자석 타겟팅 및 NIR 반응성 화학-광열 암 치료를 위한 rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어의 간편한 제조

초록

근적외선(NIR) 반응성 그래핀은 암 광열 절제 치료에 흥미로운 효과를 보여주었습니다. 본 연구에서는 자석 타겟팅 및 NIR 반응성 화학-광열 병용 치료를 위해 분무 건조 및 공침법으로 Fe₃O₄가 장식된 중공 그래핀 마이크로스피어(rGO@Fe₃O₄)를 제조했습니다. 이 마이크로스피어는 매우 높은 비표면적(~120.7 m²/g)과 큰 기공 부피(~1.012 cm³/g)를 나타내며, DOX의 높은 약물 적재 용량(~18.43%)에 뚜렷한 이점을 보였습니다. rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어의 NIR 유도 광열 효과는 온-오프 방식으로 반응하며 높은 광열 변환 효율을 유도했습니다. 또한 마이크로스피어상의 Fe₃O₄는 종양 세포에 대한 탁월한 타겟팅 능력을 보였습니다. rGO@Fe₃O₄/DOX 기반의 화학-광열 치료는 시험관 내 HeLa 세포에 대해 우수한 세포독성을 나타냈습니다. 본 연구는 rGO@Fe₃O₄/DOX 마이크로캡슐이 병용 화학-광열 암 치료에 큰 잠재력을 가짐을 시사합니다.

서론

암은 세계에서 가장 악성인 질병 중 하나이며 인간 사망의 주요 원인입니다[1, 2]. 화학요법이 임상 암 치료에 흔히 사용되지만, 낮은 치료 효율과 광범위한 부작용 등 몇 가지 핵심 문제가 그 적용을 심각하게 제한합니다[3]. 약물 전달 시스템(DDS)은 약물 용해도, 생체이용률, 종양 축적을 향상시키는 데 큰 이점을 보이며, 항종양 효율을 현저히 개선할 것으로 기대됩니다[4]. 최근 중공 마이크로스피어를 약물 전달 시스템으로 활용하는 연구가 넓은 표면적과 풍부한 다공성 구조로 인해 많은 주목을 받고 있습니다[5-8]. 여러 중공 마이크로스피어 소재가 혁신적인 기술로 설계되었습니다[9-13].

산화 그래핀(GO)은 우수한 생체적합성, 저비용, 간단한 제조 등 독특한 특성으로 인해 약물 전달 분야에서 널리 연구되어온 새로운 유형의 무기 비금속 소재입니다[14-17]. 특히 산화 그래핀은 NIR 조사 시 빛을 열로 효과적으로 변환할 수 있어[18-20], 암의 광열 치료 효과를 개선하는 유망한 전략이 되었습니다. Chen 그룹은 GO가 π-π 스태킹, 수소 결합, 정전기 흡착 등의 비공유 결합으로 항암제를 전달할 수 있다고 보고했습니다[21]. 그러나 2D 산화 그래핀 나노시트는 큰 비표면적과 그래핀 층 간 반데르발스 결합으로 인해 응집되기 쉬우며[17, 22], 물에 대한 용해도가 낮고 약물 적재 능력이 감소하는 결과를 초래합니다. 이러한 단점을 극복하기 위한 여러 전략이 탐구되었습니다. Tsukruk 그룹은 층별 조립 기술을 이용해 그래핀 중공 캡슐을 개발했습니다[23], 이는 다른 GO 소재에 비해 극도로 높은 약물 적재량을 보였습니다. 이는 GO로 안정화된 중공 캡슐의 높은 비표면적과 큰 기공 부피에 기인할 수 있습니다. 그러나 약물 전달을 위한 3차원 연결 기공 구조를 가진 GO 연구는 거의 보고되지 않았습니다.

많은 보고된 약물 전달 시스템이 우수한 약물 적재 능력과 제어된 약물 방출 거동을 보였지만, 종양 조직에 대한 불충분한 특이성으로 인해 전임상 연구와 적용도 제한됩니다[24]. 다양한 약물 타겟 전달 시스템 중에서 Fe₃O₄는 높은 자기 반응성, 안정된 품질, 쉬운 획득으로 인해 암 치료에 자기 타겟 소재로 널리 사용됩니다[25-29]. Ni 그룹은 종양의 자기 타겟팅을 위한 초상자성 특성을 가진 Fe₃O₄@SiO₂ 코어-쉘 구조 나노입자를 개발했습니다[30]. 또한 Fe₃O₄가 고정된 GO 나노입자는 자기 타겟 전달과 광열 치료의 결합에 대해 잘 연구되었습니다[31-34].

