쥐 내이 고막 내 투여 리포좀 나노캐리어의 안전성 평가

초록

리포좀 나노캐리어(LPN)는 최소 침습적 고막 내 전달 후 내이에서 높은 약물 탑재량과 효율적인 흡수를 제공합니다. 그러나 이 민감한 기관에서의 생체적합성은 체계적으로 평가되지 않았습니다. 본 연구에서 LPN—가돌리늄-테트라-아자사이클로-도데케인-테트라-아세트산(Gd-DOTA) 함유 여부와 관계없이—을 Sprague-Dawley 쥐에 고막을 통해 주입했습니다. 가돌리늄 강화 자기공명영상(Gd-MRI)으로 LPN 분포와 장벽 완전성을 추적하고, 청성 뇌간 반응(ABR)으로 청력 기능을 측정했습니다. 염증 표지자(당아미노글리칸, 히알루론산, CD44, TLR2)와 세포자멸사(TUNEL)를 와우 조직에서 정량했습니다. 결과는 LPN이 중이 및 내이 장벽을 손상시키지 않고 효율적으로 내이에 진입하며, 청력 손실이 없고, 염증 또는 세포자멸사 표지자가 증가하지 않음을 보여주었습니다. 따라서 고막 내 LPN 전달은 쥐 와우에 안전하며 감각신경성 난청 치료에 유망합니다.

배경

LPN은 임상에서 가장 오래된 나노치료 플랫폼으로 암, 감염질환, 염증, 통증에 성공적으로 사용되어 왔습니다. 높은 탑재 용량과 내이에서의 입증된 흡수는 이비인후과 치료에 매력적입니다. 고막 내 투여는 전신 노출을 제한하는 합리적 표적 접근법으로, 메니에르병과 돌발성 감각신경성 난청에 이미 임상적으로 사용됩니다. 이전 연구에서 펩타이드 기능화 LPN이 와우에 도달함을 보였으나, 내이에서 LPN의 안전성 프로파일—특히 장벽 기능, 염증, 세포 생존성 측면—은 알려지지 않았습니다. 이 연구는 Gd-MRI, ABR, 종합적 조직학적 분석을 사용하여 쥐 내이에서 LPN의 생체적합성을 평가함으로써 이 공백을 메웁니다.

히알루론산(HA)은 CD44와 TLR2/4에 결합하여 염증 경로를 개시하는 주요 세포외 기질 성분입니다. HA 축적은 와우를 포함한 다양한 조직에서 투과성 증가와 염증과 연관되어 있으며, 은 나노입자(AgNP)가 이전에 와우에서 HA 축적을 유도했습니다. 따라서 HA, CD44, TLR2를 본 연구에서 중요한 염증 표지자로 조사했습니다.

목적은 고막 내 LPN이 내이 장벽 완전성을 손상시키거나 염증을 유도하거나 청력 손실을 일으키는지 확인하는 것이었습니다. Gd-MRI로 장벽 기능을 평가하고, ABR로 청력 역치를 측정했으며, 면역조직화학으로 HA, CD44, TLR2, 세포자멸사 DNA 단편화를 정량했습니다.

결과

LPN은 쥐 와우에 기능적 변화를 일으키지 않습니다

Gd-MRI는 LPN이 효율적으로 와우에 진입함을 보여주었으며, 주입 3시간 내 전정계와 계단실에 강한 신호가 나타났습니다(Fig. 2c-f). 6시간까지 신호 분포가 와우 전체에서 균질해져 완전한 평형화를 나타냈습니다(Fig. 2e-f). 혈액-외림프 및 혈액-내림프 장벽 완전성은 처리군과 미처리군 간 비교 가능한 신호 강도로 유지되었습니다(표 1). 클릭과 톤 버스트(2-32 kHz) ABR 역치는 주입 2, 4, 7일에 유의미한 이동이 없어 청각 기능 보존을 확인했습니다(Fig. 3).

LPN은 쥐 와우에서 당아미노글리칸 축적을 유도하지 않습니다

주기산-시프 염색으로 LPN 또는 LPN-Gd 처리 후 와우 구조(나선연변, 골벽, 혈관조)에서 당아미노글리칸 증가가 탈염수 대조군 대비 없었습니다(Figs. 5, 6). 정량화로 통계적 유의차 없음 확인(p > 0.05).

LPN에 의한 히알루론산 분비에 미미한 영향

면역형광으로 HA가 주로 나선신경절 세포, 혈관조 기저 세포, 외와우 세포, 모세혈관 내피 세포에서 검출되었습니다(Fig. 7). LPN 또는 LPN-Gd 투여 후 나선인대 섬유아세포에서 HA 강도가 약간 감소했으나, 이는 장벽 투과성 변화나 청력 손실로 이어지지 않았습니다(Fig. 8).

LPN 노출 후 CD44 발현 변화 없음

CD44-양성 세포는 혈관조 기저 세포층, 나선인대, 데테르스 세포, 모세혈관 내피에서 모든 그룹에 풍부하게 분포했으며, 처리군과 대조군 간 염색 강도나 세포 수에 유의미한 차이가 없었습니다(Figs. 9, 10).

