이 연구에서 사용되었습니다. 이 잡종 세포는 CHO-K1 염색체의 표준 세트와 인간 염색체 11의 단일 사본을 포함하고 태아 소 혈청(8%, Hyclone, Grand Island, NY)이 보충된 Ham's F12 배지(Hyclone, Grand Island, NY)에서 배양되었습니다. ), 젠타마이신(25g/mL) 및 글리신(2 × 10 –4 ) M) 37°C, 가습된 5% CO2 인큐베이터 [24]. 신선하고 노화된 ZnO NP의 스톡 현탁액을 30분의 초음파 처리(100W)로 분산시켜 응집을 방지한 다음, 세포 노출을 위해 세포 배양 배지로 적절한 농도로 희석했습니다. NP가 없는 세포 배양 배지에서 유지된 세포는 각 실험에서 대조군으로 사용되었습니다.
A L 로그 성장 단계의 세포를 35mm 페트리 접시의 유리 슬라이드에서 배양했습니다(6 × 10 4 세포/접시) 자극 전 24시간 동안 처리한 후 1, 5, 10, 12, 15 및 20μg/mL 신선 또는 숙성 ZnO NP를 포함하는 배양 배지 2mL로 72시간 처리합니다. 처리 시간 종료 후 Leica DM4B 현미경(Leica, Germany)을 이용하여 세포 형태의 이미지를 얻었다. ZnCl2 세포 독성을 ZnO NP와 비교하기 위한 아연 이온 참조로 포함되었습니다.
세포 계수 키트(CCK-8)(APExBIO, Shanghai, China)를 사용하여 세포 생존력을 검출하였다. 자세한 내용은 A L 세포를 96웰 플레이트에 접종했습니다(4 × 10 3 세포/웰) 24시간 동안 세포 배양 배지로 처리하고 다양한 농도의 ZnCl2을 포함하는 배지로 처리 , 각각 24시간, 48시간 및 72시간 동안 신선하고 오래된 ZnO 나노입자. 작업 용액의 경우, 스톡 현탁액에서 첨가된 NP의 부피는 각 웰의 배양 배지 총 부피의 5% 미만이었습니다. 처리 시간이 완료된 후 배양 배지를 흡인하고 세포를 제조업체의 지침에 따라 37°C에서 2시간 동안 100µL CCK-8 작업 용액과 함께 배양했습니다. 그런 다음 Spectra Max M2 형광 판독기(Molecular Devices, Wokingham, Berks, UK)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 기록했습니다. 세포 생존율은 웰의 흡광도 백분율로 계산되었으며, 각 농도의 NP는 대조군 세포의 흡광도에 대해 정규화되었습니다(100%).
A L 로그 성장 단계의 세포를 35mm 직경의 페트리 접시(6 × 10 4 세포/접시) 세포 배양 배지로 24시간 동안. 그런 다음 배지를 12µg/mL ZnCl2을 포함하는 2mL의 배양 배지로 교체했습니다. , 72시간 동안 신선하고 숙성된 ZnO NP. 처리 시간 종료 후 배양액을 흡인하고 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 제조사의 지침에 따라 총 RNA를 추출하기 위해 1mL의 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 각 접시에 첨가했습니다. 추출 후 얻은 total RNA의 농도와 순도는 Q5000UV-Vis Spectrophotometer(Quawell, USA)를 이용하여 정량하였다. 정량 후 TransGene RT-PCR kit(TransGene Biotech, Beijing, China)를 사용하여 역전사를 수행하여 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 템플릿에서 cDNA를 얻었다. 생성된 cDNA 샘플은 Q5000 UV-Vis Spectrophotometer를 사용하여 정량화된 다음 Roche RT-PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 형광 염료로 SYBR-Green(TransGene Biotech, Beijing, China)을 사용하여 분석되었습니다[25].
Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase(Gapdh)를 인코딩하는 하우스키핑 유전자 )는 Il-1α 평가를 위한 내부 대조군으로 사용되었습니다. , Il-1β , 카스파아제 3 , CD69 , 준 그리고 MT1 mRNA 발현. 결과는 표적 유전자와 Gapdh 간의 상대적인 발현 비율로 표현되었습니다. . 이 연구에 사용된 프라이머 시퀀스는 표 1에 나와 있습니다.