본 연구에서는 자석 타겟팅과 NIR 유도 광열 치료(PTT)를 위한 철 산화물로 장식된 rGO 중공 마이크로스피어(rGO@Fe₃O₄)로 구성된 DDS 플랫폼 개발을 위한 진보된 전략을 보고합니다. 도식 1에 도시된 바와 같이, rGO@Fe₃O₄ 중공 마이크로스피어는 세 단계를 통해 제조되었습니다. 첫째, SiO₂를 주형으로 분무 건조법으로 rGO-SiO₂를 합성한 후 HF 식각으로 SiO₂를 제거하여 rGO 중공 마이크로스피어를 얻었습니다. 이후 공침법으로 Fe₃O₄ 나노입자를 rGO 중공 마이크로스피어에 고정하여 rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어를 구축했습니다. 이 시스템에서 rGO는 NIR 유도 PTT 제제로, Fe₃O₄는 HeLa 세포를 향한 자기 타겟팅 특성을 제공합니다. 기공 흡착과 π-π 스태킹을 기반으로 독소루비신(DOX)을 캡슐화한 마이크로스피어(rGO@Fe₃O₄/DOX)는 초고약물 적재 용량과 pH 반응성 약물 방출 거동을 나타내며, 광열-화학요법의 결합으로 항암 효과를 현저히 향상시킬 것으로 기대됩니다.

재료 및 방법

재료

염화 제1철 육수화물(FeCl₃·H₂O), 수산화나트륨(NaOH), 황산 제1철 칠수화물(FeSO₄·7H₂O)은 신팜 화학 시약 유한회사에서 구매했습니다. HeLa 세포는 톈진 암 병원에서 제공받았습니다. 인산 완충 식염수(PBS), 염산 독소루비신(DOX·HCl), 델베코 최소 필수 배지(DMEM), 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI), 세포 계수 키트-8(CCK-8)은 솔라바이오 과학 기술 유한회사에서 구매했습니다. SiO₂(~300 nm)는 상하이 위안장 화학 회사에서 구매했습니다. 산화 그래핀 탈수 용액(2 mg/ml)은 난징 시안펑 회사에서 상용 제품으로 구매했습니다.

rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어의 제조

중공 그래핀 마이크로스피어는 SiO₂(300 nm)를 주형으로 분무 건조법으로 제조했습니다. 간단히, 100 mL SiO₂ 현탁액(50 mg/mL)을 300 mL GO 수용액(2 mg/mL)에 격렬하게 교반하며 서서히 첨가하고, 혼합 용액을 분무 건조기에서 200°C로 분무 건조했습니다. 이후 생성물을 Ar 분위기에서 300°C로 2시간 유지하여 rGO-SiO₂를 얻었습니다. SiO₂를 제거하기 위해 rGO-SiO₂를 10% HF 용액에 60°C에서 48시간 담갔습니다. 고체 생성물을 여러 번 세척하고 60°C 진공 건조기에서 12시간 건조하여 최종적으로 75% 수율로 rGO를 얻었습니다.

rGO@Fe₃O₄ 나노입자는 공침법으로 제조했습니다. 전형적인 공정에서 0.27 g FeCl₃·H₂O, 0.28 g FeSO₄·7H₂O, 0.1 g rGO 중공 마이크로스피어를 10 mL 탈수에 녹이고 50°C에서 30분간 교반했습니다. 이후 0.15 mol/L NaOH 60 mL를 50°C에서 12시간 지속적으로 교반하며 서서히 첨가했습니다. 생성물을 자기적으로 분리하고 탈수와 에탄올로 여러 번 반복 세척한 후 60°C 진공에서 12시간 건조했습니다.

