최적화된 하이드록실 기를 가진 수용성 풀레레놀, 이광자 광역학으로 감염성 미생물 불활성화 효능 입증

초록

본 연구에서는 높은 단일항 산소 양자 수율과 효율적인 활성산소종(ROS) 생성 능력을 가진 수용성 풀레레놀 [C₆₀(OH)₄₆]을 성공적으로 제조하였다. 또한 노출된 하이드록실 기 조성이 더 높은 수용성 C₆₀(OH)₄₆은 낮은 조성 물질 대비 우수한 이광자 안정성과 특성을 보여, 효과적인 이광자 광감작제(Photosensitizer, PS)로 활용 가능함을 입증하였다. 제조된 수용성 C₆₀(OH)₄₆은 우수한 이광자 특성을 가졌다. 이광자 광역학 치료 중, 수용성 C₆₀(OH)₄₆은 760nm 광여기 파장, 800회 스캔, 픽셀당 211.2nJ 초저에너지 조건에서 Escherichia coli에 대해 강력한 항균 활성을 나타냈다.

서론

지난 수십 년간 다양한 광감작제(PS) 분자가 합성되었으나[1], 기존 PS들의 임상 적용에는 여러 문제가 있다. 대부분 PS 분자는 소수성이라 수용액에서 쉽게 응집되어 양자 수율(QY)이 떨어진다[2]. 또한 응집된 PS는 정맥 주사 투여가 어렵고, 병변 조직에 선택적으로 축적되어 정상 세포 손상을 막아야 한다. 이런 문제들로 효과적인 PS 캐리어 개발은 광역학 치료(PDT)의 주요 과제로 남아있다[3-11]. 이에 나노입자를 PS 캐리어로 활용하려는 관심이 증가하고 있다.

나노바이오기술 발전으로 탄소 원자만으로 구성된 신종 나노구조, 즉 풀러렌 C₆₀(직경 0.72nm 구형 분자)의 생물의학적 응용이 주목받고 있다. 무독성이며 독특한 물리화학적 특성을 지닌다. 소수성 C₆₀의 작은 크기는 생체분자와의 입체적 적합성을 부여하고 막 소수성 영역으로의 통합을 촉진한다[12,13]. 확장된 π-공액 시스템으로 자외선-가시광(UV-vis) 흡수, 근 100% 단일항 산소 QY(Φ_Δ)로 ROS 생성, PS로서 PDT 활용이 가능하다[14-17]. 다만 C₆₀은 극성 용매에서 용해도가 극히 낮아 의학적 적용이 제한된다. 이중 결합 존재로 화학적 변형이 용이해 수용성 C₆₀ 유도체 합성이 가능하며, 신경보호, 약물/유전자 전달, 광감작, 바이오센싱 등 의료 응용 기회가 열렸다.

다광자 레이저 현미경(이광자 레이저 현미경)은 국소적 '비선형' 여기로 얇은 래스터 스캔 평면 내 형광만 여기한다[18]. 근적외선(NIR) 레이저 여기와 결합해 조직 투과 깊이, 산란 적음, 저에너지 흡수, 광표백 감소 장점으로 두꺼운 조직 및 깊은 생체 시료 형광 현미경 선호 기술이 되었다[19,20]. 다른 광여기 치료에도 광범위 적용[21,22]. 초저에너지와 짧은 광여기 특성으로 이광자 현미경은 PDT 대안으로 고려된다[23]. 일부 PS는 독성이 있으나[24,25], 높은 Φ_Δ PS가 PDT 우선순위다. 높은 Φ_Δ는 이광자 기술로 광특성 분자 활성 평가 및 비선형 현미경 연구 효율 수행 시 바람직한데, 시료에 흡수된 에너지/입사 에너지 비율이 높아 시료 광손상 최소화 때문이다[26]. 그러나 이광자 특성 물질을 PDT에 활용한 연구는 없었다. 본 연구는 강한 전자 공여 능력과 큰 π-공액 시스템을 가진 수용성 하이드록실화 풀레레놀로 전하 전달 효율 증대, 이광자 특성 향상을 도모했다. 구체적으로 수용성 하이드록실화 C₆₀(OH)₄₆을 유도해 이광자 PS로 활용, 초저에너지 펨토초 레이저 조사(211.2nJ/pixel, 파워 2.112mW, 목적렌즈 후 계산법은 '재료 및 방법' 및 그림 1a 참조. x-y 초점 및 z축 해상도 약 0.37538, 0.90159μm) 및 800회 스캔, 이광자 여기(TPE, 여기 파장 760nm)만으로 효과적 미생물 제거 달성. 총 유효 노출 시간 약 3.2621초, 스캔 속도 4.0776ms/scan, 스캔 영역 200×200μm²(상세 계산은 '재료 및 방법' 참조). 수용성 하이드록실화 C₆₀(OH)₄₆은 그람음성균 E. coli를 근 100% 제거하였다. 또한 더 높은 하이드록실 기 조성의 수용성 C₆₀(OH)₄₆이 TPE 하에서 낮은 조성 물질 대비 우수한 이광자 광특성을 보여, 동시 PDT로 악성 미생물 제거에 상당한 잠재력이 있음을 입증하였다.

