PI3K/AKT 경로 조절에 의한 세포자멸사 유발을 통한 비소세포 폐암의 시너지적 광열/광역학 치료를 위한 CoFe2O4-양자점

초록

비소세포폐암(NSCLC)은 전 세계적으로 두 번째로 많이 진단되는 악성 종양이 되었습니다. 암 치료 전략을 개발하기 위해 나노물질을 찾는 데 대한 장기적인 관심으로 여기에서 새로운 CoFe₂를 구성했습니다. O₄ - 명백한 독성 없이 NSCLC를 효율적으로 억제하는 탁월한 시너지적 광열/광역학적 특성을 가진 양자점(QD). 우리는 CoFe₂의 조합이 O₄ -QDs + NIR 처리는 NSCLC 세포의 세포자멸사를 유도합니다. 또한 CoFe₂ O₄ -QDs + NIR 처리는 또한 PI3K/AKT 경로 조절을 통해 세포 사멸을 유발하는 활성 산소 종 생성을 촉진합니다. 또한 CoFe₂ O₄ -QDs + NIR 치료는 명백한 독성 효과 없이 생체 내에서 종양 이종이식을 성공적으로 제거합니다. 종합하면, 우리는 새로운 나노물질 CoFe₂ O₄ -QD는 NSCLC 치료를 위한 유망한 광과민제가 될 수 있는 독성 없이 NSCLC를 죽이는 데 향상된 시너지적 광열 요법 및 광역학 요법 효과를 나타낼 수 있습니다.

소개

암은 2020년 사망원인 1위이자 가족과 사회에 큰 부담을 안겨주고 있으며, 그 중 폐암은 2020년 암 진단률 2위, 암 관련 사망 1위를 차지하고 있다[1, 2]. 보고된 바와 같이 전체 폐암의 약 85%를 차지하는 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)은 발병률과 사망률이 높은 것이 특징이다[3, 4]. 최근에는 수술적 선택에도 불구하고 비소세포폐암을 치료하기 위한 화학요법 또는 면역요법의 개발에 많은 노력을 기울이고 있다. 예를 들어, EGFR 돌연변이 억제제와 KRAS 억제제가 효과가 입증되었으며 더 많은 새로운 ALK 억제제가 진행 중입니다[5,6,7,8,9]. 이러한 면역 체크 포인트 억제제인 항-PDL1 및 항-CLTA4는 또한 유망한 효능을 가져오고 생존 이점을 연장시킨다[10,11,12]. 그러나 이들 약물에 대한 반응률은 환자마다 다르며 부작용, 특히 약물 내성을 간과해서는 안 된다[13, 14]. 따라서 덜 침습적인 새로운 치료 전략을 개발하는 것은 NSCLC 연구 및 임상 치료를 위해 시급하고 또한 필요합니다.

최근의 진전을 바탕으로 나노물질을 이용하여 광열치료(PTT)와 광역학치료(PDT)를 수행하는 것은 엄청난 주목을 받았고 항암 전략으로 큰 발전을 이루었고 임상 치료의 대안이 될 수 있다[15,16,17, 18]. 나노물질 기반 PTT 및 PDT는 침습이 적고 독성이 낮아 약물 내성을 유발할 가능성이 거의 없는 것이 특징이다[19,20,21,22,23]. 주로 근적외선과 같은 빛의 협력으로 국소화된 나노물질은 종양 내 온도를 높이고 산소를 세포독성 활성산소종(ROS)으로 전환하여 종양을 제거하기 위해 세포 사멸을 일으킬 수 있습니다[24]. 이러한 맥락에서 나노물질은 효능에 영향을 미치고 안전성을 보장하는 핵심적인 역할을 한다. 이러한 나노물질에는 금속 나노구조[25], 탄소 기반 물질[26, 27], 고분자 나노입자(PNPs)[28], 반도체 화합물[29] 등이 있지만, 그 자체로 한계가 있다. 예를 들어, 탄소 기반 재료는 비용이 많이 들고 현탁 특성이 만족스럽지 않아 대규모 적용 및 임상 가능성을 제한합니다. 따라서 더 많은 사용을 위해 더 적합한 나노물질을 생성하기 위해 더 많은 시도를 해야 합니다.