구조 특성 분석

시료의 크기와 형태는 전계 방사 주사 전자 현미경(FE-SEM, Hitachi, S-4800)과 투과 전자 현미경(TEM, JEM2100F, JEOL)으로 분석했습니다. 생성물의 조성은 X선 회절 시스템(XRD, D8 Focus, Cu Kα 방사, Bruker, 독일)으로 주사 속도 12°/min, 10-80° 범위에서 분석했습니다. 또한 X선 광전자 분광법(XPS)은 XPS 분광계(Thermo Fisher Scientific, ESCALAB 250Xi, 미국)로 수행했습니다. FTIR(FT-IR, AVATAR360, Nicolet)은 500-4000 cm⁻¹ 범위에서 4 cm⁻¹ 해상도로 기록했습니다. 자기적 특성은 초전도 양자 간섭 장치(SQUID, Quantum Design MPMS) 자력계로 실온(300 K)에서 측정했습니다. 라만 스펙트럼은 532 nm 파장 레이저를 사용한 라만 분광기(Renishaw, inVia Reflex, 영국)로 수집했습니다. rGO 함량은 열중량 분석기(TGA, TA Instruments-water LLC, SDTQ-600)로 평가했습니다. 비표면적은 브루나우어-에멧-텔러(BET) 기술로 측정했습니다. UV-Vis 스펙트럼은 벡만 DU 800 핵산/단백질 분석기(Beckman Instruments, Inc., Rosemead, CA)로 기록했습니다.

DOX 적재 및 방출

모델 화학요법 약물인 독소루비신(DOX)을 rGO@Fe₃O₄의 코어에 캡슐화하여 시험관 내 항암제의 적재 및 방출 거동을 평가했습니다. rGO@Fe₃O₄/DOX는 선행 연구에 따라 제조했습니다. 간단히, DOX 수용액(0.2 mg/mL) 10 mL를 rGO@Fe₃O₄ 용액 10 mg에 첨가하고 초음파 균질화하여 현저한 침전이 없도록 했습니다. 이후 혼합물을 왕복 쉐이커(SK-O180-Pro)에서 150 rpm으로 24시간 평형시켰습니다. 6000 rpm으로 10분 원심분리 후 비적재 DOX를 제거하고, rGO@Fe₃O₄/DOX 상등액을 UV-Vis 분광광도계로 측정하여 적재된 DOX 양을 결정했습니다. DOX의 OD는 490 nm에서 기록했으며, 다음 식을 사용해 적재 효율(LE)과 적재 용량(LC)을 계산했습니다:

LE = (총 DOX 양 - 유리 DOX 양) / 총 DOX 양

LC = (총 DOX 양 - 유리 DOX 양) / rGO@Fe₃O₄/DOX 양

DOX의 시험관 내 방출 연구는 rGO@Fe₃O₄/DOX(10 mg)를 투석 주머니(MWCO = 1000)에 넣고 인산 완충 식염수(PBS, 30 mL, pH 5.4, 6.5, 7.4)와 함께 37°C 수조에서 80 rpm으로 흔들며 수행했습니다. 정해진 간격으로 3 mL 방출 매질을 채취하고 UV-Vis를 480 nm에서 측정하여 방출된 DOX 양을 계산했습니다.

rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어의 NIR 유도 광열 효과

rGO@Fe₃O₄ 농도가 NIR 유도 광열 효과에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 서로 다른 농도(0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)의 rGO@Fe₃O₄ 용액을 2 W/cm² NIR 레이저로 5분간 조사했습니다. 또한 0.25 mg/mL rGO@Fe₃O₄를 서로 다른 출력(1, 1.5, 2 W/cm²)으로 5분간 조사하여 NIR 에너지의 영향을 평가했습니다. 실시간 온도는 FLIR I5 적외선 열화상 카메라로 측정했습니다.

시험관 내 세포 섭취

HeLa 세포를 35 mm² 컨포칼 접시에 1×10⁵ cells/well 밀도로 파종했습니다. 24시간 배양(5% CO₂, 37°C) 후 배지를 제거하고 rGO@Fe₃O₄/DOX 마이크로스피어와 자석을 적용한 rGO@Fe₃O₄/DOX가 포함된 신선한 배지를 첨가해 5시간 더 배양했습니다. rGO@Fe₃O₄/DOX 농도는 0.1 mg/mL였습니다. 세포를 차가운 PBS(pH 7.4)로 3회 세척하고 4% 파라포름알데히드 용액으로 20분 고정했습니다(CLSM, TCSSP5II, Leica, 독일).

