M2 대식세포 유래 마이크로RNA-18a, TGF-β 경로에서 TGFBR3 표적으로 비인두암 진행 촉진

초록

목적

비인두암(NPC)은 높은 전이와 침윤 특성을 가진 비인두 질환입니다. 종양 연관 대체 활성화(M2) 대식세포가 NPC와 연관됨이 입증되었습니다. 이를 바탕으로 본 연구는 M2 대식세포 유래 마이크로RNA-18a(miR-18a)의 NPC 내 메커니즘과 관여를 탐구하고자 합니다.

방법

말초 혈액 단핵구를 대식세포로 분화시키고 인터루킨-4로 M2형으로 분극시켰습니다. SUNE-1과 CNE2 세포에 miR-18a 또는 전환성장인자-베타 III 수용체(TGFBR3)를 복원 또는 고갈시킨 후 형질전환시켜 TGF-β 신호 경로 관여 하에 NPC 진행에서의 역할을 탐구했습니다. 다음으로 SUNE-1과 CNE2 세포를 miR-18a 또는 TGFBR3가 복원/고갈된 M2 대식세포와 공동 배양해 TGF-β 신호 경로 관여 하에서의 복합적 역할을 이해했습니다.

결과

NPC 세포에서 miR-18a는 고발현, TGFBR3는 저발현이었습니다. miR-18a 복원, TGFBR3 녹다운, 또는 miR-18a 모방체나 si-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와의 공동 배양은 SUNE-1 세포 진행, 생쥐 종양 성장 촉진, p-Smad1/t-Smad1 감소, p-Smad3/t-Smad3 증가를 유도했습니다. miR-18a 저하, TGFBR3 과발현, 또는 miR-18a 억제체나 OE-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와의 공동 배양은 CNE2 세포 진행, 생쥐 종양 성장 억제, p-Smad1/t-Smad1 증가, p-Smad3/t-Smad3 감소를 유도했습니다.

결론

본 연구는 M2 대식세포 유래 miR-18a가 TGFBR3 억제를 통해 Smad1 비활성화와 Smad3 활성화와 함께 NPC 세포 진행과 생쥐 종양 성장을 촉진함을 규명했습니다.

서론

비인두암(NPC)은 국소 침윤과 조기 원격 전이 경향이 있는 상피성 악성 종양입니다[1]. NPC 환자는 흔히 제6뇌신경 마비와 호르너 증후군을 호소합니다[2]. 현재 주된 치료는 방사선 요법, 방사선-화학요법 병용입니다[3]. 불행히도 방사선/화학요법은 예기치 못한 합병증을 동반하며, 방사선 내성 획득이 NPC 치료 성과를 저해합니다[3]. 잠재적 표적 치료 발굴이 시급한 과제입니다.

조절 장애 마이크로RNA(miRNA)는 NPC 종양 발생, 전이, 침윤, 방사선/화학요법 내성에 관여하는 것으로 기록되어 있습니다[1]. miRNA 하위군인 miR-18a는 생식기 형태형성 억제제 1 저해와 mTOR 경로 활성화를 통해 NPC 진행을 촉진하는 것으로 밝혀졌습니다[4]. 또한 miR-18a는 DICER1 조절을 통해 NPC 세포 증식과 전이를 활성화하는 것으로 검증되었습니다[5]. 더불어 miR-18a는 miRNA 생합성 손상을 통해 NPC 세포 진행을 유도하는 것으로 입증되었습니다[6]. 게다가 miR-18a는 NPC 전이에서 결정적 역할을 하는 것으로 기록되었습니다[7]. 대체 활성화(M2) 대식세포는 고형 및 혈액 악성 종양의 중요한 구성 요소로 진행, 전이, 치료 내성과 연관됩니다[8]. M2 분극 종양 연관 대식세포는 NPC 불량 예후와 관련됩니다[9]. 엡스타인-바 바이러스 음성/양성 NPC에서 M2 대식세포 차이도 흥미롭게 기록되었습니다[10]. miR-18a가 M1 대식세포 유도로 대장암 세포 간 전이를 억제한다는 연구도 있습니다[11]. 전환성장인자-베타 III 수용체(TGFBR3)는 TGF-β 보조 수용체로 제2형 TGF-β 수용체 리간드를 제공해 신호 전달을 자극하고 세포 표면 균형을 유지하며, 가용성 TGFBR3는 암 진행 중 조절자입니다[12]. 저발현 TGFBR3는 면역 관용 종양 미세환경을 유도한다고 보고되었습니다[13]. 반대로 TGFBR3 일시적 과발현은 인간 NPC 세포에서 세포자멸사를 유도합니다[14]. miR-181a 유도 M2 대식세포 분극이 Kruppel-like factor 6과 CCAAT/enhancer binding protein α 축을 통해 M2 대식세포 매개 종양 세포 전이를 촉진한다는 연구도 있습니다[15].