재료 및 방법

수용성 풀레레놀 C₆₀(OH)₂₁ 및 C₆₀(OH)₄₆ 제조 및 특성 분석[27]

원료 풀러렌 상업 구입(Sigma-Aldrich, 미국). 선행 연구대로 C₆₀(OH)₁₂ 전구체 제조. 30% 과산화수소 용액(100mL)에 C₆₀(OH)₁₂ 0.5-1.0g 가해 60°C 공기 중 격렬 교반. 냉각 후 2-프로판올, 디에틸에테르, 헥산 혼합 용매(각 100-200mL) 첨가, 원심분리 및 상등액 제거. 잔여 고체를 디에틸에테르 200mL로 2회 세척(원심분리/상등액 제거). 진공 건조(실온, 하룻밤)로 수용성 C₆₀(OH)₂₁과 C₆₀(OH)₄₆ 최종 생성물 획득. 열중량 분석으로 무게 보정. 고분해능 투과전자현미경(HR-TEM, JEOL 3010, 일본)으로 형태 관찰, 해상도 약 1.11±0.03nm(C₆₀(OH)₂₁), 1.13±0.04nm(C₆₀(OH)₄₆). 동적 광산란(DLS, Malvern Nano-ZS90, 영국)으로 크기 측정. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR, RX1, PerkinElmer, 미국)으로 노출 작용기 분석. UV-vis 분광법(U-4100, Hitachi, 일본). X선 광전자 분광법(XPS, PHI 5000 VersaProbe, 미국)으로 표면 화학 분석. 전계 탈착(FD) 질량분석기(AccuTOF GCx-plus, JEOL, 일본)로 분자량 측정, 하이드록실 기 개수 각각 21, 46개 확인.

세균 배양[28]

자체 실험실 보유 E. coli를 LB 한천 배지(리터당: 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨 8g, 한천 15g, pH 7.5)(Sigma-Aldrich)에서 37°C 배양.

집락 형성 단위(CFU) 계수법 생체적합성 분석[28]

E. coli(OD₆₀₀~0.05)에 물질(0-9μg/mL) 첨가, 37°C 3시간 배양(추가 파일 1: Fig. S1). 배양 후 원심분리, 세균 펠릿 희석(OD₆₀₀~0.05). 10^-5~10^-8 희석 후 한천 평판 도말. 37°C 하룻밤 배양. 생존 균 수 결정, CFU/mL 단위 백분율(%)로 표현. 평균 ± SD, n=6.

Φ_Δ 측정[29,30]

선행 연구법으로 Φ_Δ 측정. D₂O 중 355nm에서 meso-테트라(4-설포나토페닐)포르핀 이염산염(TSPP, Sigma-Aldrich) 기준 물질(Φ_Δ=0.64) 사용.

형광 양자 수율(QY) 측정[31,32]

대조군 상대 광발광(PL) QY는 방출 광자/흡수 광자 비율로 다음 식(1)으로 계산:

QY = QY_ref (η²/η_ref²) (I/A) (A_ref/I_ref) (1)

QY_ref=0.28(Cy5.5 DMSO 용액, Sigma-Aldrich), η=1.33(ddH₂O 굴절률, η_ref=1.48 DMSO), I=적분 형광 강도, A=여기 파장 흡광도. 단일광자 여기(OPE)나 이광자 여기(TPE)나 같은 QY 산출.