A의 총 RNA 샘플 L 대조군, 노화된 ZnO NP 처리군 및 ZnCl2의 세포 처리된 그룹은 BangFei Bioscience(Beijing, China)에 의해 시퀀싱되었습니다. 간단히 말해서, A의 총 RNA L 세포는 isoproponal 침전까지 TRIZOL 프로토콜에 따라 추출되었습니다. 그런 다음, RNA 샘플을 시퀀싱 전에 추출 버퍼에 재현탁했습니다. 원시 카운트 RNA 시퀀싱 데이터는 R 패키지 Deseq2[Eric1]를 사용하여 분석되었습니다. 벤다이어그램은 R 패키지 벤다이어그램[Eric1.2]에 의해 생성되었습니다. 크게 변경된 유전자는 추가 경로 농축 분석에 사용되었습니다. 실험은 3회 독립적으로 수행되었습니다. rRNA 유전자, 미토콘드리아 유전자 및 40bp 미만으로 검출된 유전자는 분석에서 제외되었습니다.
RNA 시퀀싱 데이터, 참조 시리즈 GSE97852, GSE60159 및 GSE39444는 Gene Expression Omnibus[Eric 2, 3, 4]에서 얻었습니다. 유전자 세트 농축 분석 플롯은 패키지 fgsea[Eric 5]를 사용하여 R(버전 3.6.2)에 의해 생성되었습니다. 1.5배 유의미한 변화 및 p를 갖는 세포자멸사 유전자 값 <0.05는 추가 분석에 사용되었습니다. 유전자 트리가 있는 히트맵은 R 패키지 "ComplexHeatmap"[Eric 6]에 의해 생성되었습니다. 클러스터링 방법은 Average linkage를 사용하였고, 거리 측정 방법은 Euclidean을 사용하였다. 경로 농축 분석은 STRING2.0[Eric 7]을 사용하여 선행되었습니다.
A L 대수 성장 단계의 세포를 60mm 직경의 페트리 접시(1.5 × 10 5 세포/접시) 세포 배양 배지로 24시간 동안. 그런 다음 배지를 24시간 동안 12μg/mL의 신선하거나 숙성된 ZnO NP를 포함하는 4mL의 배양 배지로 교체했습니다. 노출 기간이 끝나면 배양액을 흡인하고 PBS로 세포를 3회 세척하고 RIPA 용해 완충액(Beyotime, China)으로 얼음 위에서 용해하여 세포 단백질을 수집하였다. 동일한 양의 세포 단백질을 12% SDS-PAGE 젤에서 분리한 다음 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Roche, Swiss)으로 옮겼습니다. 간단히 말해서, 25°C의 TBST 중 5% 무지방 우유로 2시간 차단한 후, 막을 적절한 희석액(제조업체의 프로토콜에 따름)으로 4°C에서 밤새 1차 항체와 함께 인큐베이션한 다음, HRP-컨쥬게이션된 2차 항체와 함께 인큐베이션했습니다. 25°C에서 2시간 동안 항체(1:5000, Promega, Madison, USA). 마지막으로, ECL(Enhanced chemiluminescence)(BOSTER, China) 용액을 사용하여 면역표지를 검출했습니다. Anti-pro/cleaved Caspase-3 및 anti-Actin의 1차 항체는 각각 Cell Signaling Technology 및 ImmunoWay에서 구입했습니다.