종합하면 많은 연구가 miR-18a, TGFBR3, M2 대식세포의 NPC 내 독립적 역할을 발견했으나, 이 세 인자 간 복합적 상호작용은 여전히 불분명합니다. 본 연구는 이들 인자의 NPC 내 메커니즘과 관여를 해명하고자 수행되었습니다.

재료 및 방법

윤리적 승인

실험은 중앙대학 제3향야병원 윤리위원회 승인을 받았으며 의료 윤리 기준을 충족했습니다. 본 연구는 모든 기증자의 서면 동의를 얻어 수행되었습니다. 동물 실험은 국가 실험동물 관리 및 사용 규정을 준수했습니다.

말초 혈액 단핵구 수집

건강한 기증자 말초 혈액에서 부착법으로 단핵구를 얻었습니다. 말초 혈액 시료는 중앙대학 제3향야병원 혈액학과 건강한 기증자로부터 얻었습니다. 단핵구 유래 대식세포는 밀도 기울기 원심분리(Ficoll-Paque, GE Healthcare)로 이전에 분리된 말초 혈액 단핵구(PBMCs)를 버피 코트 제제에서 플라스틱 부착법으로 얻었습니다. 2.0 × 10⁶ PBMCs를 10% 인간 혈청(Millipore, Bedford, MA, USA)과 페니실린/스트렙토마이신을 보충한 Dulbecco 변형 Eagle 배지(DMEM)에서 12웰 플레이트(NalgeNunc, NY, USA)에 배양했습니다. PBMCs가 2-3시간 부착되면 상청액과 부유 PBMCs를 반복 제거해 부착 단핵구를 얻었습니다.

대식세포 분화

단핵구를 인간 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)로 대식세포로 분화시키고 인터루킨(IL)-4로 M2 대식세포로 분극시켰습니다.

대식세포 유도

단핵구를 20% 태아 소 혈청(FBS)-DMEM에서 배양하고 M-CSF(100 μg, Peprotech, NJ, USA)를 최종 농도 100 ng/mL로 첨가했습니다. 배지를 3일마다 절반씩 교체하고 100 ng/mL M-CSF를 보충했습니다. 7-8일 배양 후 일부 세포를 수확해 대식세포 표면 표지자 CD68[16], CD163[17], CD206[18]을 면역형광 분석[19]으로 검사해 대식세포를 확인했습니다.

대식세포 분극

대식세포를 분화 배지에 20 ng/mL IL-4(Peprotech) 보충으로 24시간 더 배양해 M2 대식세포로 분극시켰습니다. 일부 M2 대식세포 시료를 유세포 분석용으로 사용했습니다. 시료를 3개 튜브로 나눴습니다: 튜브 1은 IL-4 자극 없는 동일 배치 부착 대식세포, 튜브 2와 3은 IL-4 자극 부착 대식세포. 시료를 약 10,000개 세포로 희석해 로딩하고 비특이적 면역글로불린 G로 Fc 수용체 차단. 비특이적 동형 대조 항체, PE 표지 CD68 항체, PE 표지 CD163 항체(둘 다 Biolegend, CA, USA) 첨가. 30분 배양 후 0.5% 소 혈청 알부민 함유 인산완충생리식염수(PBS)로 세척, 원심분리 후 500 μL PBS로 세포 현탁액 만들어 검출.

역전사 정량적 중합효소 연쇄반응

역전사 정량적 PCR(RT-qPCR)로 수집 세포에서 miR-18a, CCL22, 과산화물 증식체 활성화 수용체 γ(PPAR-γ), TGFBR3 mRNA 발현을 검출했습니다. Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 세포 총 RNA 추출 후 Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit(Clontech, Mountain View, CA, USA)로 miR-18a를, PrimeScript RT Master Mix Kit(Takara, Dalian, China)로 CCL22, PPAR-γ, TGFBR3를 상보적 RNA로 역전사했습니다. U6와 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)를 miR-18a, CCL22, PPAR-γ, TGFBR3 로딩 컨트롤로 사용. SYBR Premix Ex Taq II(Takara)를 LightCycler 480 II 시스템(Roche Diagnostics, Indiana, USA)에서 PCR에 사용. 데이터 계산은 2^(-ΔΔCT) 법으로 평가. PCR 프라이머는 표 1에 제시.

