친환경 합성 세륨 도핑 탄소 나노입자, 항산화 치료용 우수한 하이드록실 라디칼 제거 효과 입증

초록

최근 나노의학의 발전으로 산화세륨 나노입자가 강력한 항산화제로 주목받고 있습니다. 본 연구에서는 소혈청알부민(BSA)을 이용해 세륨 이온을 탄소 골격 내에 생물광물화하는 간단하고 환경 친화적인 방법을 제시합니다. 이렇게 제조된 세륨 도핑 탄소 나노입자(Ce-doped CNPs)는 평균 직경 14.7 nm의 단분산성을 띠며, 풍부한 친수성 표면 관능기로 인해 수용액에서 장기간 안정적으로 분산됩니다. CCK-8 세포독성 실험 결과, 넓은 농도 범위에서 무시할 만한 세포 독성을 보였습니다. 과산화수소 유발 활성산소종(ROS) 조건에서 Ce-doped CNPs는 뛰어난 하이드록실 라디칼(•OH) 소거 능력을 나타내며, 혈관 평활근 세포와 7721 종양 세포를 산화적 손상으로부터 농도 의존적으로 보호했습니다. 이러한 결과는 Ce-doped CNPs가 산화 스트레스 관련 질환 치료를 위한 유망한 저독성 ROS 제거제임을 시사합니다.

배경

산화 스트레스는 활성산소종(ROS) 생성과 항산화 방어 체계 간의 불균형으로 정의되며, 동맥경화, 암, 신경퇴행성 질환 등 많은 만성 질환의 근간이 됩니다. 특히 반응성이 높은 하이드록실 라디칼(•OH)은 지질 과산화, 단백질 변형, DNA 가닥 절단을 유발해 최종적으로 세포 사멸과 조직 손상을 초래합니다. 따라서 ROS, 특히 •OH 수치를 낮추는 치료 전략은 임상적으로 큰 관심을 받고 있습니다.

산화세륨 나노입자(CeO₂ NPs)는 가역적인 Ce³⁺/Ce⁴⁺ 산화-환원 주기 덕분에 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD)와 카탈라아제(CAT) 활성을 모방하는 강력한 나노효소로 부상했습니다. 각각 초산화 음이온(•O₂⁻)과 과산화수소(H₂O₂)를 제거합니다. 그러나 기존 CeO₂ NPs는 수용액에서의 안정성과 생체적합성을 위해 폴리비닐피롤리돈(PVP) 등 표면 코팅이 필요하며, 이는 고유 특성을 변화시킬 수 있습니다. 본 연구는 BSA 유래 탄소 골격 내에 세륨 이온을 내재화함으로써 이러한 한계를 극복하고, 고유한 친수성과 우수한 항산화 성능을 겸비한 Ce-doped CNPs를 제조했습니다.

실험 섹션

재료 및 시약

소혈청알부민(BSA), 플루오레세인 디아세테이트(FDA), 요오화 프로피듐(PI)은 시그마(미국 뉴욕)에서 구입했습니다. 태아소혈청(FBS)과 델베코 변성 최소 필수 배지(DMEM)는 인비트로젠 차이나(상하이)에서 조달했습니다. 질산 세륨 육수화물(Ce(NO₃)₃·6H₂O), 메틸 바이올렛(MV), 황산 제1철 칠수화물(FeSO₄·7H₂O), 30% H₂O₂는 알라딘 시약(상하이)과 신팜 화학 시약(베이징)에서 구매했습니다. 모든 시약은 분석등급으로 추가 정제 없이 사용했으며, 탈이온수를 사용했습니다.

세륨 도핑 탄소 나노입자 합성

Ce-doped CNPs는 왕 등(이전 연구)의 BSA 주형 합성법을 변형한 생물광물화 경로로 제조했습니다. 간단히, BSA 1.25 g을 50 mL 탈이온수에 녹여 지속적으로 교반하며 투명한 용액을 만들었습니다. 300 mM Ce(NO₃)₃·6H₂O 용액을 격렬히 교반하며 방울방울 첨가했고, 동시에 2.0 M NaOH를 서서히 가해 pH를 12로 조절했습니다. 혼합물을 55°C에서 8시간 교반해 갈색 현탁액을 얻고 실온으로 식혔습니다. 생성물을 0.22 µm PES 멤브레인으로 여과해 큰 응집체를 제거하고, 물(14 kDa MWCO)에 대해 3일간 투석한 후 진공 동결건조했습니다. 얻은 분말은 추가 특성 분석을 위해 보관했습니다.

특성 분석 기법

투과전자현미경(TEM, JEOL JEM-2100, 200 kV)으로 형태를 관찰했습니다. 입도 분포는 ImageJ(NIH)로 계산했습니다. 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR, Nicolet Nexus 470)과 X선 광전자 분광법(XPS, PHI 5000)으로 표면 관능기와 산화 상태를 확인했습니다. X선 회절(XRD, Rigaku D/MAX-2000)로 결정상을 분석했습니다. UV-Vis 흡수 스펙트럼(Shimadzu UV-2550)은 용액 상태 연구에 사용했습니다.

UV-Vis 광도법을 이용한 라디칼 소거 분석

Ce-doped CNPs(10 µM)를 0.1 M Tris-HCl(pH 5.0)에 분산시키고 초음파 처리해 용해도를 높였습니다. 3.0×10⁻⁵ M MV, 0.15 mM FeSO₄·7H₂O, 1.0 M H₂O₂, Ce-doped CNP 현탁액(0.17 mM)을 10 mL 부피로 혼합한 반응 혼합물을 준비했습니다. 실온에서 5분 후 582 nm에서의 흡광도를 측정해 MV 회복도를 정량화함으로써 하이드록실 라디칼 소거 능력을 평가했습니다.