세포 생존율 분석

이 마이크로스피어의 세포독성은 NIR 처리 후 CCK-8 분석으로 평가했습니다. HeLa 세포를 96웰 플레이트(5×10³ cells/well)에 100 μL 배지로 파종하고 5% CO₂, 37°C에서 24시간 배양했습니다. 생체적합성 평가를 위해 rGO@Fe₃O₄를 0.01-0.2 mg/mL 농도 범위로 첨가했습니다. 단일 광열 치료 그룹의 경우 rGO@Fe₃O₄를 같은 농도 범위로 첨가하고 NIR 조사(10분, 2 W/cm², 808 nm)를 했습니다. 병용 광열-화학요법 그룹의 경우 rGO@Fe₃O₄/DOX를 0.01-0.2 mg/mL 농도 범위로 첨가하고 NIR 조사(10분, 2 W/cm², 808 nm)를 했습니다. 세포를 추가로 24시간 또는 48시간 배양한 후 PBS로 세척하고 10 μL CCK-8 용액이 포함된 100 μL DMEM 배지에서 40분 더 배양했습니다. 생존율은 450 nm에서 마이크로플레이트 리더로 측정했습니다. 모든 실험은 3회 반복 수행했습니다.

결과 및 논의

합성 및 형태 특성 분석

rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어 제조는 세 단계로 수행되었습니다. 먼저 SiO₂를 주형으로 분무 건조법으로 rGO-SiO₂ 마이크로스피어를 합성했습니다. rGO-SiO₂ 마이크로스피어의 형태는 SEM과 TEM으로 특성 분석했습니다. 그림 1a에 보인 바와 같이, 직경 3 μm의 rGO-SiO₂ 마이크로스피어는 균일한 구형 모양을 보이며 많은 밀집된 SiO₂ 나노입자(~300 nm)로 구성됩니다. TEM 데이터와 동적 빛 산란으로 측정한 수동적 직경도 이 결과를 확인했습니다(그림 1d, g). 이후 rGO-SiO₂에서 300°C 가열과 HF 식각으로 SiO₂를 제거하여 중공 rGO 마이크로스피어를 얻었습니다. SiO₂ 용해로 인해 약 300 nm 기공 크기의 뚜렷한 기공이 관찰되었습니다(그림 1b, e). 마지막으로 자기 타겟팅 능력을 가진 Fe₃O₄를 공침법으로 다공성 rGO에 장식했습니다. SEM과 TEM 관찰 결과 Fe₃O₄ 적재 후 기공 크기가 현저히 감소했습니다(그림 1c, f), 이는 약물 전달의 가능성과 제어된 약물 방출을 제공합니다. 주목할 점은 rGO-SiO₂, rGO, rGO@Fe₃O₄의 입자 크기와 수동적 크기 분포가 이 처리 과정에서 눈에 띄게 변화하지 않았다는 것입니다(그림 1g, h, i).