통계적 분석은 최소한 3번의 독립적인 실험에서 얻은 결과의 수단으로 작성되었습니다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시되었으며 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 통계적으로 비교되었습니다. 모든 플롯에서 p 값 <0.05은 *로 표시되어 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
<섹션 데이터-제목="결과">신선한 ZnO 나노입자와 노화된 ZnO 나노입자 사이의 상세한 물리화학적 특성의 차이를 확인하기 위해 먼저 TEM을 사용하여 나노입자의 형태를 관찰했습니다(그림 1A). 우리의 결과는 20nm의 새로운 ZnO NP는 거의 구형 결정이고 90-200nm의 새로운 ZnO NP는 불규칙한 막대 모양/입방체 결정임을 나타냅니다. 단일 입자 크기는 제조업체에서 제공한 크기와 일치했습니다. 분명히, 20nm 및 90-200nm ZnO NP는 초순수에서 응집되는 경향이 있습니다. 또한 원래 NP의 모양과 크기에 관계없이 20nm 및 90~200nm ZnO NP의 미세 구조는 60일 동안 숙성 후 투명한 결정 구조에서 비정질 또는 시트/바늘 모양의 상태로 극적으로 변화했습니다. 또한, Cu Kα 방사선(λ =0.15418 nm) 그림 1B와 같이 25°C에서 접근합니다. 신선한 ZnO NP의 XRD 패턴은 샘플이 결정질 wurtzite 구조로 구성되었으며 특징적인 불순물 피크가 확인되지 않았음을 나타내어 고품질의 신선한 NP를 제안합니다. 노화된 NP의 경우 XRD 패턴은 Zn5의 신형성을 나타냈습니다. (CO3 )2 (OH)6 (카드 번호 00-011-0287) 및 Zn(OH)2 (카드 번호 00-003-0888) 고상, 노화 과정 동안 ZnO NP(20 및 90–200 nm)의 화학적 변형을 나타냅니다.
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신선하고 숙성된 ZnO 나노입자의 물리화학적 특성. A Milli-Q에서 신선 및 노화된 NP(100μg/mL, 20 및 90–200nm)의 대표적인 현미경 사진 저해상도 TEM을 사용하는 물, B 신선한 NP, 오래된 NP, ZnO, Zn(OH)2의 XRD 패턴 및 Zn5 (CO3 )2 (OH)6 말린 형태의 참조
NP의 처리는 시험관 내에서 세포 모양 또는 형태에 눈에 띄는 변화를 가져옵니다[26]. 따라서 A L 72시간 동안 10 &15 µg/mL의 신선하거나 노화된 ZnO 나노입자에 노출된 세포를 입체 현미경으로 조사했습니다. 도 2에 나타난 바와 같이 대조군의 세포 형태는 정상을 유지하였다. 세포가 잘 부착되었으며 대부분 2시간 이내에 부착되었습니다. 대부분의 세포는 방추형 또는 다각형이었고, 일부 새로 분열하는 세포는 접착 과정에서 더 투명한 세포질과 더 나은 분산을 보여주었습니다. 72시간 동안 12μg/mL의 신선한 ZnO 나노입자(20nm 및 90–200nm)로 처리하면 세포 형태가 크게 변경되었습니다. 대부분의 세포는 3~5시간 이내에 부착되었지만 잘 퍼지지 않았고 일부 세포는 둥글게 되어 다각형 모양을 잃어 버렸습니다. ZnO 나노입자의 농도를 15μg/mL로 증가시키면 처리된 세포가 위축되어 부착할 수 없어 10μg/mL로 처리한 세포보다 세포 생존율이 현저히 낮음을 시사합니다. 이러한 결과는 신선한 ZnO NP에 대한 LC100이 72시간 처리에 의해 아마도 15μg/mL 미만임을 나타냅니다. 대조적으로, 20nm 및 90-200nm 노화 NP 처리 그룹(15μg/mL)의 세포 형태는 크게 영향을 받지 않았으며 대부분의 생존 세포가 부착 및 퍼질 수 있었고 반쯤 죽은 세포가 관찰되어 다음이 밝혀졌습니다. 오래된 ZnO NP는 신선한 ZnO NP보다 세포 독성이 훨씬 낮습니다.