최근 몇 년 동안 새로운 나노 물질로서 양자점(QD)은 우수한 생체 적합성, 용해도 및 가장 중요한 우수한 광안정성 및 손쉬운 표면 기능화 특성으로 인해 생물 의학 응용 분야에서 큰 관심을 받고 있습니다[30,31,32, 33]. 이러한 특성을 이용하여 여러 보고서에서 QD를 새로운 PDT 시약으로 사용했으며 암 치료에서 PDT의 효능을 향상시키기 위해 다른 생체 분자와 함께 사용하도록 설계할 수 있습니다. 예를 들어 Meng과 동료들은 다기능 GQD@MnO₂를 보고했습니다. PDT 효능을 향상시키기 위해 2광 여기(two-photo excitation)에 의해 유도된다[34]. 또한 Kuo와 동료들은 PDT 효율성을 향상시키는 아미노 분자로 기능화하여 질소 도핑된 QD를 생성했습니다[35]. 이러한 흥미로운 발견에 영감을 받아 우리는 하나의 나노 시스템에서 PTT 및 PDT 시너지 효과를 가져올 수 있는 비귀금속 기반 나노 물질과 결합된 새로운 QD를 개발하고자 했습니다. 예를 들어, Co 기반 나노물질은 잘 연구된 비귀금속 기반 나노물질로, 종양 치료 또는 영상화를 위한 PTT 제제로 사용되는 것으로 알려져 있다[36]. 따라서 Co 기반 QD를 설계하면 PTT/PDT 시너지 효과가 향상될 수 있다고 제안했습니다.

이 연구에서 우리는 새로운 나노 물질 CoFe₂를 합성했습니다. O₄ - 시험관 내 및 생체 내에서 독성 효과 없이 NSCLC 사멸에 대한 강화된 PTT 및 PDT 상승 효과를 나타내는 QD는 NSCLC 치료를 위한 유망한 감광제가 될 수 있습니다.

자료 및 방법

CoFe의 합성₂ O₄ -QD

CoFe₂ O₄ -QD는 열수법을 통해 합성되었습니다. 일반적으로 0.238g CoCl₂ ·6H₂ O 및 0.808g Fe(NO₃ )₃ ·9H₂ O는 10mL H₂에 용해되었습니다. O 및 10mL의 프로필렌 글리콜 혼합물 용매를 넣은 다음 10분 동안 교반합니다. 그런 다음 용액에 디트라놀아민 4mL를 한 방울씩 첨가하고 30분 동안 교반했습니다. 그런 다음 얻은 슬러리를 50mL 스테인리스 테플론 라이닝된 오토클레이브에 변환했습니다. 오토클레이브는 오븐에서 3시간 동안 160℃로 유지되었습니다. CoFe₂ O₄ -QD를 8500rpm에서 10분 동안 원심분리하여 수집한 다음 탈이온수와 에탄올로 연속적으로 헹굽니다. 이 연구에 사용된 시약 및 재료는 표 1에서 찾을 수 있습니다.

<그림>

CoFe의 특성₂ O₄ -QD

준비된 CoFe₂의 형태 및 크기 O₄ -QD는 TEM 및 EDS 시스템에 의해 결정되었습니다. 결정 구조는 Cu Ka 방사선(k =0.15406nm). CoFe₂의 흡광도 스펙트럼 O₄ -QDs는 SHIMADZU UV-2600 분광 광도계에 의해 검출되었습니다. CoFe₂의 원소 원자가 상태 O₄ -QD는 X선 광전자 방출 분광법 측정(XPS, VG ESCALAB 220I-XL, USA)에 의해 결정되었습니다. 열화상은 적외선 열화상 카메라(FLIR E50, USA)로 촬영한 것입니다.

세포 배양

NSCLC 세포주 NCI-H460(H460) 및 A549 및 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 ATCC에서 입수하고 미세 혈장 음성에 대해 테스트했습니다. H460 및 A549 세포는 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 RPMI-1640에서 배양되었습니다. HUVEC를 내피 세포 성장 배지(Sigma, #211-500)에서 배양하였다. 모든 세포를 5% CO₂가 있는 암습한 37℃ 인큐베이터에 보관했습니다. .

세포독성 검출

CoFe₂의 다양한 작업 농도(0.1, 0.5, 1.0, 2.0 mg/mL) O₄ -QD를 추가하고 24시간 동안 HUVEC와 함께 배양했습니다. 인큐베이션 후, 배양 배지를 교체하고 CCK-8 시약을 각 웰에 첨가한 후 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 EnSpire™ Multimode Plate Reader를 사용하여 450nm에서 플레이트를 측정했습니다. 세포 생존율의 비율은 대조군 HUVEC에서 100%로 취했습니다.