웨스턴 블롯 분석

웨스턴 블롯으로 수집 세포에서 TGFBR3, 전체(t)-Smad1, 인산화(p)-Smad1, t-Smad3, p-Smad3 단백질 검출. 세포 총 단백질 추출 후 비시니코닌산 키트로 단백질 농도 결정. 단백질 시료를 SDS-PAGE 웰에 로드하고 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 전이. 탈지유로 막 차단 후 1차 항체 TGFBR3(1:2000, R&D Systems), t-Smad1(1:1000), p-Smad1(1:1000, Santa Cruz), t-Smad3(1:1000), p-Smad3(1:1000), GAPDH(1:1000, 모두 Abcam) 반응. 고추냉이 과산화효소 표지 2차 항체(1:500, Jackson ImmunoResearch) 반응. TBS-T로 3회 세척 후 향상된 화학발광으로 현상. NIH ImageJ 소프트웨어로 신호 강도 정량화, GAPDH로 정규화.

세포 배양 및 선별

인간 NPC 세포주 CNE2, TW03, C666-1, SUNE-1과 정상 비인두 세포주 NP96(중국과학원 상하이생명과학원)을 RPMI-1640 배지(Gibco)에 FBS(Gibco), 페니실린 100 μg/mL, 스트렙토마이신 100 μg/mL 첨가해 배양, 80% 컨플루언시 시 계대배양. RT-qPCR로 miR-18a 발현 검출. NPC 세포주 중 CNE2와 SUNE-1이 NP96과 miR-18a 발현 차이가 각각 가장 크고 작아 miR-18a 하향/상향 조절 분석용으로 선정.

세포 그룹핑 및 처리

모든 NPC 세포주 중 NP96과 miR-18a 발현 차이가 가장 작은 SUNE-1 세포를 선정. Lipofectamine 2000(Invitrogen) 지침에 따라 SUNE-1 세포를 miR-18a 모방체, miR-18a 모방체 음성 대조군(NC), si-TGFBR3, si-TGFBR3 NC로 형질전환.

NP96과 miR-18a 발현 차이가 가장 큰 CNE2 세포를 선정해 miR-18a 억제체, miR-18a 억제체 NC, 과발현(OE)-TGFBR3, OE-TGFBR3 NC로 Lipofectamine 2000으로 형질전환.

Lipofectamine 2000 지침에 따라 M2 대식세포를 miR-18a 모방체, miR-18a 모방체 NC, si-TGFBR3, si-TGFBR3 NC, miR-18a 억제체, miR-18a 억제체 NC, OE-TGFBR3, OE-TGFBR3 NC로 형질전환.

M2 대식세포와 NPC 세포 공동 배양

Transwell 챔버 공동 배양으로 M2 대식세포 유래 miRNA의 NPC 세포 영향 탐구. 상부 챔버에 M2 대식세포를 채우고 기공 크기 0.4 μm로 상부 챔버 세포만 통과 못 하게 하고 소포체, 성장 인자, 영양소 등 소분자는 통과시킴. 하부 챔버에 NPC 세포 도포.

SUNE-1과 CNE2를 정상 FBS(Gibco)에서 배양. 대수 증식기 세포를 실험에 사용.

SUNE-1과 CNE2 세포를 10% FBS-RPMI-1640 배지(모두 Gibco)에서 Transwell 삽입 세포 배양 접시(Coring, Corning, NY, USA, 기공 0.4 μm)로 공동 배양.

SUNE-1 세포: M2 대식세포와 비공동배양, 또는 공동배양(미처리 M2, miR-18a 모방체 형질전환 M2, miR-18a 모방체 NC 형질전환 M2, si-TGFBR3 형질전환 M2, si-TGFBR3 NC 형질전환 M2).

CNE2 세포: M2 대식세포와 비공동배양, 또는 공동배양(미처리 M2, miR-18a 억제체 형질전환 M2, miR-18a 억제체 NC 형질전환 M2, OE-TGFBR3 형질전환 M2, OE-TGFBR3 NC 형질전환 M2).

MTT 분석

세포 생존율은 MTT 분석으로 테스트. 미토콘드리아 탈수소효소 활성을 측정해 MTT를 포르마잔으로 환원하는 비교색 분석법. 트립신 처리 후 96웰 플레이트에 4 × 10⁴ cells/well로 시딩, 0, 12, 24, 36, 48시간에 배양액 제거 후 MTT 용액(500 μL, 0.5 g/L) 첨가. 4시간 배양 후 상청액 제거하고 200 μL DMSO 용액 첨가. 마이크로플레이트 리더(ELX808IU, BioTek)로 광학 밀도(OD, 490 nm) 측정. 각 군 6개 병렬 웰 설정.