펨토초 레이저 광학 시스템: 이광자 흡수(TPA) 및 이광자 발광(TPL) 측정[23,28,33-38]

자체 제작 펨토초 티타늄-사파이어(ti-sa) 레이저 시스템(반복률 80MHz, Tsunami, Spectra-Physics, 미국) 사용.

TPA 측정

갈바노미터 스캐너 속도 2m/ms, 여기 스펙트럼 720-820nm, 여기 파워 2.8mW[목적렌즈 전 파워; 목적렌즈 후(시료 위) 파워 0.9856mW 또는 98.56nJ/pixel]. 이로 풀레레놀 상대 TPA 스펙트럼(여기 파장 함수) 측정.

TPL 스펙트럼 측정

물질을 760nm 여기 파장, 200×200μm² 스캔 영역, 10kHz 주파수, 노출 시간 1.638s/(scan, pixel)=100μs, 128×128 pixels/scan, 픽셀 면적 1562.5×1562.5nm² 조건에서 펨토초 레이저 TPE 노출. 초점 스팟 면적 = πd²/4, d=0.61λ/NA(빔 허리 반치전폭). 예: 760nm 여기, ×40 오일 침지 대물렌즈(NA 1.3)에서 d=0.61×800nm/1.3=375.38nm=0.37538μm, z축 해상도 0.90159μm 측정. 760nm 여기 시 개별 나노물질 스캔당 노출 시간 = (초점 스팟 면적/픽셀 면적)×100 = 4.0776ms, 총 노출 시간 t = 4.0776ms × 스캔 수. ×40 오일 침지 대물렌즈(NA 1.3)로 신호 수집, 분광광도계 검출 범위 300-695nm.

레이저 파워(mW 또는 nJ/pixel) 계산법: ×40 오일 침지 대물렌즈(NA 1.3)에서 760nm 투과율 약 88%, 레이저 출력이 목적렌즈 도달 시 40%만 전달(손실). 목적렌즈 후(시료 위) 계산 에너지 = P_output(mW)×40%×88% = 0.352×P_output(mW). 예: P_output=2.8mW → 0.9856mW. 10kHz 스캔율(펄스당 0.1ms 체류) 시 시료 위 에너지(J/pixel) ≈ P_output(mW)×40%×88%×0.1ms = 0.0352×P_output(J/pixel). 예: 2.8mW → 98.56nJ/pixel. 본 논문 전반에 목적렌즈 후 파워(시료 위) 사용 표기.

TPE 절대 단면적 측정[24,36-48]

펨토초 레이저 시스템으로 발광 신호 측정해 TPE 절대 단면적 측정. 플루오레세인, 로다민 B(Sigma-Aldrich) TPL 검증. 결과 그림 1b, 여기 파워 704nJ/pixel(7.04mW)~2816nJ/pixel(28.16mW) 범위에서 방출 강도-여기 파워 의존성 측정. 플루오레세인 지수 2.03, 로다민 B 2.02로 2차 의존성 확인, TPE 발광 입증. 선행 연구[39,40] 및 Prof. Chris Xu 웹사이트(https://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.html) 참조: 760nm 여기에서 플루오레세인, 로다민 B 행동 단면적 각각 36.4, 68.0 GM(1 GM=10^-50cm⁴s photon^-1). 본 연구 계산값 36.5, 66.1 GM으로 5% 미만 오차. 로다민 B를 표준 기준으로 삼아 수용성 C₆₀(OH)₂₁, C₆₀(OH)₄₆ 풀레레놀 TPE 절대 단면적 각각 약 1230.51 GM, 1037.21 GM 계산(표 1, 3). 물질 배치 간 이광자 특성 및 이광자 광역학 능력 편차 없음.

펨토초 레이저 광학 시스템(형광 수명 현미경, FLIM)[39,45]

자체 제작 펨토초 ti-sa 레이저 시스템(반복률 80MHz, Tsunami, Spectra-Physics) 사용. TPE(Ex, 760nm) 하 방출 모니터링하며 삼지수 방정식 피팅으로 수명 데이터 및 파라미터 생성.