아폽토시스 분석

H460 및 A549 셀(2 × 10⁵ ) 1.0 mg/mL CoFe₂로 처리하기 전에 6웰 플레이트에서 밤새 배양했습니다. O₄ - 5분 동안 808nm의 NIR 레이저와 결합된 QD. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 세포를 세척하고 Annexin-V/PI apoptosis kit(BD; #556547)로 염색했습니다. HUVECs apoptosis assay의 경우, HUVECs는 CoFe₂ 농도를 다르게 하여 배양되었습니다. O₄ -QD. apoptosis ratio는 위와 같이 결정하였다.

셀룰러 ROS 감지

H460 및 A549 세포를 6웰 플레이트에서 밤새 배양하였다. 세포를 1시간 동안 1.0mg/mL의 유무에 관계없이 배양하고 5분 동안 808nm의 NIR 레이저로 처리했습니다. 처리 후, DCFH-DA를 첨가하고 30분 동안 배양한 후 485nm/535nm에서 여기/방출로 FACS 검출을 수행했습니다. ROS inhibitor assay는 제조사의 지시에 따라 ROS inhibitor NAC(Sigma; A7250)를 첨가하였다. Flow-jo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 추가로 정량화했습니다.

서부 얼룩 분석

H460 및 A549 세포를 세포자멸사 분석으로 처리하고, RIPA 용해 완충액을 사용하여 전체 세포 단백질을 추출하였다. Western blot 검출은 앞에서 설명한 대로 수행되었습니다[37]. 이 연구에 사용된 항체는 다음과 같습니다:토끼 다클론 항-Bcl-2(abcam; ab59348), 토끼 단클론 항-Bax(abcam; ab32503), 토끼 다클론 항-P -PI3K(Bio-Vision; 3152-100), 토끼 모노클로날 항P -AKT-S473(CST; 4060S), 토끼 모노클로날 항-β-액틴(CST; 4970S), 항 토끼 IgG HRP 연결 항체(CST; 7074S). 정량은 Image-J 소프트웨어를 사용하여 결정되었습니다.

CoFe 조합의 항 NSCLC 효과에 대한 생체 내 연구₂ O₄ 및 NIR 처리

CoFe₂의 종양 사멸 능력을 확인하려면 O₄ -QD, H460 세포에 50% MatriGel을 NSG 마우스에 피하 이식했습니다(N =8 각 그룹). 모든 생체 내 실험을 위해 4-6주령 수컷 M-NSG 마우스를 Shanghai Model Organisms(#NM-NSG-001)에서 얻었다. 종양이 시각화되고 부피가 거의 5mm × 5 mm에 도달하면 모든 마우스를 대조군, NIR 전용, CoFe₂로 명명된 4개의 그룹으로 무작위로 나누었습니다. O₄ -QD 전용 및 CoFe₂ O₄ -QDs + NIR 그룹, 각각. 그런 다음 CoFe₂의 마우스 O₄ -QD 전용 및 CoFe₂ O₄ -QDs + NIR 그룹에 50 μL의 CoFe₂를 종양 내 주사했습니다. O₄ (5.0 mg/kg)은 우리의 이전 작업[37]을 기반으로 하는 반면 대조군과 NIR 그룹에는 50μL의 PBS가 주입되었습니다. 주입 후 NIR 808nm 레이저(1W/cm² ) NIR 및 CoFe₂에서 수행되었습니다. O₄ -QDs + NIR 그룹을 10분 동안 적외선 열화상 장비로 모니터링했습니다. 종양 부피를 매일 기록하고 V 공식으로 계산했습니다. =길이 × 너비² /2. 나머지 마우스에서 종양 이종이식편의 직경이 거의 15mm에 도달하면 마우스를 희생시키고 종양 이종이식편의 사진을 찍고 추가 검출을 위해 보관했습니다. 모든 동물 실험과 프로토콜은 베이징 대학 심천 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)와 동물 복지 위원회의 승인을 받았습니다.

H&E 및 면역조직병리학 염색 분석

병리학적 평가를 위해 종양 이종이식편(N =3) 각 그룹에서 처리 하루 후 수확한 다음 H&E 염색 및 IHC 검출을 위해 파라핀에 포매한 후 10% 완충 포르말린에 고정했습니다. 생체 내 독성 평가를 위해 마우스의 신장, 간, 폐, 심장 및 비장을 적출하고 병리학적 평가를 위해 고정하였다. IHC 염색을 위해 항-Ki67 항체(Abcam; ab15580)를 사용하였다. IHC 양성 영역의 정량화는 소프트웨어 피지에 의해 수행되었습니다.