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A의 형태 변경 L Ham's F12 배지에서 72시간 동안 신선하거나 노화된 ZnO 나노입자에 노출된 후 세포와 노출되지 않은 세포를 대조군으로 사용했습니다. A L 광학현미경으로 10 × 배율
로 세포의 형태를 관찰하였다.신선한 ZnO 나노입자와 노화된 ZnO 나노입자 사이의 세포독성 차이를 더 조사하기 위해 우리는 CCK-8 키트를 사용하여 세포 생존력을 조사했습니다. 그림 3과 같이 배양 A L 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 신선하고 노화된 ZnO 나노입자(0~20μg/mL, 20nm 및 90~200nm 범위)의 구배 용량을 가진 세포는 세포 생존력의 용량 의존적 감소를 보여주었습니다. 세포를 ZnO NPs ≤ 10μg/mL로 처리한 결과 명백한 세포독성은 관찰되지 않았습니다. 신선 및 노화된 ZnO 나노입자의 투여량이 12 및 15 μg/mL로 증가했을 때 세포 생존율은 시간 의존적 감소 경향을 보였다. 분명히, 노화된 NP 처리군의 세포 생존율은 신선한 NP 처리군보다 유의하게 더 높았다. 또한, ZnCl2 -치료는 또한 용량 및 시간 의존적 방식으로 세포 생존력을 손상시킨 반면, ZnCl2의 세포독성 신선하고 오래된 ZnO NP보다 훨씬 적습니다.
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A에서 신선하고 노화된 ZnO 나노입자에 의해 유도된 세포 생존율 L 세포. A L 세포를 다양한 농도의 신선하고 오래된 ZnO NP(20 및 90–200 nm)와 함께 24시간 동안 배양했습니다(A ), 48시간(B ) 및 72시간(C ). 디 A L 세포는 다양한 농도의 ZnCl2에 노출되었습니다. 다른 시간 동안. 데이터는 ≥ 3개의 독립적인 실험을 기반으로 했으며 평균 ± SD, *p로 표시되었습니다. <0.05
노화된 NP의 낮은 세포독성으로 이어지는 기본 메커니즘을 밝히기 위해 우리는 신선하고 노화된 ZnO NP의 RNA 시퀀싱 데이터를 분석했습니다. 그림 4A, B에서 볼 수 있듯이 신선한 ZnO 나노입자로 처리한 후 Jurkat 세포에서 세포자멸사 경로가 활성화되었습니다(p =0.017) 및 HMDM 셀(p =0.041). 세포 사멸 유전자:ANXA1 , CYLD , TNFSF10 , IER3 , CDKN1A , 준 , SAT1 , PMAIP1 , CD38 및 ISG20 신선한 ZnO NP 처리 Jurkat 세포가 상당히 풍부했습니다. 세포 사멸 유전자:CD38 , TNFRSF12A , CCNA1 , BMP2 , PPP2R5B , EREG , IFNGR1 , CD44 , CD14 , GNA15 , GCH1 , TIMP1 , BTG2 , IL1B , IL1A , BTG3 , BCL2L11 , SC5D 및 SPTAN1 신선한 ZnO NP 처리 HMDM 세포가 상당히 풍부했습니다(그림 4C, D). Jurket 세포(말초혈액 T 림프구 세포)와 HMDM 세포(인간 단핵구 유래 대식세포)는 다른 종류의 세포이기 때문에 세포 사멸을 유발하는 방식이 다를 수 있습니다. 요약하면, 이러한 결과는 신선한 ZnO 나노입자의 노출이 다양한 종류의 세포에서 서로 다른 세포자멸사 경로를 활성화할 수 있음을 보여주었습니다.
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Apoptosis 경로는 신선한 ZnO NP 처리 Jurket 및 HMDM 세포의 RNA-seq 데이터에서 풍부했습니다. 신선한 ZnO NP 처리 Jurket 세포(A ) 및 HMDM 셀(B ). 신선한 ZnO NP 처리 Jurket 세포(C ) 및 HMDM 셀(D ) 및 해당 통제 그룹
노화된 ZnO NP 처리 A의 RNA 시퀀싱 데이터 L 세포는 p53, PI3k-Akt, FoXO, 글루타티온, ErbB, HIF-1, 옥시토신 및 Jak-STAT 신호 전달 경로가 풍부함을 보여주었습니다(그림 5A). Jurket 및 HMDM 세포에 풍부한 apoptosis 유전자는 노화된 ZnO NP 처리 세포에서 유의한 영향을 받지 않았습니다(그림 5B). 결과를 더 확인하기 위해 실시간 PCR을 통해 관련 유전자의 발현을 테스트했습니다. 우리는 일부 세포 사멸 유전자가 다음과 같은 것을 발견했습니다:BMP2 , PMAIP1 , IL1α , CD69 , CCNA1 , CD38 및 IL1β 노화된 ZnO 나노입자 처리 A에서는 검출되지 않았습니다. L 아마도 이러한 유전자의 대부분이 면역계 세포에서 발현되기 때문일 것입니다. 다른 상향 조절된 세포자멸사 유전자(IL1α , IL1β 및 CD59 ) 신선한 ZnO 나노입자 처리군에서 관찰된 바와 같이 노화된 ZnO 나노입자 처리에 의한 발현 수준의 유의한 변화는 없었다. MT1 동안 양성 대조군 역할을 하는 Caspase 3의 발현 수준이 유의하게 증가했습니다. 크게 변하지 않았습니다(그림 5C). 이러한 데이터는 노화된 ZnO 나노입자가 신선한 나노입자와 달리 A에서 세포자멸사 경로 유전자를 활성화하는 데 덜 강력하다는 것을 시사했습니다. L 세포.