복사/비복사 붕괴 속도 계산[46]

PL QY와 수명은 다양한 환경에서 형광 염료 방출 특성 연구 주요 파라미터. QY(Q)는 식(2)로 표현:

Q = Γ/(Γ + k) (2)

Γ=복사 붕괴 속도, k=비복사 붕괴 속도. 형광 수명(τ)은 전자 여기 상태에서 바닥 상태로 붕괴 평균 시간. TPL 수명 τ도 붕괴 속도와 식(3) 관계:

τ = 1/(Γ + k) (3)

식(2),(3)으로 복사/비복사 붕괴 속도 계산. 광자 흡수 시 약결합 전자 여기 상태 A*로 전이. 준안정 상태 A*는 복사적(형광 광자 hν 방출) 또는 비복사적(열 방출) 경로로 바닥 상태 A로 복귀. 야블론스키 다이어그램으로 흡수/방출 과정 설명. 형광 수명 τ = 1/(Σ 비활성화 속도). 비복사 속도 상수 k = k_ic(내부 전환) + k_isc(삼중항 교차). 카샤 규칙: 형광 방출은 항상 첫 번째 전자 여기 단일항 상태(S₁) 최저 진동 준위에서 발생, 여기 경로 기억 없음 → OPE와 TPE가 같은 형광 스펙트럼, QY, 수명 산출.

레이저 노출 후 세균 생존율 결정[28]

CFU 계수법

세균(OD₆₀₀~0.05)에 물질(3 또는 6μg/mL) 첨가, 37°C 암소 3시간 배양. 원심분리, 펠릿 희석(OD₆₀₀~0.05) 후 TPE 파워 211.2nJ/pixel, 800스캔(총 유효 노출 시간 ~3.2621초, Ex 760nm) 조사. 10^-5~10^-8 희석 후 한천 평판 도말, 37°C 하룻밤 배양. 생존 균 수 결정, CFU/mL 백분율(%) 표현. 평균 ± SD, n=6.

LIVE/DEAD 키트

동일 전처리 후 TPE 조사. 펠릿을 LIVE(SYTO 9, 녹색 형광)/DEAD(프로피디움 요오드화물 PI, 적색 형광) 키트(Thermo Fisher)로 염색. 세균 생존율 정량으로 항균 테스트. 거의 모든 나노물질 처리 세균이 사멸. CFU 계수법과 유사한 생존율로 PDT 항균 효능 입증. 평균 ± SD, n=6.

ROS 검출[23,29,34,35,49-55]

단일항 산소(¹O₂)

(a) 물질(3 또는 6μg/mL)에 세균(OD₆₀₀~0.05) 처리, 37°C 암소 3시간 배양. TPE 광여기(211.2nJ/pixel, 800스캔, Ex 760nm) 후 Singlet Oxygen Sensor Green(SOSG) 시약(1μM, Thermo Fisher) 혼합(Ex/Em: 488/525nm). 형광 분광광도계 측정. ROS 중화 위해 30ppm 항산화제 α-토코페롤/메틸 리놀리에이트(Sigma-Aldrich) 암소 혼합 후 동일 TPE 처리. (b) 동일 전처리 후 TPE 조사, trans-1-(2'-메톡시비닐)피렌(t-MVP, Thermo Fisher)/0.10M SDS(Sigma-Aldrich) 혼합(Ex/Em: 352/465nm). ROS 중화 동일. t-MVP가 ¹O₂와 반응해 다이옥세탄 중간체 생성 후 1-피렌카복스알데히드로 분해되며 형광. 이 고선택성 프로브는 하이드록실 라디칼, 초과산화물, 과산화수소 등 다른 활성 산소종과 반응 안 함. 형광 분광광도계 측정.

초과산화물 라디칼 음이온(O₂^•-)

(a) 동일 전처리 후 TPE 조사, XTT(0.45mM, Sigma-Aldrich) 혼합. XTT가 O₂^•-와 반응해 XTT-포르마잔 생성, 강한 흡수(470nm). UV-vis 분광광도계 모니터링. ROS 중화 동일. (b) 동일 전처리 후 TPE 조사, 50mM 중탄산염 완충액(pH 8.60) 및 글루타치온(GSH, γ-L-글루타밀-L-시스테이닐-글리신, Sigma-Aldrich)/0.80mM 중탄산염 완충액(엘만 분석법) 혼합. 선행 연구 절차 따름. GSH 손실(%) = (시료-음성대조군 흡광도 차이)/음성대조군 흡광도. 생성 O₂^•- 신호 획득. 평균 ± SD, n=6.