통계 분석

모든 실험에 대해 "N "는 그림 범례에 표시된 반복 횟수 또는 사용한 마우스의 수를 나타냅니다. 학생의 t - 검정 또는 일원 ANOVA가 통계적 비교를 위해 사용되었습니다. 피 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되고 "ns"는 유의하지 않음을 표시합니다. 피 <0.05, 피 <0.01 및 P <0.001은 각각 "*", "**" 및 "***" 별표로 표시됩니다. 데이터는 GraphPad Prism 5를 사용하여 분석되었습니다.

<섹션 데이터-제목="결과">

결과

신규 CoFe의 특징₂ O₄ -QD

먼저 CoFe₂를 구성했습니다. O₄ -저비용으로 수행하기 쉬운 열수 접근법을 사용하는 QD. CoFe₂의 TEM 이미지 O₄ -QD는 그림 1a에 표시되어 직경이 약 3.4nm인 균일하고 안정적인 패턴을 나타냅니다(그림 1b). 준비된 CoFe₂ O₄ -QD는 짙은 갈색이며(그림 1b) 물에 대한 용해도가 우수합니다. 또한, (222)의 격자 간격을 표시하는 고해상도 TEM 이미지(그림 1c)는 CoFe₂의 결정 매개변수와 일치하는 약 0.242nm입니다. O₄ -QD[38, 39]. 또한, 원소 스펙트럼(그림 1d)은 CoFe₂의 원소 성분을 추가로 확인했습니다. O₄ -QDs는 Co와 Fe이고, Co와 Fe의 원자비는 약 1:2였다. 이 데이터는 CoFe₂의 성공적인 구성을 보여주었습니다. O₄ -추가 연구를 위한 QD.

<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-021-03580-5/MediaObjects/ 11671_2021_3580_Fig1_HTML.png?as=webp">

CoFe₂의 준비 및 특성화 O₄ -QD. 아 준비된 CoFe₂의 대표 TEM 이미지 O₄ -QD. 스케일 바, 20nm ㄴ CoFe₂ 크기에 대한 글로벌 분석 O₄ -평균 직경이 3.4nm인 QD. 삽입은 CoFe₂의 대표적인 디지털 사진입니다. O₄ -QD 서스펜션. ㄷ 준비된 나노결정의 격자 무늬는 CoFe₂에 해당합니다. O₄ -QDs HRTEM 이미지. 스케일 바, 2nm d 준비된 CoFe₂ O₄ -QD는 Co, Fe 및 O의 균일한 분포를 나타냅니다. 대표적인 원소 맵을 표시했습니다.

CoFe의 물리적 특성 감지₂ O₄ -QD

준비된 CoFe₂의 물리적 특성을 결정하기 위해 O₄ -QD, 우리는 건설 후 몇 가지 감지를 수행했습니다. NIR 흡광도 측정 테스트로 CoFe₂ O₄ -QD는 농도 의존적 방식과 온도 증가(ΔT ) 0.3에서 18.9°C까지 조정할 수 있습니다(그림 2a). 또한 농도 1.0mg/mL의 CoFe₂에서 O₄ -QD, NIR 복사 전력을 0.5에서 2.0W/cm² 으로 증가 , ΔT는 0.8에서 24.3°C까지 조정할 수 있습니다(그림 2b). 이 데이터는 CoFe₂의 광열 변환 성능이 O₄ -QD는 농도와 조사력에 따라 달라졌습니다. 또한 CoFe₂의 안정성 O₄ -QD 트리거 광열 변환은 기간 조사로 결정되었습니다(그림 2c). 계산된 광열 변환 효율은 7.18%(그림 2d)이지만 CoFe₂의 PDT 효과를 향상시키기에 충분합니다. O₄ -QD. 또한 CoFe₂의 가장 긴 파장 O₄ -QD는 약 808nm의 빛을 흡수할 수 있습니다(그림 2e, f). 종합하면 이 데이터는 CoFe₂ O₄ -QD는 대체 종양 사멸 요법을 위한 유망한 PTT/PDT 상승 작용제로 개발될 수 있습니다.