구조 및 조성 특성 분석

rGO@Fe₃O₄의 성공적인 제조를 추가로 확인하기 위해 SEM-EDS를 이용해 마이크로스피어의 구조와 조성을 조사했습니다. rGO@Fe₃O₄의 EDS 이미지는 원소 O, Fe, C에 대한 에너지 손실 창에서 비탄성 산란 전자를 시각화해 특성 분석했으며, 서로 다른 색상 영역은 실제 구조에서 O, Fe, C가 풍부한 위치를 각각 나타냅니다. 그림 2a, b에 보인 바와 같이 Fe와 O가 rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어에 높은 적재 밀도로 넓게 분포되어 있습니다. 그림 2d는 Fe₃O₄ 나노입자가 직경 약 18 nm로 rGO에 균일하게 분산되어 있어 rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어의 기공 크기가 급격히 감소함을 확인했습니다. 선택 영역 전자 회절(SAED) 패턴은 rGO 내 Fe₃O₄의 존재를 추가로 검증했습니다(그림 2e), 2.98 nm, 2.53 nm, 2.09 nm, 1.62 nm, 1.49 nm의 특성 면 간격은 각각 Fe₃O₄의 면심입방상 220, 311, 400, 511, 440면에 할당됩니다. 220, 311, 400, 511, 440에 해당하는 Fe₃O₄ 피크도 XRD 스펙트럼에서 검출되어 SAED 결과와 일치했습니다(그림 2c). 그러나 Fe₃O₄와 γ-Fe₂O₃은 특성 피크 위치가 같아 XRD 패턴만으로는 독립적으로 구별할 수 없다고 보고되었습니다[35]. XPS 결과는 725.9/724.5 eV와 714.1/711.0 eV의 주요 피크가 각각 rGO@Fe₃O₄의 Fe2p₁/₂와 Fe 2p₃/₂에 해당하며(그림 2g, h), Fe₃O₄ 내 Fe³⁺와 Fe²⁺의 공존을 나타냅니다[36]. 열중량 분석(TGA)은 공기 분위기에서 시료를 800°C까지 가열하고 100°C까지 냉각하며 rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어 내 rGO의 열분해 거동을 모니터링했습니다(그림 2f). 질량 손실 곡선은 탈수 영역(40-300°C)과 rGO의 탈휘발 영역(300-800°C)이라는 두 개의 뚜렷한 질량 손실 영역을 보였으며, 시료에서 계산된 탄소 함량은 25.6 wt.%였습니다.

rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어의 자기적 특성은 초전도 양자 간섭 장치로 조사했습니다. 자기장은 실온에서 -20,000에서 20,000 Oe 범위로 주사했습니다. 그림 2i는 Fe₃O₄의 포화 자화(Ms) 값과 보자력(Hc) 값이 각각 66.6 emu/g와 9.3 Oe임을 보여줍니다. Fe₃O₄를 rGO에 적재한 후 rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어의 Ms 값과 Hc 값은 각각 33.9 emu/g와 7.44 Oe로 감소했습니다. 자화 포화도의 현저한 감소는 rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어 내 rGO의 반자성 특성에 기인할 수 있습니다. 또한 rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어의 선택적 응집 능력은 자기 분리 실험으로 직관적으로 수행했습니다. Fe₃O₄와 rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어 현탁액을 외부 자석이 있는 바이알에 넣고 2분간 두면 현탁액이 자석 쪽으로 모이고 수용액이 투명해집니다. 자석을 제거하면 rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어가 천천히 흔들면 다시 균일하게 분산되어, rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어가 우수한 수분산성을 가짐을 나타냅니다. 우수한 수분산성과 자기 반응 특성은 rGO@Fe₃O₄가 암 치료에서 약물 운반체로 자기 타겟팅 응용될 수 있는 길을 열었습니다.

광열 효과 분석

NIR이 조직 깊숙이 침투하고 주변 조직에 대한 손상이 적기 때문에, NIR 반응성 광열 치료는 종양 치료에 자주 사용됩니다. 따라서 808 nm NIR 레이저 조사 하에서 서로 다른 농도와 출력 밀도의 rGO@Fe₃O₄ 수용액의 광열 변환 거동을 5분간 기록했습니다. 그림 3a, b는 rGO@Fe₃O₄의 온도 상승이 농도와 레이저 출력 밀도에 크게 의존함을 보여줍니다. 마이크로스피어 농도가 1 mg/mL일 때, 2 W/cm² NIR 레이저로 5분 조사 시 온도가 27.9°C에서 70.3°C로 상승한 반면, PBS 그룹은 31.7°C에서 36.2°C로만 상승했습니다. rGO@Fe₃O₄의 높은 광열 변환 효율은 단백질 변성과 DNA 손상이 50°C에 4-6분 노출 시 발생한다는 선행 보고[21, 37]에 따라 종양 광열 치료에 큰 잠재력을 가집니다. rGO@Fe₃O₄의 광열 변환 거동을 직관적으로 표시하기 위해 적외선 열화상 촬영을 수행했으며 결과는 그림 4c에 나타냈습니다. 농도 1 mg/mL의 rGO@Fe₃O₄ 용액은 NIR 조사 5분 후 70.3°C로 급격히 상승한 반면, 물 그룹은 뚜렷한 변화가 없어 온도계 측정 결과와 일치했습니다. 또한 808 nm 레이저, 2 W/cm²로 레이저 온/오프 절차를 6회 반복 수행해 rGO@Fe₃O₄의 광열 안정성을 연구했습니다(그림 3d). 동일한 온도 상승이 얻어졌으며, 이는 rGO@Fe₃O₄ 복합체의 완벽한 NIR 광열 안정성을 나타냅니다. 이러한 결과는 rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어가 암 광열 치료용 광열 제제로 큰 가능성을 가짐을 입증합니다.