섭취 분석[35]

E. coli(OD₆₀₀~0.05)를 3μg/mL 물질과 배양. 3μg/mL 물질 흡광도 UV-vis 기록(Abs, ~203nm). 물질과 E. coli 혼합, 37°C 1~10시간 각각 배양, 원심분리(1200rpm)해 상등액 흡광도 측정. 상등액과 원료 물질 흡광도 차이로 각 시점 섭취율(%) 산출. 평균 ± SD, n=6.

통계 분석[56]

분산 분석(ANOVA)으로 통계적 유의성 검정. 모든 처리에 대해 p값 유의성 기준 적용.

결과 및 고찰

수용성 풀레레놀 특성 분석

선행 연구법[27]으로 합성한 수용성 C₆₀(OH)₄₆(풀레레놀)은 원형 단분산 입자였다. 평균 측면 크기 약 1.13±0.04nm(저배율 TEM 그림 2a, HR-TEM 그림 2b). 양호한 결정성과 격자 간격 확인, 풀레레놀 {11̄00} 격자 무늬 d-간격과 대응. 다만 pH 7.0 수용액에서 수소 결합으로 응집체 형성(평균 ~130nm, DLS 분석). 이 응집체는 pH 7.0 수용액, 1× PBS, 배양 배지 등 다양한 생리 환경에서 3개월 안정 유지(추가 파일 1: Table S1). UV-vis 흡수 스펙트럼에서 약 216, 309nm 흡수 피크 관측, 각각 방향족 C=C 결합 π-π* 전이, C=O 어깨 n-π* 전이 기인. 풀레레놀 π-전자 전이에 산소 관여(그림 2c), 수용성 분산액 전형적 특성으로 풀레레놀 존재 확인. FTIR, XPS, 질량분석 추가 특성 분석으로 제조 물질 특성 확인. FTIR로 노출 작용기 분석: ~1109cm^-1 C-O 신축(밴드1), ~1271cm^-1 페놀성 C-OH 신축(밴드2), ~1422cm^-1 3급 알코올 C=O 신축(밴드3), ~1674cm^-1 C=C 신축(밴드4), ~1721cm^-1 C=O 신축(밴드5), ~3318cm^-1 C-H 분자간 수소결합/카복실산 O-H 신축(밴드6). CO₂ 간섭 밴드도 관측. 이 밴드들로 노출 하이드록실/카보닐 기 및 방향족 C=C 결합 확인(그림 2d). XPS로 표면 화학 분석: 풀레레놀은 주로 탄소 원자. C(1s) 디콘볼루션 스펙트럼에서 비산소화 고리(C-C/C=C, 286.1eV), C-O 결합(286.9eV), C=O 결합(288.0eV) 확인. O(1s)/C(1s) 비율 약 35.8%(그림 2e). FD 질량분석으로 분자량 측정(추가 파일 1: Fig. S2), 하이드록실 기(C-OH) 개수 46개 확인, 원자 비율 및 결합 조성(그림 2 표 요약)과 일치. 이 특성 분석 결과로 풀레레놀 합성 성공 확인.