<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-021-03580-5/MediaObjects/ 11671_2021_3580_Fig2_HTML.png?as=webp">

CoFe₂의 특성 평가 O₄ -QD. 아 CoFe₂의 광열 변환 O₄ -QD는 다른 농도에서 결정되었습니다. 가열 곡선이 표시됩니다. ㄴ CoFe₂의 조사 에너지 의존 방식 O₄ -QD는 다양한 전력 밀도(0.5–2.0 W/cm² )에서 표시됩니다. ). ㄷ CoFe₂ O₄ -QD는 가열-냉각 연속 조사(1.0W/cm² )의 4주기로 감지된 안정적인 광열 변환을 가지고 있습니다. ). d CoFe₂의 효율성 O₄ -QDs 광열 변환. 이 , f CoFe₂의 파장과 흡광도의 관계 O₄ -QD

CoFe의 세포독성 평가₂ O₄ -정상 세포에 대한 QD

나노입자는 종양 치료를 위한 약물 전달 또는 매체 내로 널리 사용되기 때문에 CoFe₂의 세포 독성 O₄ -정상 세포, 특히 인간 혈관 상피 세포에 대한 QD는 추가 사용을 위해 확인되어야 합니다. 따라서 이전 결과에서 CoFe₂의 다양한 농도(0.1, 0.5, 1.0 및 2.0mg/mL)를 테스트했습니다. O₄ -QD. HUVEC(정상 인간 상피 세포주)와 공배양한 후, 세포 생존력의 검출을 위해 CCK-8 시약을 첨가하였다. 대조군과 비교하여 명백한 세포독성은 관찰되지 않았다(그림 3a). 이와 관련하여 동일한 조건에서 일관된 결과를 얻기 위해 추가 세포자멸사 분석을 수행했습니다(그림 3b). 세포 사멸 비율의 정량화는 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았다(그림 3c). 이 데이터는 CoFe₂ O₄ -QD는 정상 세포에 명백한 독성 효과가 없었으며, 이는 CoFe₂ O₄ -QD는 약물 전달의 매개체로 사용될 가능성이 있습니다.

<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-021-03580-5/MediaObjects/ 11671_2021_3580_Fig3_HTML.png?as=webp">

CoFe₂의 세포 독성에 대한 시험관 내 평가 O₄ -정상 세포에 대한 QD. 아 다양한 농도의 CoFe₂에서 HUVEC에서 CCK-8 세포 생존력 분석을 수행했습니다. O₄ -QD. 대조군의 생존율은 100%로 하였다. 데이터는 평균 ± SD, N으로 표시되었습니다. =3. b HUVEC의 세포자멸사는 FACS 검출에 의해 결정되었다. 표시된 농도의 대표적인 이미지가 표시됩니다. N =3. ㄷ 세포 사멸 비율의 정량화. 대조군과 비교하여 무의미함을 보였다. 데이터는 평균 ± SD

로 표시되었습니다.

NIR과 CoFe의 조합₂ O₄ -QD는 NSCLC의 세포자멸사를 유도합니다.

CoFe₂의 잠재적인 NSCLC 암 사멸 능력을 결정하기 위해 O₄ -QDs, NIR 레이저(808 nm) 조사는 CoFe₂ 배양과 함께 수행되었습니다. O₄ -시험관내 양자점. 그런 다음 처리 후 apoptosis assay를 수행한 결과, H460과 A549 세포 모두 CoFe₂의 조합으로 공격적인 apoptosis 비율을 나타냈습니다. O₄ -QD 및 NIR 레이저(그림 4a, b). CoFe₂ 인 반면, 정량화는 대조군에 비해 유의한 차이를 보였다. O₄ -QDs only 또는 NIR only 그룹은 CoFe₂임을 나타내는 차이를 나타내지 않았습니다. O₄ -QD와 NIR은 항 NSCLC 효과를 유발할 수 있습니다(그림 4a, b). Bcl-2/Bax의 단백질 수준의 변경은 세포가 apoptosis를 겪을지 여부를 결정하는 데 중요하다는 것은 잘 알려져 있습니다[40]. 이 아이디어와 일치하게 Bcl-2와 Bax의 단백질 수준은 처리 후 H460 및 A549 세포 모두에서 결정되었습니다(그림 4c, d). 참고로 미토콘드리아가 매개하는 세포사멸의 표지자로 여겨지는 Bcl-2/Bax의 비율이 감소한 것으로 나타났다. 따라서 우리는 CoFe₂ O₄ -QDs와 NIR은 미토콘드리아 매개 세포자멸사 경로를 활성화하여 항 NSCLC 효과를 일으킵니다.