세포 생존율(CCK-8) 분석

혈관 평활근 세포(VSMC)와 7721 세포를 96웰 플레이트에 웰당 1.5×10⁴ 세포 밀도로 접종해 ~80% 융합도까지 배양했습니다. 24시간 후 배지를 0~400 µg/mL Ce-doped CNPs를 함유한 DMEM으로 교체하고 24시간 배양했습니다. CCK-8 시약(웰당 10 µL)을 첨가해 4시간 배양 후 Synergy HT 마이크로플레이트 리더로 490 nm 흡광도를 측정했습니다. 세포 생존율은 무처리 대조군 대비 백분율로 나타냈습니다.

과산화수소 유발 산화 스트레스 모델

산화 손상 모델을 위해 VSMC와 7721 세포를 50~800 µmol mL⁻¹ 범위의 30% H₂O₂에 4시간 노출시켰습니다. 처리 후 위와 같은 CCK-8 분석으로 세포 생존율을 평가해 H₂O₂의 LD₅₀(약 560 µM)을 결정했습니다.

세포사멸 및 생존-사멸 분석

Ce-doped CNPs(0~400 µg/mL)로 사전 처리한 세포를 560 µM H₂O₂로 4시간 처리했습니다. 6웰 플레이트에 배양한 7721 세포에 대해 칼세인-AM/PI 생존-사멸 염색을 수행하고 공초점 현미경으로 형광 이미지를 획득했습니다.

유세포분석기를 이용한 세포사멸 분석

H₂O₂ 노출 후 7721 세포를 수확, 세척하고 Annexin V-FITC와 PI로 염색했습니다. 벡만 쿨터 Epics XL MCL 유세포분석기로 분석하고 FlowJo 7.6.2로 초기(Annexin V⁺/PI⁻) 및 후기(Annexin V⁺/PI⁺) 세포사멸 세포 비율을 계산했습니다.

통계 분석

데이터는 평균 ± 표준오차(SEM)로 표시했습니다. 일원배치 분산분석(One-way ANOVA) 후 Tukey 사후 검정을 적용했으며, p < 0.05를 통계적 유의성 기준으로 삼았습니다.

결과 및 고찰

나노입자 합성 및 형태

생물광물화 전략은 TEM 이미지(그림 1a)에서 보듯 고도로 단분산된 Ce-doped CNPs를 생성했습니다. 입자는 다각형의 비응집 형태를 보이며 평균 직경은 14.7 ± 0.8 nm였습니다(그림 1b). 수용액 분산액이 수일간 맑은 상태를 유지해 우수한 콜로이드 안정성을 입증했으며, 이는 생물의약 전달에 중요한 장점입니다.

표면 화학 및 산화 상태

XPS 분석 결과 Ce³⁺(약 15.99%)와 Ce⁴⁺가 공존함이 확인돼 입자의 산화-환원 활성 본질을 뒷받침했습니다(그림 2b). C 1s 스펙트럼(그림 2c)은 285.0, 287.8, 288.9 eV에서 피크를 보여 각각 C-C, C=O, C-O 결합에 대응했으며, O 1s 스펙트럼(그림 2d)은 530.5와 531.8 eV 피크로 Ce-O 결합과 표면 수산기 존재를 나타냈습니다. FT-IR 스펙트럼(그림 3A)은 3400 cm⁻¹에서 넓은 O-H 신축 진동과 1510, 1450 cm⁻¹에서 질산염 관련 피크를 보여 친수성 관능기의 존재와 세륨 이온의 성공적 도입을 확인했습니다.

XRD 패턴(그림 3B)은 24.4° 근처의 탄소 관련 피크와 30.3°, 35.23°, 43.2°의 세리아 반사 피크를 보여 탄소-세륨 혼성 격자의 특성을 나타내며, 세륨이 탄소 골격에 성공적으로 통합됐음을 입증했습니다.

세포독성 평가

CCK-8 분석 결과 Ce-doped CNPs는 400 µg/mL까지 농도에서 세포 생존율을 저해하지 않았습니다(그림 4a). 최고 농도에서도 생존율이 90% 이상 유지돼 입자의 탁월한 생체적합성을 확인했습니다.

항산화 효능

560 µM H₂O₂가 VSMC와 7721 세포 모두의 LD₅₀로 확인됐습니다. Ce-doped CNPs로 사전 처리 시 농도 의존적으로 생존율이 유의하게 향상돼, 400 µg/mL에서 생존율이 약 88%까지 회복됐습니다(그림 4c). 생존-사멸 염색(그림 5) 결과 Ce-doped CNPs 농도 증가에 따라 적색(PI 양성) 세포가 현저히 감소해 산화적 세포사멸에 대한 보호 효과를 확인했습니다. 유세포분석(그림 6) 결과 H₂O₂ 단독 처리 시 46.4%였던 후기 세포사멸 비율이 Ce-doped CNPs 50, 100, 200, 400 µg/mL 처리 시 각각 24.2%, 20.0%, 15.1%, 11.2%로 감소했습니다.

결론

본 연구는 고분산성, 생체적합성, 강력한 하이드록실 라디칼 소거 능력을 지닌 세륨 도핑 탄소 나노입자의 친환경 단일 단계 합성법을 개발했습니다. 이 입자는 고유한 Ce³⁺/Ce⁴⁺ 산화-환원 순환을 유지해 SOD 및 CAT 활성을 모방하며, 혈관 세포와 종양 세포를 H₂O₂ 유발 산화 손상으로부터 보호합니다. 농도 의존적 항산화 효능과 최소한의 세포독성은 Ce-doped CNPs가 산화 스트레스 관련 병리의 예방 및 치료를 위한 매력적인 후보 물질임을 보여줍니다.