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세포 사멸 경로는 노화된 ZnO NP 처리 A의 RNA-seq 데이터에서 풍부하지 않았습니다. L 세포. (A ) 노화된 ZnO NP 처리 A의 풍부한 경로의 유전자 온톨로지 분석 L 세포. (나 ) 노화된 ZnO NP 처리 A의 세포자멸사 유전자 발현의 히트맵 L 세포와 대조군. (C ) 선택된 apoptotic 유전자 및 조절 유전자의 발현 (MT1 ) 신선하고 숙성된 ZnO NP 처리 A L 세포
Caspase 3 유전자 발현 검출 단독으로는 세포 사멸 경로의 활성화를 직접적으로 나타낼 수 없습니다. ZnO 나노입자 처리가 세포 사멸 단백질의 수준을 변화시킬 수 있는지 여부를 추가로 분석하기 위해, 세포 사멸의 활성화를 나타내기 위해 일반적으로 사용되는 바이오마커[27]인 절단된 Caspase 3 단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅 분석으로 조사했습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 대조군과 비교하여 신선한 ZnO 나노입자(20 nm) 처리는 절단된 Caspase 3 단백질의 세포 수준을 1.31 ± 0.023배 증가시켰으며, 이는 노화된 20 nm ZnO 나노입자보다 유의하게 높았습니다. 처리군(1.12 ± 0.039배). 신선한 ZnO 나노입자의 입자 크기를 90-200nm로 증가시켰을 때, 새로운 나노입자에 의해 유도된 절단된 Caspase 3 단백질의 발현은 1.46 ± 0.078배 증가했으며, 이는 노화된 나노입자의 발현(1.07 ± )보다 훨씬 더 컸습니다. . 이 데이터는 오래된 ZnO 나노입자와 비교하여 세포 사멸 유도에 있어 신선한 ZnO 나노입자의 더 높은 효능을 추가로 보여줍니다.
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A의 세포자멸사 수준 L 신선하고 오래된 ZnO NP(20 및 90-200 nm)와 함께 배양된 세포. 웨스턴 블로팅 분석(A ) 및 수량화(B ) 세포를 12μg/mL 신선 및 노화 ZnO NP(20 및 90–200 nm)와 함께 72시간 동안 인큐베이션했을 때 절단된 Caspase 3 단백질 수준. 데이터는 ≥ 3개의 독립적인 실험을 기반으로 했으며 평균 ± SD, *p로 표시되었습니다. <0.05
ZnO NP는 Zn5으로 물리화학적 변형을 겪는 것으로 보고되었습니다. (CO3 )2 (OH)6 Zn 2+ 출시와 함께 자연 노화 과정 동안 [23, 28]. 그러나 변형된(노화) ZnO 나노입자에 의해 유도된 세포독성과 기본 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 여기서는 신선 및 노화 ZnO 나노입자 사이의 다양한 세포독성 메커니즘을 밝히기 위해 RNA 시퀀싱 분석 및 RT-PCR 테스트를 수행했습니다. 또한 세포사멸의 핵심인자인 Caspase 3의 단백질 수준을 알아보기 위해 Western blotting을 적용하였다.