TPE 하 수용성 풀레레놀 ROS 생성

PS는 빛 에너지 흡수해 비흡수 분자에 전달, ROS 생성으로 표적 세포 사멸, 종양 혈관 손상, 항종양 면역 활성화. PS 분자 오비탈 전자 배열 특이적. 기저(단일항) 상태에서 저에너지 오비탈에 반대 스핀 전자쌍. 적정 파장 빛 흡수로 스핀 변화 없이 고에너지 오비탈로 전자 들뜸 → 단명(나노초) 여기 단일항(S₁) 상태. 형광/열 방출로 기저 복귀 가능. 또는 S₁ 상태에서 계간 교차(Intersystem crossing)로 들뜬 전자 스핀 반전 → 장수명(마이크로초) 여기 삼중항(T₁) 상태. 삼중항-단일항 복사 전이는 스핀 변화 필요로 느림. T₁ 상태에서 인광 방출, 다른 분자 에너지 전달, 내부 전환/복사 없는 전이(다른 분자 충돌)로 에너지 손실 가능. T₁ 상태 수명 길수록 타 분자 충돌 확률 높고 ROS 생성 유리[57-59]. 수용성 풀레레놀 광감작으로 장수명 T₁ 상태 전이, 산소에 에너지/전자 전달로 ¹O₂, O₂^•- 등 ROS 생성, PDT 주요 역할. 따라서 적정 파장/에너지 빛, 산소, 삼중항 여기 수용성 C₆₀(OH)₄₆ 결합 PDT 개시, SOSG, t-MVP, XTT, GSH 시약 도입[33,34,49-51]으로 ¹O₂, O₂^•- 직접 검출. 물질 잠재 살균 능력 활용 위해 ~760nm 파장이 TPE 하 수용성 C₆₀(OH)₄₆ 상대 최대 TPA 비율 유도에 최고 효율적임 확인(그림 3a), 밴드간 전이 기인[52]. 후속 실험에 이 파장 사용. 수용성 C₆₀(OH)₄₆을 211.2nJ/pixel, 800스캔(Ex 760nm, 총 유효 노출 ~3.2621초) TPE로 광여기, 3 또는 6μg/mL 투여(추가 파일 1: Table S2). ROS 관여 확인 위해 α-토코페롤로 ROS 중화[49,53]. α-토코페롤 첨가 후 ROS 생성량 감소, 세균 생존율 증가 확인. ROS 생성량은 투여 용량 의존적. 백색광 우발 노출로 ¹O₂, O₂^•- 생성 가능성 배제 위해[60] 후속 PDT 실험 암소 수행. 본 연구 ¹O₂, O₂^•- 생성량 중심. 수용성 C₆₀(OH)₄₆ 상당한 항균 효과, PDT 적용 잠재력 입증. 동일 실험에서 수용성 C₆₀(OH)₂₁(추가 파일 1: Figs. S3, S4; 그림 3a)은 ¹O₂, O₂^•- 형성 효율이 C₆₀(OH)₄₆ 대비 낮음(추가 파일 1: Table S2). 수용성 C₆₀(OH)₄₆이 더 많은 ¹O₂, O₂^•- 생성. Φ_Δ 값 각각 약 0.93, 0.85(참고: TSPP D₂O 용액 Φ_Δ=0.64[29,30]).

TPE 이용 항균 능력 결정

항균 실험 전 수용성 풀레레놀 독성 검사로 세균 제거 기여 인자 배제. 백색광 우발 노출로 ROS 생성 가능성 차단 위해[35] PDT 실험 암소 수행. 그람음성 E. coli 실험 템플릿 사용. CFU 계수법으로 생존 균 수 결정(백분율, CFU/mL 대응). 세균을 두 수용성 풀레레놀(용량 0-9μg/mL)로 처리, 37°C 암소 3시간 배양, OD₆₀₀ 흡광도 측정(OD₆₀₀~0.05; 추가 파일 1: Fig. S1). 물질 처리 세균 증식 수준 600nm 흡광도 모니터링. 초기 0.05 OD₆₀₀에서 두 물질 모두 시간 경과 ~0.37 도달. 두 물질 모두 세균 증식 억제 안 함. 생존 균 수 약 0 log₁₀ 감소(그림 3b), 생존율 ~100%(그림 3c). 물질들 세균과 우수한 생체적합성 확인. 37°C 암소 3시간 배양 물질들로 실험 진행. 수용성 풀레레놀 ROS 생성 가능하나, 물질-시약(SOSG, t-MVP, XTT, GSH) 상호작용으로 위양성 ROS 신호 가능성 배제 위해[52] 본 연구 세균 도입 처리. 광여기 물질 처리 E. coli ROS 생성량 관측. 표 2 관측 ROS량, Table S2-S3(추가 파일 1: 물질 단독, 물질 처리 그람양성 Bacillus subtilis) 경향 유사, 1270nm 물질 ¹O₂ 인광 신호(그림 3d)와 일치. E. coli 대상 PDT: 저에너지 조사(211.2nJ/pixel, 800스캔, 총 유효 노출 ~3.2621초, Ex 760nm). 이광자 광여기 물질 처리 E. coli 생존율 영향 결정(그림 4). 세균 단독(레이저 유무 무관), 레이저 미조사 물질 처리 패널에서 살균 효과 없음(그림 4a). TPE 후 세균 생존율 낮음: 수용성 C₆₀(OH)₂₁ 처리 패널 생존율 ~15%(약 0.823 log₁₀ 감소, 그림 4b). 반면 수용성 C₆₀(OH)₄₆ 처리 패널 생존율 ~0(100% 제거 효율, ~7.736 log₁₀ 감소). 용량 증가 시 두 물질 모두 완전 살균 효과(그림 4c,d). 광여기 후 세균 종류(그람음성 E. coli vs 그람양성 B. subtilis) 간 항균 효과 차이 없음(추가 파일 1: Fig. S5). 동일 조건에서 더 높은 하이드록실 기 조성 풀레레놀이 낮은 조성 대비 살균 능력 우수.