약물 적재 및 방출

rGO@Fe₃O₄의 비표면적과 기공 크기는 BET와 BJH 분석으로 평가했습니다(그림 2a, b). N₂ 흡착-탈착 곡선은 등온선 IV형이었으며, 비표면적과 기공 크기는 각각 120.7 m²/g, 2-8 nm, 기공 부피는 1.012 cm³/g였습니다. 결과는 rGO@Fe₃O₄가 메조포러스 채널과 평균 기공 크기 분포를 가져 항암제 적재에 큰 잠재력을 가짐을 보여줍니다. 이후 다공성 구조의 rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어를 이용해 모델 화학요법 약물 독소루비신을 단순 혼합과 약한 초음파로 적재했습니다. ATR-FTIR 분석은 DOX의 -COOH와 벤젠 기의 특성 공명인 1726 cm⁻¹과 1618 cm⁻¹에서 rGO@Fe₃O₄ 내 DOX의 안정적 내재를 추가로 검증했습니다(그림 4c). 주사 전자 현미경(SEM) 관찰 결과 DOX 적재 후 N 원소의 새로운 신호가 마이크로스피어 내에 균일하게 분포함을 보였습니다(그림 4d, e). 또한 rGO@Fe₃O₄/DOX의 DOX 적재 효율(LE)과 적재 용량(LC)은 각각 92.15%와 18.43%였습니다. rGO@Fe₃O₄/DOX의 현저히 높은 LC는 극도로 높은 비표면적과 기공 크기에 기인할 수 있습니다[19]. rGO@Fe₃O₄/DOX의 높은 LE는 두 가지 측면에서 기인할 수 있습니다. 하나는 rGO@Fe₃O₄가 DOX와 rGO@Fe₃O₄의 sp² 혼성화 π 결합과 DOX의 퀴논 부분 간의 강한 π-π 스태킹으로 상호작용한다는 점이고[21], 다른 하나는 rGO@Fe₃O₄의 카복실기(-COOH), 하이드록실기(-OH)와 DOX의 아민기(-NH₂), 하이드록실기(-OH) 간 수소 결합 형성일 수 있습니다. 이후 종양과 정상 조직의 세포외 환경을 모방해 pH 7.4, 6.5, 5.4의 PBS에서 DOX 방출 거동을 모니터링했습니다. 그림 4f에 나타난 바와 같이 pH를 7.4에서 5.4로 조절하면 DOX 방출 속도가 가속화되었으며, pH 5.4에서 98시간 후 지속적 DOX 방출은 최대 73%에 달했습니다. 따라서 rGO@Fe₃O₄로부터의 DOX 누적 방출 프로파일은 pH 의존적 방식을 보였습니다. 산성 조건 하에서의 가속화된 방출은 DOX의 하이드록실기와 아민기의 부분적 양성자화로 인한 약물 용해도 증가와 DOX와 그래핀 간 수소 결합 약화 때문일 수 있습니다[38]. 또한 NIR 반응성 DOX 방출 거동도 시험관 내 연구했습니다. 그림 4g에 나타난 바와 같이 NIR 조사로 DOX 방출이 가속화되었으며 방출 속도는 최대 85%에 달했습니다. 이 pH 및 NIR 자극 반응 거동은 종양 부위로의 효과적인 약물 전달에 중요한 역할을 합니다.