<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-021-03580-5/MediaObjects/ 11671_2021_3580_Fig4_HTML.png?as=webp">

CoFe₂의 시험관 내 조합 O₄ -QD 및 NIR은 NSCLC 세포자멸사를 유도합니다. 아 , b H460 및 A549 NSCLC는 CoFe₂ 조합으로 처리되었습니다. O₄ - 5분 동안 QD 및 NIR 레이저 아폽토시스 세포는 Annexin-V 염색에 의해 평가되었고 FACS에 의해 검출되었다. 정량화도 각각 표시됩니다. 데이터는 평균 ± SD, N으로 표시되었습니다. =3. **피 <0.01 대 대조군, NIR, CoFe₂ O₄ 여러 떼. ㄷ , d Bcl-2 및 Bax의 단백질 수준은 처리 후 NCI-H460 및 A549 NSCLC에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정되었습니다. 대표 이미지가 표시됩니다. 정량은 내부 대조군 β-액틴의 발현을 보정한 후 표시됩니다. 데이터는 평균 ± SD, N으로 표시되었습니다. =3. *피 <0.05 대 대조군, NIR, CoFe₂ O₄ 그룹

CoFe의 조합₂ O₄ -QD 및 NIR은 PI3K/AKT 경로를 통해 ROS 생성을 유도합니다.

미토콘드리아 기능 장애는 항상 ROS 생성 수준을 상향 조절하여 NSCLC에서 세포 사멸을 유발합니다. 이러한 맥락에서 우리는 CoFe₂ 이후에 ROS 감지를 수행했습니다. O₄ - H460 및 A549 세포에서 QD + NIR 처리. 결과는 복합 그룹에서 ROS의 엄청난 방출을 보여 주었으며, 이는 향상된 PDT 효과가 CoFe₂에 의해 유도될 수 있음을 나타냅니다. O₄ - 낮은 광열 전달 효율에도 QDs(추가 파일 1:그림 S1A, B). 또한, PI3K/AKT 신호전달 경로의 관련 단백질 수준도 감소했는데, 이는 ROS의 변경이 PI3K/AKT 경로에 의해 조절되어 Bcl-2/Bax 단백질 발현 수준의 변경을 유도함을 시사합니다(그림 4c, d, 추가 파일 1:그림 S1C, D). 이 아이디어를 확인하기 위해 ROS 억제제 NAC를 추가하여 현상을 역전시켰습니다(그림 5a, b). 그런 다음 NAC 처리 후 PI3K/AKT의 발현이 회복되는 것으로 확인되었으며, 이는 CoFe₂ 이후에 ROS가 방출됨을 추가로 확인했습니다. O₄ -QD와 NIR 치료는 PI3K/AKT 경로에 의해 조절되었습니다(그림 5c, d). 이러한 결과는 CoFe₂의 조합이 O₄ -QD와 NIR은 미토콘드리아 기능 장애(ROS) 의존성 세포자멸사를 유도하여 NSCLC 세포를 죽이는 데 시너지 효과를 내는 PTT 및 PDT 효과를 유발할 수 있습니다.

<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-021-03580-5/MediaObjects/ 11671_2021_3580_Fig5_HTML.png?as=webp">

CoFe₂의 조합 O₄ -QD 및 NIR은 PI3K/AKT 경로 조절을 통해 ROS 생성을 유도합니다. 아 , b NCI-H460 및 A549 NSCLC는 CoFe₂로 처리되었습니다. O₄ - 5분 동안 NAC가 있거나 없는 QD 및 NIR 레이저 ROS 수준은 FACS에 의해 검출되었고 평균 형광 강도는 각각 정량화되었다. 데이터는 평균 ± SD, N으로 표시되었습니다. =3. **P <0.01. ㄷ , d P의 단백질 수준 -PI3K 및 P -AKT는 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정되었다. 대표 이미지가 표시됩니다. N =3