집락 형성 분석

NPC 세포 집락 형성 능력은 집락 형성 분석으로 테스트. 세포 집단 의존성과 클론 증식 반영. 24시간 배양 후 0.25% 트립신으로 분리, 300개 세포를 35mm 접시 군당 3개 병렬 웰로 시딩. 배양액 3일마다 교체하며 1주일 배양 후 4% 파라포름알데히드 5 mL로 고정. 크리스탈 바이올렛 염색 후 자연 건조. 투명 격자 필름을 겹쳐 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 집락 수(50개 세포 이상) 계수.

스크래치 테스트

세포 이동은 스크래치 테스트로 측정. 세포 트립신 처리 후 6웰 플레이트 군당 3개 병렬 웰 시딩, 90% 컨플루언스 배양. 2% FBS 배지에서 100-μL 팁으로 수직 스크래치 생성. 0시간과 24시간에 역위 현미경으로 촬영해 세포 이동 거리 측정.

Transwell 분석

세포 침윤과 이동은 Transwell 분석으로 테스트. Transwell 상부 챔버를 미리 침투시키고 1:100으로 혈청 무함유 RPMI 1640으로 희석한 Matrigel(Coring) 100 μL 첨가. 상/하부 챔버에 각각 200 μL, 600 μL 혈청 무함유 RPMI 1640 첨가. 하부 챔버에 10% FBS 함유 RPMI 1640 600 μL, 상부 챔버에 세포 현탁액(12.5 × 10⁴ cells/mL) 200 μL 첨가. 40시간 배양 후 크리스탈 바이올렛 염색, 면봉으로 닦아 Matrigel 통과 세포 현미경 계수.

유세포 분석

세포 세포자멸사와 세포주기 분포는 유세포 분석으로 결정. 세포주기 분포는 요오드화 프로피디움(PI) 염색으로 평가. 세포를 6웰 플레이트 4 × 10⁵ cells/well 시딩, 70-80% 컨플루언스 배양. 예냉 70% 에탄올로 하룻밤 고정, 원심분리(상청액 제거), RNAase(1 g/L, 200 μL)와 Triton X-100(2 μL) 첨가, PI 염색액으로 30분 염색. 유세포 분석기(BD Bioscience, NJ, USA)로 488 nm에서 각 단계(G0/G1, S, G2/M) 형광 강도 차이로 세포주기 분포 검출.

세포 세포자멸사는 Annexin V-FITC와 PI 이중 염색으로 측정. 세포를 500 μL Binding buffer에 재현탁, 5 μL Annexin V-FITC 염색액과 10 μL PI 용액 염색. 유세포 분석기(BD Bioscience)로 30분 내 차광 조건에서 측정. 산점도에서 좌하 사분면(Q4) 생존 세포 FITC⁻/PI⁻, 우하 사분면(Q3) 초기 세포자멸사 세포 FITC⁺/PI⁻, 우상 사분면(Q2) 괴사/후기 세포자멸사 세포 FITC⁺/PI⁺. 세포자멸사율 = 초기 세포자멸사 비율(Q3) + 후기 세포자멸사 비율(Q2).

누드 마우스 종양 이식종

NPC 누드 마우스 모델 구축으로 종양 성장 관찰. 0.25% 트립신으로 분리, 대수기 SUNE-1과 CNE2 세포를 5 × 10⁷ cells/mL 단일 세포 현탁액 구성. 세포 현탁액(0.2 mL)을 마이크로인젝터로 마우스 오른쪽 겨드랑이 주사해 모델 구축. 모델 마우스를 특정 병원체 자유 환경에서 사육. 4일부터 종양 성장 관찰, 4일마다 체중 측정. 주사 후 20일째 마우스 안락사, 종양 절제 후 전자저울로 계중 및 촬영.

이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석

miR-18a와 TGFBR3 mRNA 3'비번역 영역(UTR) 결합 부위 확인 위해 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 시스템 채택. 생물정보학 예측 사이트(https://www.microrna.org/microrna/home.do)로 miR-18a 표적 유전자 분석, miR-18a가 TGFBR3 3'UTR에 상보적 결합 부위 존재 발견. 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석으로 TGFBR3가 miR-18a 직접 표적인지 추가 검증. pmirGLO-TGFBR3-야생형(WT)과 pmirGLO-TGFBR3-돌연변이형(MUT) TGFBR3 3'UTR 결합 부위 구축. TGFBR3-WT 또는 TGFBR3-MUT와 miR-18a 모방체 또는 모방체 NC를 Lipofectamine 2000으로 SUNE-1과 CNE2 세포에 공동 형질전환, 48시간 배양. 루시퍼라제 분석 키트(Promega, Madison, WI, USA)로 세포 분석.