LPN에 의해 TLR2 발현 영향 없음

TLR2 면역반응성은 혈관조 기저 세포, 나선인대 섬유아세포, 내피에서 높았으나 LPN, LPN-Gd, 물 처리 귀 간에 차이가 없었습니다(Figs. 11, 12).

LPN 투여 후 와우 세포자멸사 증가 없음

TUNEL 염색으로 모든 그룹에서 와우 전반에 드문 세포자멸사 핵이 분포했으며, LPN 또는 LPN-Gd 그룹에서 대조군 대비 증가가 없었습니다(Fig. 13). 등골 기부와 타원창 틈새에서 관찰되는 간헐적 세포자멸사는 정상적 세포 교체의 일부로 간주됩니다.

고찰

우리의 데이터는 고막 내 LPN이 타원창과 원창 경로 모두를 통과하여 내이에 효율적으로 도달하며, 혈액-외림프 또는 혈액-내림프 장벽을 손상시키지 않음을 입증합니다. 청력 역치 이동 부재와 염증 또는 세포자멸사 표지자의 부재는 LPN이 쥐 와우에서 잘 견딤을 확인합니다. 나선인대 섬유아세포에서 HA 분비의 미미한 감소는 임상적으로 무관한 것으로 보이며, 투과성 변화 없이 항염증성 고분자량 HA로의 전환을 반영할 가능성이 높습니다. 이 발견들은 95-nm LPN이 내이 전달에 가장 효율적이고 110-115 nm LPN도 여전히 안전성을 유지한다는 선행 보고와 일치합니다.

중요하게, 이 연구는 LPN이 TLR2/CD44 염증 축을 활성화하지 않음을 확인합니다. 이는 반응성 산소 종과 미토콘드리아 독소에 의한 와우 손상에 연관된 핵심 경로입니다. 따라서 LPN은 내이 표적 약물 전달을 위한 안전한 수송체로, 감각신경성 난청 및 기타 이과적 질환에서의 잠재적 임상 적용을 뒷받침합니다.

결론

리포좀 나노캐리어의 고막 내 전달은 장벽 완전성, 청각 기능, 세포 항상성을 보존하며 쥐 내이에 안전합니다. LPN은 미래 내이 치료를 위한 약물 전달 플랫폼으로서 유망합니다.

방법

재료

지질(스핑고신, SOPC, DSPE-PEG-2000), 형광 염료(DiI, TRITC-DHPE), Gd-DOTA(DOTAREM), 은 나노입자(AgNP)는 상업적 공급업체에서 구매했습니다. 지질 순도는 박층 크로마토그래피로 검증했으며, 농도는 중량법으로 결정했습니다.

LPN 제조 및 특성 분석

단일층 LPN(~110 nm, 500 mM Gd-DOTA 캡슐화, LPN-Gd)과 빈 LPN(~115 nm)은 선행 기술된 박막 수화법으로 제조했습니다(참조 6, 3). 크기 분포와 제타 전위는 동적 광산란으로 측정했습니다.

LPN 투여

이소플루란 마취 하에 50 µl LPN 또는 LPN-Gd를 수술 현미경으로 왼쪽 중이에 고막 내 주입했습니다. 대측 귀에는 탈염수를 음성 대조군으로 주입했습니다. 주입 후 15분간 주입 귀를 위로 향하게 위치시켰습니다.

Gd-MRI를 이용한 생물학적 장벽 기능 평가

Gd-MRI는 4.7 T Bruker 스캐너로 RARE 프로토콜 사용했습니다. 조영제는 영상 2시간 전 정맥 주입했습니다. 영상 시점은 급성 및 아급성 변화를 포착하기 위해 주입 후 5시간부터 8일까지 범위였습니다.

청성 뇌간 반응(ABR)

ABR 역치는 기준선, 주입 후 2, 4, 7일에 클릭과 톤 버스트(2-32 kHz)로 표준 전극 배열과 차음 챔버에서 기록했습니다.

조직학적 및 면역형광 분석

최종 ABR 후 와우를 수확, 탈회, 절편화했습니다. 헤마톡실린-에오신과 주기산-시프 염색으로 염증과 당아미노글리칸 함량을 평가했습니다. HA, CD44, TLR2 면역형광을 냉동 절편에 수행하고 공초점 영상으로 신호 강도를 정량했습니다. 세포자멸사는 TUNEL 표지로 검출했습니다.

통계 분석

데이터는 SPSS 20으로 분석했습니다. 일원분산분석(ANOVA)과 크루스칼-월리스 검정으로 ABR 이동과 염색 강도를 비교했으며, 유의한 발견 후 LSD 사후 검정을 수행했습니다. p < 0.05를 유의함으로 간주했습니다.

약어

ABR

청성 뇌간 반응

AgNPs

은 나노입자

dH2O

탈염수

Gd-DOTA

가돌리늄-테트라-아자사이클로-도데케인-테트라-아세트산 (DOTAREM)

Gd-MRI

가돌리늄 강화 자기공명영상

LPN

리포좀 나노캐리어

LPN-Gd

Gd-DOTA 함유 LPN

ROI

관심 영역

TLR

톨-유사 수용체