CoFe의 조합에 대한 생체내 항-NSCLC 평가₂ O₄ -QD 및 NIR

시험관 내 결과를 기반으로 다음으로 CoFe₂의 항 NSCLC 효과를 조사했습니다. O₄ - NSCLC 종양 보유 마우스 모델에 대한 QD 및 NIR 조합 치료. M-NSG 마우스에 H460 세포를 피하 이식했습니다. CoFe₂를 종양 내 주사한 후 O₄ -QDs, NIR 레이저 조사는 열 감지 장비의 모니터 아래에서 약 56 °C까지 급격한 온도 상승을 일으켰습니다(그림 6a, b). 또한, 조직병리학적 염색은 CoFe₂ O₄ -QD와 NIR 처리는 종양 제거의 결과로 종양 세포 사멸을 유발했습니다(그림 6c, d). 추가 IHC 염색은 또한 치료된 종양 이종이식편이 더 이상 증식할 수 없음을 나타내는 조합 치료 후 다른 그룹에 비해 Ki-67 양성 영역이 공격적으로 축소되었음을 보여주었습니다(추가 파일 2:그림 S2A, B). 다음으로 CoFe₂ 이후 12일 동안 후속 조치를 취했습니다. O₄ -QD 및 NIR 처리. 예상대로 다른 그룹의 종양 이종이식편의 크기와 무게는 현저하게 증가하지만 CoFe₂에서는 그렇지 않습니다. O₄ -QDs 및 NIR 치료 그룹(그림 6e, f), CoFe₂ O₄ -QD와 NIR 병용 치료는 생체 내에서 종양 이종이식을 완전히 제거할 수 있습니다. CoFe₂의 세포독성 효과에 대해 O₄ -QDs, 적어도 우리의 관찰 기간 동안, 마우스의 중요 기관 내에서 조직 병리학 분석의 결과로부터 명백한 부작용이 검출되지 않았다(추가 파일 2:그림 S2C). 위 데이터는 CoFe₂ O₄ -QD는 NSCLC 치료를 위한 새로운 PTT/PDT 시약으로 개발될 수 있습니다.

<그림><그림><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-021-03580-5/MediaObjects/ 11671_2021_3580_Fig6_HTML.png?as=webp">

CoFe₂ 조합의 생체 내 종양 사멸 평가 O₄ -QD 및 NIR 처리. 아 NCI-H460 종양 이종이식편이 있는 M-NSG 마우스의 대표적인 적외선 열화상이 표시됩니다. ㄴ 온도 곡선은 NIR 조사 하에서 종양 이종이식편 내에서 증가하는 온도를 보여줍니다. ㄷ 각 그룹의 H&E 병리학적 염색은 처리 1일 후에 촬영되었습니다. 병용군에서 명백한 괴사가 관찰될 수 있었다. 대표 이미지가 표시됩니다. N =3. d 마우스가 희생된 후 각 그룹의 이종이식편 사진, N =5. 이 , f 각 그룹의 종양 이종이식편의 성장 곡선과 무게를 기록했습니다. 데이터는 평균 ± SD, N으로 표시되었습니다. =5. ***P <0.001

토론

최근 몇 년 동안 항 NSCLC 전략 개발에 대한 연구는 엄청난 진전을 이뤘습니다. 특정 돌연변이 종양유전자 중독 NSCLC를 표적으로 하는 정밀 의학과 면역 관문 차단 요법 모두 임상 치료에서 유망한 미래를 가져옵니다[41, 42]. 그러나 종양 미세 환경의 복잡성과 이질성, 종양 항원 소실의 근본적인 위험을 고려할 때 면역 회피 상태에 따라 약물 내성률을 낮추는 것이 병목 현상으로 남아 있으며, 이는 단기간에 종양 재발을 초래합니다. 따라서 NSCLC 치료법을 위한 새로운 치료법이나 매개체를 찾는 것이 시급합니다. 새로운 접근 방식 중에서 나노 물질은 효과적인 암 살해 물질로 평가되고 전면에 나열되었습니다. 작은 크기, 우수한 생체 적합성 및 열 전달 능력을 이용하여 최근 연구에서 여러 나노 물질이 우수한 암 사멸 능력을 발휘합니다[43].

우리 연구에서 우리는 새로운 CoFe₂를 개발했습니다. O₄ - 상승적인 PTT 및 PDT 효과로 종양 세포 사멸을 유도함으로써 NSCLC 치료를 위한 중간체로 적용될 수 있는 양자점. 다른 나노물질과 마찬가지로 CoFe₂ O₄ -QD는 정상 세포 및 주요 장기에 대해 명백한 독성을 나타내지 않는 우수한 생체 적합성을 우리 연구에서 나타냈습니다. 열전달율이 다른 나노물질에 비해 높지는 않지만 CoFe₂에는 충분합니다. O₄ -QD는 NIR 레이저 활성화 하에서 암세포의 세포자멸사를 유도합니다. CoFe₂ O₄ -QD는 이 연구에서 흡광도와 좋은 선형 관계를 보여주고 NIR 레이저의 조합으로 잠재적으로 ROS를 생성하여 CoFe₂ O₄ -QD는 유리한 감광제로 작용할 수 있습니다. 다음으로 구조를 더욱 최적화하거나 CoFe₂에 열에 민감한 요소를 추가할 수 있습니다. O₄ - 더 나은 시너지 PTT 및 PDT 효과를 위해 더 높은 열 투과율에 도달할 수 있는 QD [44, 45]. 또한 CoFe₂ 표면에 화학약품이나 항체를 도포하여 O₄ -QD도 가능하여 우수한 살상 효율을 가져올 수 있습니다. 예를 들어, 항-PDL1 또는 항-CTLA4 항체를 CoFe₂에 연결하는 접근 방식 O₄ -QD는 CoFe₂를 완전히 사용하는 우리의 다음 관심사인 종양 내 면역 억제 미세 환경을 파괴하는 유망한 조합 요법이 될 수 있습니다. O₄ -QD.