통계 분석

SPSS 21.0(IBM Corp.) 통계 소프트웨어 사용. 데이터는 평균 ± 표준편차 표현. 두 군 간 차이는 t-검정, 다군 간 차이는 일원분산분석(ANOVA) 후 Tukey 사후 검정. P < 0.05에서 유의한 차이 인정.

결과

M2 대식세포 확인

부착법으로 농축된 단핵구와 M-CSF 유도 단핵구를 건강한 기증자 말초 혈액에서 수집. CD68, CD206, CD163 면역형광 검출로 M-CSF 체외 유도 PBMCs가 전형적 분자 특성을 가진 대식세포로 변했음을 확인, 요구사항 충족(그림 1a).

획득한 대식세포를 IL-4로 분극시키고 현미경으로 형태 관찰. IL-4 자극 없는 대식세포(M0)는 다양하고 불규칙하며 원형, 타원형, 방추형 형태 보임. IL-4 자극 후 M2 대식세포는 더 커지고 주로 원형이 되어 기존 기술된 M2 대식세포 형태적 특성과 일치[20](그림 1b).

유세포 분석으로 20 ng/mL IL-4 24시간 자극 부착 세포 표면 항원 검사: CD68 21.16%, CD163 98.69% 발현(그림 1c), 부착 세포가 M2 대식세포임 확인. RT-qPCR로 M0 세포 대비 M2 대식세포에서 CCL22와 PPAR-γ(전형적 분극 분자) 증가(그림 1d, e), M2 대식세포 성공적 유도 확인.

RT-qPCR로 M0 대식세포 대비 M2 대식세포에서 miR-18a 발현 증가(P < 0.05)(그림 1f).

NPC 세포에서 miR-18a 고발현, TGFBR3 저발현

생물정보학 사이트(miRanda)가 miR-18a 잠재 표적 예측, TGFBR3를 miR-18a 표적 중 하나로 고려(그림 2a). 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석으로 miR-18a가 TGFBR3 3'UTR 표적화 검증. TGFBR3-WT 또는 TGFBR3-MUT를 pmirGLO 벡터에 클로닝해 miR-18a 모방체 또는 NC와 SUNE-1, CNE2 세포에 공동 형질전환. miR-18a 모방체는 TGFBR3 3'UTR-MUT 루시퍼라제 활성에 영향 없으나 SUNE-1과 CNE2에서 TGFBR3 3'UTR-WT 활성 저해, TGFBR3가 miR-18a 조절 표적 유전자임 시사(그림 2b).

miR-18a 모방체 또는 억제체 형질전환 M2 대식세포에서 miR-18a와 TGFBR3 발현 RT-qPCR과 웨스턴 블롯으로 확인해 형질전환 효율 검증. miR-18a 과발현 시 M2 대식세포에서 miR-18a 발현 증가, TGFBR3 발현 감소(그림 2c). 반대로 miR-18a 억제 시 miR-18a 발현 감소, TGFBR3 발현 증가(그림 2d). si-TGFBR3 형질전환 시 miR-18a 발현 차이 없으나 TGFBR3 발현 감소. OE-TGFBR3 형질전환 시 miR-18a 발현 차이 없으나 TGFBR3 발현 증가.

CNE2, TW03, C666-1, SUNE-1, NP96 세포주에서 miR-18a와 TGFBR3 발현 RT-qPCR과 웨스턴 블롯으로 검사. NPC 세포에서 NP96 대비 miR-18a 발현 증가, TGFBR3 발현 감소(그림 2e). CNE2와 SUNE-1이 NP96과 miR-18a 발현 차이가 각각 가장 크고 작아 이후 miRNA 하향/상향 조절 분석용으로 선정.

miR-18a와 TGFBR3가 NPC 세포에 미치는 영향 확인 위해 SUNE-1에 miR-18a 모방체 또는 si-TGFBR3, CNE2에 miR-18a 억제체 또는 OE-TGFBR3 형질전환. RT-qPCR과 웨스턴 블롯으로 miR-18a 모방체는 SUNE-1에서 miR-18a 발현 증가, TGFBR3 발현 감소. si-TGFBR3는 miR-18a 발현 영향 없으나 TGFBR3 발현 감소. miR-18a 억제체는 CNE2에서 miR-18a 발현 감소, TGFBR3 발현 증가. OE-TGFBR3는 miR-18a 발영 영향 없으나 TGFBR3 발현 증가(그림 2f, g).