시험관 내 세포 섭취

rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어 내 Fe₃O₄의 자기 타겟팅 능력을 검증하기 위해 자기장 처리 유무에 따른 세포 섭취 실험을 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)으로 정성적으로 조사했습니다. HeLa 세포를 rGO@Fe₃O₄/DOX와 4시간 배양하고 HeLa 핵을 DAPI로 염색했습니다. 그림 5 결과는 자기장 처리한 rGO@Fe₃O₄/DOX 그룹에서 rGO@Fe₃O₄ 마이크로스피어에 해당하는 검은 반점과 DOX에 기인한 명백한 세포내 적색 형광 신호가 관찰되었습니다. 반면 자기장 없이 rGO@Fe₃O₄/DOX 그룹에서는 검은 반점이 적고 DOX 형광이 약했습니다. 이는 자석에 의해 rGO@Fe₃O₄가 세포 내로 내재화되는 것이 촉진될 수 있음을 설명합니다. 결과는 rGO@Fe₃O₄/DOX 내 Fe₃O₄가 HeLa 세포를 효율적으로 특이적으로 타겟팅하고 마이크로스피어의 세포 내재화를 현저히 향상시킬 수 있음을 나타내며, 암 치료에서 약물 전달 시스템의 우수한 자기 타겟팅 능력을 입증합니다.

시험관 내 세포독성 분석

rGO@Fe₃O₄의 생체적합성은 HeLa 세포에 대한 CCK-8 분석으로 평가했습니다. 그림 6a에 보인 바와 같이, 다양한 농도의 rGO@Fe₃O₄로 배양 후 세포 생존율은 200 μg/mL 고농도에서도 90% 이상이었으며, 이는 rGO@Fe₃O₄가 높은 생체적합성을 보이고 효율적인 약물 전달 플랫폼으로 사용될 수 있음을 나타냅니다. rGO@Fe₃O₄의 광열 치료 효능은 HeLa 세포와 24시간 및 48시간 배양 후 NIR 조사(808 nm NIR 레이저, 10분)로 추가 조사했습니다. 그림 6b에 보인 바와 같이 광독성은 NIR 자극 하에서 명백히 농도 의존적이었으며, 세포 생존율은 24시간에 90.37%에서 35.52%로, 48시간에 93.77%에서 31.75%로 감소해 rGO@Fe₃O₄가 우수한 광독성을 가지고 광열 치료에 큰 가능성을 가짐을 시사합니다. 광열-화학요법의 상승적 치료 효능을 평가하기 위해 NIR 조사 유무에 따른 rGO@Fe₃O₄/DOX의 HeLa 세포에 대한 세포독성을 연구했습니다. 그림 6c, d에 보인 바와 같이 세포 생존율은 농도 의존적이고 시간 제어 방식이었습니다. NIR 조사 없이 rGO@Fe₃O₄/DOX와 DOX로 24시간 후 HeLa 세포의 약 65%와 80%가 사멸했으며, rGO@Fe₃O₄/DOX의 종양 살상 능력이 유리 DOX보다 감소한 것은 rGO@Fe₃O₄/DOX 마이크로스피어의 지연된 DOX 방출 거동 때문일 수 있습니다. NIR 레이저 조사(808 nm NIR 레이저, 10분) 후 rGO@Fe₃O₄/DOX+레이저 그룹은 DOX 등가 농도(30 μg/mL)에서 86% 이상의 세포를 사멸시켰습니다. 48시간 동일한 처리 후에도 유사한 결과를 관찰할 수 있었으며, DOX, rGO@Fe₃O₄/DOX, rGO@Fe₃O₄/DOX+NIR 조사 그룹의 세포 생존율 감소는 각각 80%, 76%, 90%로, 병용 광열 치료와 화학요법의 상승 효과를 나타냈습니다.

결론

요약하자면, 우리는 상승적 광열-화학요법을 위한 rGO 기반 약물 전달 플랫폼 rGO@Fe₃O₄/DOX를 구축하기 위한 간편한 전략을 탐구했습니다. rGO@Fe₃O₄/DOX 마이크로스피어는 우수한 NIR 유도 PTT 효과와 완벽한 NIR 광열 안정성을 보였습니다. 마이크로스피어상의 Fe₃O₄는 종양 세포에 대한 탁월한 타겟팅 능력을 보장했습니다. DOX는 rGO@Fe₃O₄에 초고약물 적재 용량으로 캡슐화될 수 있으며 pH 반응성 약물 방출 거동을 동시에 달성할 수 있습니다. 또한 화학요법과 광열 치료의 결합으로 향상된 항종양 효율이 달성되었습니다. 따라서 이 다기능 약물 전달 플랫폼은 향후 종양 타겟팅과 병용 암 치료를 위한 유망한 후보가 될 수 있습니다.