우리의 데이터는 노화된 ZnO NP가 A에서 신선한 ZnO NP보다 훨씬 적은 세포독성을 유도함을 보여주었습니다. L 세포. LC100 현재 연구에서 두 가지 신선한 ZnO NP(90–200 nm 및 20 nm)는 15μg/mL 미만이었고(그림 3), 이는 LC100 NIH-3T3 또는 MSTO 셀에 대한 19-36nm의 ZnO NP는 약 15μg/mL입니다[29]. 우리는 NP에서 물리화학적 특성의 환경적 변형이 독성을 극적으로 변경할 수 있음을 확인했습니다. ZnO 나노입자의 황화 과정은 전하, 소수성 및 응집 상태를 변화시켜 인간의 타액, 땀 및 기관지폐포 세척액에서 황화물 상태 나노입자를 흡착시키는 것으로 보고되었습니다. 그리고 ZnO 나노입자에 의해 흡착된 단백질은 생물학적 효과에 영향을 미치는 특별한 단백질 크라운을 형성했습니다[19]. 생리학적 용액(타액과 같은)에 널리 존재하는 인산염은 ZnO 나노입자를 준안정 ZnHPO로 전환할 수 있습니다.4 및 Zn3 (PO4 )2 약 5~10시간 이내에 소화관 상피세포에 세포독성을 보였다[20]. Ivask et al. 싱크로트론 방사선 X-선 흡수를 사용하여 시험관 내 노출 시스템에서 인간 T 림프구(37°C, 24시간 동안 10% FBS를 함유하는 세포 배양 배지 RPMI1640)에 대한 ZnO 나노입자(≤3μg/mL)의 완전한 변형 발생을 입증했습니다. 근연 구조 분광법(XANES). 형질전환 산물의 스펙트럼 및 세포독성은 ZnSO4의 스펙트럼과 일치했습니다. [21]. 우리의 결과는 ZnCl2의 용량 및 시간 의존적 독성을 보여주었습니다. A에게 L 세포 독성이 신선하고 오래된 ZnO NP보다 훨씬 낮습니다(그림 3). 관찰은 새로운 ZnO NP의 세포독성이 방출된 Zn 2+ 에 완전히 기인하지 않는다는 발견을 추가로 설명합니다. [30].
우리의 이전 연구는 또한 노화된 ZnO NP가 신선한 ZnO NP와 비교하여 세포를 죽이는 능력이 약화되었을 뿐만 아니라 ROS(반응성 산소 종)를 유도하는 데 더 높은 효능을 나타냄을 보여주었습니다[23]. 우리는 노화된 ZnO 나노입자에 의해 유도된 더 낮은 세포독성이 포유동물 세포에서 더 견딜 수 있다고 추론합니다. RNA 시퀀싱 데이터에 대한 현재 연구는 세포사멸 유전자가 신선한 ZnO NP 처리된 세포에서 상향 조절되었으며, 나이가 많은 NP 처리된 그룹에서는 훨씬 덜 영향을 받는 것으로 나타났습니다. IL1α 및 IL1β는 인터루킨 1 사이토카인 계열의 구성원입니다. IL1α 및 IL1β의 방출은 Caspase 8에 부분적으로 의존하는 세포자멸사를 활성화합니다[31]. CD69는 II형 막관통 수용체의 칼슘 의존성 렉틴 슈퍼패밀리의 구성원을 인코딩합니다. 증가된 CD69 발현은 apoptosis annexin V 및 CD95(Fas) 마커의 증가된 발현과 연관되었습니다[32]. JUN은 AP-1 전사 인자 소단위입니다. 증가된 JUN 활성은 인터루킨 1베타 전환 효소(ICE)의 기질인 알파-포드린과 시스테인 프로테아제의 CED-3 계열을 단백질 분해적으로 절단하여 프로그램된 세포 사멸을 추가로 유발합니다[33]. 이러한 apoptotic 유전자의 증가된 발현은 신선한 NP가 여러 가지 다른 방식으로 apoptosis를 유발한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 apoptotic 유전자 발현의 상승 후, apoptosis 과정은 결국 apoptotic 단백질에 의해 실행됩니다(그림 7). Caspase 3은 다양한 세포 사멸 시나리오의 핵심 프로테아제입니다. cleavage of this protein is necessary to activate both extrinsic and intrinsic apoptotic pathways [34, 35]. Therefore, detection of cleaved caspase 3 is a common method for identifying apoptosis induced by a wide variety of apoptotic signals [36]. Our Western blotting data revealed that, for both 20 nm and 90–200 nm ZnO NPs, sublethal exposure did not alter the level of Pro caspase 3 in all treatment groups. In contrast, cleaved Caspase 3 was significantly elevated by fresh NPs treatment, where aged NPs showed few (if any) effects on the level of cleaved caspase 3 (Fig. 6). Combined with RNA expression analysis, our results clearly elucidated the higher potency of fresh ZnO NPs in inducing cell apoptosis.