M2 대식세포 유래 miR-18a가 NPC 세포에 미치는 영향 탐구 위해 miR-18a 모방체/억제체, si-TGFBR3/OE-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포를 Transwell 챔버에서 SUNE-1 또는 CNE2 세포와 공동 배양. RT-qPCR과 웨스턴 블롯으로 SUNE-1 또는 CNE2 세포 내 miR-18a와 TGFBR3 발현 검사. SUNE-1 세포가 미처리 또는 miR-18a 모방체 형질전환 M2 대식세포와 공동 배양 시 miR-18a 발현 증가, TGFBR3 발현 저하. si-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와 공동 배양 시 miR-18a 발현 차이 없으나 TGFBR3 발현 감소(그림 2h). 미처리 M2 대식세포와 공동 배양한 CNE2 세포는 miR-18a 발현 증가, TGFBR3 발현 감소. 그러나 miR-18a 억제체 형질전환 M2 대식세포와 사전 공동 배양한 CNE2 세포는 miR-18a 발현 감소, TGFBR3 발현 증가. OE-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와 공동 배양한 CNE2 세포는 miR-18a 발현 차이 없으나 TGFBR3 발현 증가(그림 2i).

M2 대식세포 유래 miR-18a, NPC 세포 생존율과 집락 형성 능력 촉진

MTT 분석과 집락 형성 분석으로 miR-18a와 TGFBR3가 SUNE-1, CNE2 세포 생존율과 집락 형성 능력에 미치는 영향 확인. miR-18a 모방체, miR-18a 억제체, si-TGFBR3, OE-TGFBR3를 SUNE-1 또는 CNE2 세포에 형질전환. SUNE-1 세포에서 miR-18a 상향 조절 또는 TGFBR3 하향 조절 시 세포 생존율 증가, 집락 수 증가(그림 3a, e). CNE2 세포에서 miR-18a 억제 또는 TGFBR3 과발현 시 세포 생존율 저하, 집락 수 감소(그림 3b, f).

M2 대식세포 유래 miR-18a가 NPC 세포 생존율과 집락 형성 능력에 미치는 영향 조사 위해 miR-18a 모방체/억제체, si-TGFBR3/OE-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포를 Transwell 챔버에서 SUNE-1 또는 CNE2 세포와 공동 배양. MTT와 집락 형성 분석 결과 SUNE-1 세포가 미처리, miR-18a 모방체 형질전환, si-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와 공동 배양 시 세포 생존율 강화, 집락 수 증가(그림 3c, g).

미처리 M2 대식세포와 공동 배양한 CNE2 세포는 세포 생존율 강화, 집락 수 증가. 그러나 miR-18a 억제체 형질전환 또는 OE-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와 공동 배양한 CNE2 세포는 세포 생존율 감소, 집락 수 감소(그림 3d, h).

M2 대식세포 유래 miR-18a, NPC 세포 침윤과 이동 능력 촉진

miR-18a와 TGFBR3가 NPC 세포 이동과 침윤에 미치는 영향 이해 위해 스크래치 테스트와 Transwell 분석 수행. 결과: SUNE-1 세포에 miR-18a 모방체 또는 si-TGFBR3 형질전환 시 세포 이동 거리와 침윤 세포 증가(그림 4a, 5a).

CNE2 세포에 miR-18a 억제체 또는 OE-TGFBR3 형질전환 시 세포 이동 거리와 침윤 세포 감소(그림 4b, 5b).

M2 대식세포 유래 miR-18a가 NPC 세포 침윤/이동 능력에 미치는 영향 해독 위해 miR-18a 모방체/억제체, si-TGFBR3/OE-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포를 SUNE-1 또는 CNE2 세포와 공동 배양. SUNE-1 세포가 미처리, miR-18a 모방체 형질전환, si-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와 공동 배양 시 세포 이동 거리와 침윤 세포 증가(그림 4c, 5c).

미처리 M2 대식세포와 공동 배양한 CNE2 세포에서 세포 이동 거리와 침윤 세포 모두 증가. 그러나 miR-18a 억제체 형질전환 또는 OE-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와 공동 배양 시 CNE2 세포 이동 거리와 침윤 세포 감소(그림 4d, 5d).

M2 대식세포 유래 miR-18a, NPC 세포 G0/G1기 정체 감소 및 세포자멸사 억제

세포주기 분포와 세포자멸사 유세포 분석으로 miR-18a와 TGFBR3가 NPC 세포에 미치는 영향 층별 분석. miR-18a 모방체 또는 si-TGFBR3 형질전환 시 SUNE-1 세포 G0/G1기 감소, S기와 G2/M기 증가, 세포자멸사율 감소(그림 6a, 7a).

miR-18a 억제체 또는 OE-TGFBR3 형질전환 시 CNE2 세포 G0/G1기 증가, S기와 G2/M기 감소, 세포자멸사율 증가(그림 6b, 7b).