TEM 관찰 및 이광자 특성 조사

광여기 후 물질 처리 세균 파괴 관찰 위해 고효율 PDT 보인 수용성 C₆₀(OH)₄₆ 선택, TEM 이미징. 맨 E. coli(그림 5a) 3시간 풀레레놀 배양 시 세균 표면 상당량 물질 흡착. 비정상 형태 없어 정상 생존 세균 형태(그림 5b). 섭취 분석 결과 물질 세균 표면 흡착, 초기 3시간 내 약 85% 급증률(그림 5c), 3-10시간 포화. 물질이 세균 표면 흡착해 외부 장벽 형성. 그러나 3일 배양 후 E. coli 왜곡된 외형, 심각한 형태 변화(그림 5d), 0.940 log₁₀ 감소(~18% 생존율, 그림 5f; 추가 파일 1: Fig. S6). 물질 흡착/코팅으로 필수 영양소 흡수 억제, 막(벽) 투과성 변화, 내부 삼투압 불균형 유발, 미생물 성장 억제. 즉, 수용성 풀레레놀 3일 배양 후 항균(정균/살균) 효과. 반면 광여기 물질 처리 세균, 특히 E. coli는 3시간 배양 후 독특한 형태, 심각한 손상(그림 5e,f; 추가 파일 1: Fig. S6). 세균 표면 열 발생 기포 없어 광여기 후 광열 효과 없음(추가 파일 1: Fig. S7). E. coli 생존율 형광 정량도 확인(그림 6). 그림 6a 녹색 형광(생존 세균)으로 레이저 단독 처리 세균 대부분 무손상(그림 5a 일치). 물질+레이저 처리 후 적색 형광(사멸 세균) 검출(그림 6b, 그림 5e 일치). 항균 테스트용 생존율 정량. 물질 처리 세균 거의 완전 제거(그림 6c). CFU assay(그림 4a,b, 5f, 추가 파일 1: Fig. S6)로도 생존율 정량, 수용성 C₆₀(OH)₄₆ PDT 항균 효율 입증. 그림 4,5,6, 표 2, Table S2(추가 파일 1) 결과 종합: 수용성 C₆₀(OH)₄₆ 처리 E. coli가 광여기 감수성 높음 → 더 높은 사멸률, ROS 생성 증가, 심각한 형태 붕괴. C₆₀(OH)₂₁ 처리 대비 우수. 일반적으로 TPE 절대 단면적 크면 비선형 현미경 연구에 효율적(흡수 에너지/입사 에너지 비율 높아 시료 광손상 최소화)[39,40]. 이광자 기술로 생체 제제/탁한 조직 분자 활성 이미징 시 유리한 단면적 바람직[61]. 본 연구 수용성 C₆₀(OH)₄₆ TPE 절대 단면적 ~1037 GM(1 GM=10^-50cm⁴s photon^-1, 760nm 여기, 플루오레세인 기준[39,40]; 그림 1b, 표 1,3). 수용성 C₆₀(OH)₂₁ ~1230 GM, 선행 연구[62,63]와 유사. 이 절대 단면적들 이광자 과정 촉진. 수용성 C₆₀(OH)₄₆ 형광 이광자 과정으로 발현(그림 1b). 상대 형광 QY 약 0.02(Cy5.5 DMSO QY_ref=0.28 기준[31]), 절대 QY[64] 약 0.01, OPE/TPE 동일 QY[31]. 반면 C₆₀(OH)₂₁ 상대/절대 QY 더 낮음(0.06, 0.05). 풀레레놀 수명 조사. 복사/비복사 붕괴 속도 영향 QY, 수명 계산. 수용성 C₆₀(OH)₄₆ 평균 수명 ~7.797ns(관측 수명 0.149, 1.775, 19.679ns), C₆₀(OH)₂₁ ~5.251ns(그림 7, 표 4). 수용성 C₆₀(OH)₄₆ 복사/비복사 붕괴 속도 비 ~0.020(~2.565×10⁶s^-1 / ~1.257×10⁸s^-1), C₆₀(OH)₂₁ ~0.064(~1.143×10⁷s^-1, ~1.790×10⁸s^-1; 추가 파일 1: Table S4). 이는 수용성 풀레레놀 표면 하이드록실 기가 전자-정공쌍 비복사 재결합 유도, 고유 상태 방출 억제 탓. 그러나 풀레레놀 가장자리 하이드록실 기는 높은 점유 분자 오비탈 가질 수 있음. 하이드록실 기 간 강한 오비탈 상호작용으로 계간 교차(형광 생성 대신) 효율 증가, 높은 하이드록실 조성 나노물질 삼중항 다량 생성 → 높은 Φ_Δ 값, 야블론스키 다이어그램[65] 따라 산소 반응 유도. 결과적으로 초저에너지, 극단적 단시간 이광자 PDT 효과적 수행, 악성 종 관리 대안 제시.