Model for Fresh ZnO NPs but not aged ZnO NPs induces Caspase 8- and Caspase 3-dependent apoptosis. The increased expression of apoptotic gene CD69 activates Fas and apoptosis annexin V expression in fresh ZnO NP-exposed mammalian cells. The increased expression of apoptotic gene IL1α and IL1β partially activates Caspase 8-dependent apoptosis. It further causes activation of Caspase 3 and induces apoptosis. All these changes in mRNA and protein level were not detectable in aged ZnO NPs-exposed mammalian cells
In the present study, the natural physicochemical transformation of ZnO NPs in ultrapure water was confirmed, and variations in cytotoxicity induced by fresh &aged NPs were investigated. We focused on RNA sequencing data from our aged ZnO NP-treated A L cells and that of fresh NPs from database. We compared those signaling pathway specifically enriched in aged NP-treated group, which are different from that of fresh NP- or ZnCl2 -treated groups. Our data indicated that the lower cytotoxicity of aged ZnO NPs is closely related to its attenuated ability in inducing apoptosis, while the transcriptional regulation of the multiple pathways activated by NPs promotes the establishment of cellular homeostasis in mammalian cells.
해당 없음.
Nanopowders
산화아연
Hydrozincite
Zinc hydroxide
Zinc chloride
Zinc sulfide
Zinc hydrogen phosphate
Zinc phosphate
Human–hamster hybrid cells
Chinese hamster ovary cells
Peripheral blood T lymphocyte cells
Human monocyte-derived macrophages
Mouse embryonic cells
Human lung cancer cells
Roswell Park Memorial Institute 1640
Interleukin 1beta-converting enzyme
Caenorhabditis elegans death gene
Interleukin 1alpha
Interleukin 1beta
Messenger ribonucleic acid
Complementary deoxyribonucleic acid
태아 소 혈청
투과전자현미경
X선 회절
Real-time polymerase chain reaction
The Nanotechnology Consumer Product Inventory
Synchrotron radiation X-ray absorption near-edge structure spectroscopy
Radio immunoprecipitation assay
Polyacrylamide gel electrophoresis
폴리불화비닐리덴
Enhanced chemiluminescence
세포 계수 키트-8
나노물질
초록 두 가지 다른 구조 촉진제가 있는 열수 조건에서 염화철 용액으로부터 적철광 나노입자의 성장을 제어하는 것은 사진을 매핑하기 위한 PiFM(Photo induced force microscopy)의 첫 번째 보고서를 포함하여 다양한 구조 및 분광 기술을 사용하여 연구되었습니다. 개발 중인 나노입자에 대한 구조 지시제의 지형 분포. 우리는 ~6 × 10−3으로 결정된 한계까지 인산염 이온의 농도를 사용하여 나노 입자의 모양을 제어할 수 있음을 보여줍니다. 몰. Akaganéite(β-FeOOH)는 구조 지시자가 없을 때 형성
초록 나노기술은 과학의 모든 분야에서 중요한 응용으로 가장 유망한 연구 분야가 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 산화주석은 나노미터 범위에서 이 물질의 합성으로 개선된 매혹적인 특성으로 인해 엄청난 주목을 받았습니다. 오늘날 주석 산화물 나노 입자를 생산하기 위해 수많은 물리적 및 화학적 방법이 사용됩니다. 그러나 이러한 방법은 고가이고 높은 에너지를 필요로 하며 합성 과정에서 다양한 유독성 화학물질을 사용한다. 인간의 건강 및 환경적 영향과 관련된 증가된 우려는 생산을 위한 비용 효율적이고 환경 친화적인 공정의 개발로 이어졌습니다