M2 대식세포 유래 miR-18a의 NPC 세포주기 분포와 세포자멸사 메커니즘 해독 위해 miR-18a 모방체/억제체, si-TGFBR3/OE-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포를 Transwell 챔버에서 SUNE-1 또는 CNE2 세포와 공동 배양. 미처리, miR-18a 모방체 형질전환, si-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와 공동 배양 시 SUNE-1 세포 G0/G1기 감소, S기와 G2/M기 증가, 세포자멸사율 감소(그림 6c, 7c).

미처리 M2 대식세포와 공동 배양 시 CNE2 세포 G0/G1기 감소, S기와 G2/M기 증가, 세포자멸사율 감소. 반대로 miR-18a 억제체 형질전환 또는 OE-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와 공동 배양 시 CNE2 세포 G0/G1기 증가, S기와 G2/M기 감소, 세포자멸사율 증가(그림 6d, 7d).

M2 대식세포 유래 miR-18a, NPC 세포에서 p-Smad1/t-Smad1 감소 및 p-Smad3/t-Smad3 증가

웨스턴 블롯으로 NPC 세포 내 TGF 신호 경로 관련 단백질 검출해 miR-18a와 TGFBR3가 TGF 신호 경로에 미치는 영향 추가 설명. miR-18a 모방체 또는 si-TGFBR3 형질전환 시 SUNE-1 세포에서 p-Smad1/t-Smad1 감소, p-Smad3/t-Smad3 증가(그림 8a).

miR-18a 억제체 또는 OE-TGFBR3 형질전환 시 CNE2 세포에서 p-Smad3/t-Smad3 감소, p-Smad1/t-Smad1 증가(그림 8b).

M2 대식세포 유래 miR-18a가 NPC 세포 내 TGF 신호 경로에 미치는 영향 확인 위해 miR-18a 모방체/억제체, si-TGFBR3/OE-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포를 Transwell 챔버에서 SUNE-1, CNE2 세포와 공동 배양 후 웨스턴 블롯으로 TGF 신호 경로 관련 단백질 검사. 미처리, miR-18a 모방체 형질전환, si-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와 공동 배양한 SUNE-1 세포에서 p-Smad1/t-Smad1 감소, p-Smad3/t-Smad3 증가(그림 8c).

미처리 M2 대식세포와 공동 배양 시 CNE2 세포 p-Smad1/t-Smad1 감소, p-Smad3/t-Smad3 증가 경향. 반대로 miR-18a 억제체 형질전환 또는 OE-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와 공동 배양 시 CNE2 세포 p-Smad1/t-Smad1 증가, p-Smad3/t-Smad3 감소(그림 8d).

M2 대식세포 유래 miR-18a, NPC 누드 마우스 종양 성장 유도

NPC 누드 마우스 종양 이식종으로 miR-18a와 TGFBR3가 NPC 종양 성장에 미치는 영향 추가 규명. miR-18a 모방체 형질전환 또는 si-TGFBR3 형질전환 SUNE-1 세포 주사 마우스에서 종양 부피 확대, 종양 중량 증가(그림 9a).

miR-18a 억제체 형질전환 또는 OE-TGFBR3 형질전환 CNE2 세포 주사 마우스에서 종양 부피와 중량 감소(그림 9b).

miR-18a 모방체/억제체, si-TGFBR3/OE-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포 주사 마우스에서 종양 성장 관찰로 M2 대식세포 유래 miR-18a의 NPC 내 메커니즘 설명. 미처리, miR-18a 모방체 형질전환, si-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와 공동 배양 후 주사한 SUNE-1 세포에서 마우스 종양 부피 확대, 중량 증가(그림 9c).

CNE2 세포를 M2 대식세포와 공동 배양 후 마우스 주사 결과 종양 부피와 중량 증가. 그러나 miR-18a 억제체 형질전환 또는 OE-TGFBR3 형질전환 M2 대식세포와 공동 배양한 CNE2 세포 주사 마우스에서 종양 부피와 중량 모두 감소 경향(그림 9d).

고찰

NPC는 광범위한 인자에 의해 위협받는 다유전자 질환입니다[21]. miRNA는 표적 유전자 조절을 통해 세포 과정과 경로 지표가 되어 NPC 발병 기전에 관여함이 시사되었습니다[22]. 구체적으로 miR-18a는 miRNA 생합성 손상으로 NPC 진행을 촉진합니다[6]. 본 연구는 M2 대식세포 유래 miR-18a와 TGFBR3의 NPC 내 복합적 상호작용을 해명하고자 하며, 결론적으로 M2 대식세포 유래 miR-18a가 TGFBR3 억제를 통해 NPC 진행을 자극함을 밝혔습니다(그림 10).