결론

본 연구는 더 높은 하이드록실 기 조성 수용성 풀레레놀이 낮은 조성 물질 대비 우수한 광특성 가짐을 밝혔다. 우수한 광특성은 치료에 필요한 레이저 노출량과 물질량 감소 덕분. 높은 하이드록실 조성 풀레레놀은 높은 TPA, 유리한 TPE 절대 단면적, 높은 이광자 안정성 보여 이광자 PS로서 이광자 PDT(TPE 결합) 잠재력 입증. 이는 수용성 풀레레놀 표면 하이드록실 기가 전자-정공쌍 비복사 재결합 유도, 고유 상태 방출 억제 때문. 또한 가장자리 하이드록실 기가 높은 점유 분자 오비탈 가짐 → 하이드록실 기 간 강한 오비탈 상호작용 → 계간 교차 효율 증가(형광 대신) → 높은 하이드록실 조성 나노물질 삼중항 다량 생성 → 높은 Φ_Δ 값 → 야블론스키 다이어그램 따라 산소 반응. 결과적으로 초저에너지, 극단적 단시간 이광자 PDT 효과적 수행. 악성 종 관리 효율적 대안으로 향후 임상 적용 가능성 제시.

데이터 및 재료 가용성

모든 데이터셋은 본 논문 주문에 제시되어 있습니다.

약어

PS:

광감작제 (Photosensitizers)

QY:

양자 수율 (Quantum yield)

PDT:

광역학 치료 (Photodynamic therapy)

UV-vis:

자외선-가시광 (Ultraviolet-visible)

ROS:

활성산소종 (Reactive oxygen species)

Φ_Δ:

단일항 산소 QY (Singlet oxygen QY)

NIR:

근적외선 (Near-infrared)

TPE:

이광자 여기 (Two-photon excitation)

E. coli:

Escherichia coli

HR-TEM:

고분해능 투과전자현미경 (High-resolution transmission electron microscopy)

DLS:

동적 광산란 (Dynamic light scattering)

FTIR:

푸리에 변환 적외선 (Fourier-transform infrared)

XPS:

X선 광전자 분광법 (X-ray photoelectron spectroscopy)

FD:

전계 탈착 (Field desorption)

CFU:

집락 형성 단위 (Colony forming unit)

TSPP:

Meso-테트라(4-설포나토페닐)포르핀 이염산염

PL:

광발광 (Photoluminescence)

DMSO:

디메틸 설폭사이드 (Dimethyl sulfoxide)

OPE:

단일광자 여기 (One-photon excitation)

TPA:

이광자 흡수 (Two-photon absorption)

TPL:

이광자 발광 (Two-photon luminescence)

ti-sa:

티타늄-사파이어 (Titanium-sapphire)

NA:

수치 개구수 (Numerical aperture)

FLIM:

형광 수명 현미경 (Fluorescence lifetime imaging microscopy)

¹O₂:

단일항 산소 (Singlet oxygen)

SOSG:

단일항 산소 센서 그린 (Singlet Oxygen Sensor Green)

t-MVP:

Trans-1-(2'-메톡시비닐)피렌

O₂^•-:

초과산화물 라디칼 음이온 (Superoxide radical anion)

XTT:

2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카복사닐라이드

GSH:

글루타치온, γ-L-글루타밀-L-시스테이닐-글리신

S₁:

단일항 (Singlet)

T₁:

삼중항 (Triplet)

B. subtilis:

Bacillus subtilis

GM:

괴퍼트-마이어 (Goeppert-Mayer)