게다가 CoFe₂의 메커니즘 O₄ - NSCLC를 죽이는 QD도 이 연구에서 설명되었습니다. CoFe₂ O₄ -QD는 NIR 레이저가 시너지 PDT 및 PTT 효과를 활성화한 후 주로 ROS 분비를 통해 NSCLC 세포자멸사를 유도했습니다. 과도한 ROS 생성은 종양 세포의 산화 스트레스를 유발하고 DNA 손상을 직접 유발하여 하향 신호 경로를 활성화한 다음 종양 세포의 사멸을 유도합니다[46, 47]. 그 중 PI3K/AKT 경로가 세포 ROS에 의해 조절될 수 있고 미토콘드리아 기능 장애를 유발할 수 있다는 증거가 증가하고 있습니다[48, 49]. 활성화되면 AKT가 PI3K에 의해 인산화되고 따라서 pro-apoptotic protein Bax가 비활성화되고 세포가 apoptosis로부터 보호된다는 것은 잘 알려져 있습니다. 또한 인산화된 AKT는 세포 생존을 조절하는 MDM2/p53 복합체를 안정화시킬 수도 있습니다[50]. 이러한 맥락에서 CoFe₂에서 이러한 경로의 역할은 O₄ -QDs 유도 ROS 분비를 조사했습니다. 예상대로 CoFe₂로 인한 과도한 ROS O₄ -QD는 PI3K/AKT 경로의 발현을 유의하게 하향조절하여 Bax를 활성화하지만 Bcl-2 단백질을 비활성화함으로써 종양 세포의 세포자멸사를 유발합니다. 이 발견은 PI3K/AKT 발현을 역전시키고 ROS 생성을 감소시키는 ROS 억제제를 첨가함으로써 더욱 확인되었다. PI3K/AKT 경로는 특히 암세포에서 세포의 생존과 사멸을 조절하는 것으로 알려져 있기 때문에 이러한 CoFe₂ O₄ - NSCLC를 죽이는 QD는 병용 요법에 대한 더 많은 옵션을 개발하는 데 도움이 될 것입니다.

요약하면, 대체 종양 사멸 요법을 위한 새로운 감광제를 개발하기 위해 우리는 CoFe₂를 성공적으로 구축했습니다. O₄ -본 연구에서는 저렴하고 쉬운 방법으로 열수 접근법을 사용하여 QD. CoFe₂ O₄ -QD는 넓은 NIR 흡광도, 우수한 생체 적합성 및 광열 변환 능력을 가지고 있습니다. 또한 이전에 보고된 QD에 비해 CoFe₂ O₄ -QD는 NSCLC 종양을 죽이는 데 상승적인 PTT/PDT 효과를 나타냈으며, 이는 NSCLC의 추가 광선 요법에서 유망한 다기능 제제를 나타냅니다. 또한 NIR 조사로 CoFe₂ O₄ -QD는 주로 상류 PI3K/AKT 신호 전달 경로를 통해 Bcl-2/Bax 발현을 조절함으로써 ROS 생성을 유도함으로써 NSCLC를 죽일 수 있습니다. 생체 내 종양 사멸 능력은 CoFe₂ O₄ - NIR과 결합된 QD는 명백한 독성 효과 없이 NSCLC 종양 이종이식편을 완전히 제거할 수 있습니다. 이러한 발견은 CoFe₂ O₄ -QDs owns promising applications to be developed as a novel NSCLC killing reagent.

Conclusion

All in all, CoFe₂ O₄ -QDs we synthesized could exhibit superior PTT/PDT synergistic effects in suppressing NSCLC by inducing ROS generation through regulating PI3K/AKT pathway, which shed light to the mechanism research and applications of novel photosensitizers establishments.