연구 시작 단계에서 IL-4 자극으로 대식세포를 M2 대식세포로 분화시켰는데, M2 대식세포에서 miR-18a 발현이 풍부해짐을 발견했습니다. 대식세포 분극 중 miRNA 발현이 변함이 알려져 있습니다[23]. 또한 M2 분극은 세포주기와 대사 과정 관련 유전자들을 풍부하게 하며, M2 표현형은 신생물 조직에서 종양 성장과 혈관 신생에 유리합니다[24]. M2 대식세포 풍부 miR-18a를 기반으로 일련의 실험을 성공적으로 수행했습니다.

초기에 본 연구는 NPC 세포에서 miR-18a 고발현, TGFBR3 저발현을 발견했습니다. 선행 연구에서 miR-18a가 NPC 조직에서 과발현되며 림프절 전이, 임상 병기와 연관됨 결론[5]. 또한 miR-17-92 클러스터 멤버인 miR-18a 포함 멤버들이 NPC 조직에서 과발현됨 기록[25]. 게다가 상향 조절된 miR-18a가 NPC 조직에서 나타나 종양 림프절 전이 병기와 종양 크기와 연관됨 보고[4]. 실험적으로 TGFBR3 저발현이 혀 편평세포암[26], 투명세포 신장세포암에서 나쁜 예후와 동반됨 보고[27]. 본 연구 결과도 이러한 선행 연구들과 어느 정도 일치합니다.

miR-18a와 TGFBR3의 NPC 세포 진행 역할 탐구 위해 일련 분석 수행 결과: miR-18a 상향 조절 또는 TGFBR3 하향 조절 시 NPC 세포 진행 촉진, miR-18a 억제 또는 TGFBR3 상향 조절 시 반대 효과. 광범위하게 miR-18a 억제가 난소암, 대장염 관련 대장암, 간세포암 등 악성 종양에서 세포 진행 저해함 입증[28,29,30]. 좁게는 기존 연구에서 상향 조절된 miR-18a가 DICER1 매개로 NPC 세포 진행 촉진함 천명[6]. 또한 NPC에서 과발현 miR-18a가 NPC 전이와 연관되고 miR-18a 억제가 NPC 환자 예후 개선에 부분 기여함 주목[31]. 최근 miR-18a 하향 조절이 NPC 증식, 침윤, 이동 억제 가능함 조사[4]. 또한 TGFBR3 발현 감소가 후두 편평세포암(LSCC) 침윤과 연관되고 miR-223/TGFBR3 축 조절이 LSCC 진행 억제에 참여함[32]. TGFBR3 상향 조절이 NPC 세포 생존율 제한, 세포자멸사 유도, 세포자멸사 신호 경로 활성화 기록[14]. 선행 연구에서 TGFBR3 상향 조절이 세포자멸사 촉진, G2/M기 정체 유도, 타액선 샘낭성 암종에서 세포 생존율과 이동 손상 결과[33]. 흥미롭게도 TGFBR3 유도가 간내 담관암 진행 교란에 기여함 기술[34].

저발현 miR-18a와 과발현 TGFBR3의 NPC 세포 내 보호 역할 in vitro 입증에도 불구하고, in vivo 추가 검증 위해 누드 마우스 종양 이식종 수행 결과: miR-18a 녹다운 또는 TGFBR3 상향 조절이 누드 마우스 종양 성장 억제. 선행 연구에서 miR-18a 주입 누드 마우스 종양 성장 촉진[5], 반대로 miR-18a 안타고미르 주입 누드 마우스 NPC에서 종양 성장 억제[4]. TGFBR3 감소 종양 성장 관점에서 저발현 TGFBR3가 투명세포 신장암 종양 형성 촉진 시사[27]. 반대로 TGFBR3 증가가 lncRNA ADAMTS9-AS2 상향, miR-223-3p 억제 동반 하 폐암 종양 성장 억제 인정[35]. 본 연구는 TGFBR3가 miR-18a 표적 유전자임 예측 및 검증했으나, 추가 검증 위해 더 많은 연구 필요.

결론

일반적으로 본 연구는 M2 대식세포 유래 miR-18a가 TGFBR3 발현 억제로 TGF-β 신호 경로를 통해 NPC 진행 악화시키는 구체적 메커니즘을 규명했으며, 이는 miR-18a 녹다운 또는 TGFBR3 상향 조절로 소멸됩니다. 본 연구는 NPC 치료 표적을 업데이트했습니다. 그러나 심층 탐구를 위한 대규모 코호트 연구가 여전히 필요합니다.