미세RNA-133a-3p(miR-133a-3p)가 두개내 동맥류(IA)에서 수행하는 기능적 역할은 불분명합니다. 따라서 본 연구의 목적은 인산세린 아미노트랜스퍼라제 1(PSAT1)/글리코겐 신타아제 키나제 3β(GSK3β)/β-카테닌 신호 전달 경로를 통해 혈관 내피 손상 유발 IA에서 miR-133a-3p의 조절 역할을 조사하는 것이었습니다. 뇌외상 환자와 IA 환자로부터 정상 두개내 세동맥 조직과 IA 조직을 수집했습니다. 조직 내 miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현을 RT-qPCR과 웨스턴 블롯 분석으로 측정했습니다. 인간 IA 유래 내피세포(EC)를 배양하고 miR-133a-3p 미믹과 si-PSAT1로 처리하여 내피세포 이동, 세포자살, 증식에서의 기능을 확인했습니다. EC 내 miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-카테닌, Ki-67, CyclinD1, Bax, Bcl-2 발현을 RT-qPCR 또는 웨스턴 블롯 분석으로 측정했습니다. 또한 IA 쥐 모델을 구축하여 IA 조직의 병리학적 변화와 miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-카테닌, VEGF, MMP-9 발현을 생체 내에서 검출했습니다. miR-133a-3p 발현은 IA의 개수 및 크기와 관련이 있었습니다. IA에서 miR-133a-3p 발현은 감소했고 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현은 증가했습니다. miR-133a-3p 회복과 PSAT1 고갈은 병리학적 변화를 완화시켰고, IA에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현을 감소시켰으며, IA EC의 세포자살을 억제하고 증식과 이동을 촉진했으며, 생체 내 IA 조직에서 VEGF와 MMP-9 발현을 감소시켰습니다. 본 연구는 miR-133a-3p 과발현 또는 PSAT1 다운레귤레이션이 GSK3β/β-카테닌 경로 억제를 통해 IA에서 내피세포 손상을 억제하고 내피세포 증식을 촉진함을 시사합니다. miR-133a-3p는 IA의 잠재적 후보 표지자와 치료 표적이 될 수 있습니다.
본 연구에서 우리는 miR-133a-3p/PSAT1 축이 GSK3β/β-카테닌 경로 조절을 통해 내피세포 손상 유발 IA에 영향을 미칠 수 있다고 추측했습니다.
이 가설을 검증하기 위해 임상 시료, 인간 IA 유래 내피세포(EC)를 수집하고 IA 쥐 모델을 구축하여 miR-133a-3p와 PSAT1의 IA 과정에서의 기능을 규명했습니다.
본 연구는 miR-133a-3p 과발현 또는 PSAT1 다운레귤레이션이 GSK3β/β-카테닌 경로 억제를 통해 IA에서 내피세포 손상을 억제하고 내피세포 증식을 촉진한다는 가설을 확인했습니다. 이러한 발견은 IA에 대한 새로운 표적 치료법에 대한 통찰을 제공합니다.
두개내 동맥류(IA)는 뇌에서 비정상적으로 돌출된 동맥과 IA 파열로 인한 지주막하 출혈(SAH)을 특징으로 하는 뇌혈관 질환으로, 높은 치사율과 이환율을 동반합니다[1]. 파괴적인 질병임에도 불구하고 IA의 발병 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았습니다[2]. IA는 드문 가족형이지만, 일반적으로 고혈압, 흡연 등 전통적 위험 인자에 의한 후천적 혈관 손상의 결과로 여겨집니다[3]. 파열 위험이 높은 환자의 미파열 동맥류의 미래 파열을 예방하기 위해 혈관 내 코일 색전술이나 미세수술적 클립 결찰술이 사용되어 왔습니다[4]. IA 수술에서 상당한 진전이 있었음에도 불구하고 IA 환자에서 수술 후 회복 불량이 여전히 나타납니다[5]. IA 치료의 어려운 상황은 기전을 추가로 탐구하고 새로운 치료 전략을 찾는 것을 필요하게 만듭니다.
마이크로RNA(miRNA)는 표적 유전자 발현을 전사 후 단계에서 번역 억제 또는 mRNA 분해 매개를 통해 조절하는 비암호화 RNA 계열입니다[6]. miR-133a-3p가 여러 악성 신생물에서 종양 억제자로 작용하며, miR-133a-3p 과발현이 대장암(CRC) 세포 성장을 억제할 수 있음이 밝혀졌습니다[7]. 이전 연구에서는 자가포식 매개 글루타민 분해를 차단함으로써 miR-133a-3p가 위암 전이와 성장을 추가로 억제함이 보고되었습니다[8]. 또한 miR-133a-3p가 심장 발달과 심장 비대 조절에 관여함이 제시되었습니다[9]. 한 연구에서는 miR-195-5p 상향조절이 PSAT1 의존적 GSK3β/β-카테닌 신호 경로 억제를 통해 난소암에서 혈관신생과 시스플라틴 내성을 감소시킴을 입증했습니다[10]. 또 다른 연구에서는 miR-365가 PSAT1 조절을 통해 식도 편평세포암(ESCC)에서 세포 침윤과 성장을 억제함이 보고되었습니다[11]. PSAT1은 세린 생합성에 관여하는 효소로, 원래 양 뇌에서 정제되었으며 많은 조직에서 높은 수준으로 발현됩니다[12]. PSAT1이 GSK3β/β-카테닌 신호 경로 조절을 통해 유방암에서 세포 주기 진행을 매개함이 문서화되었습니다[13]. Liu 등도 PSAT1이 ESCC 발병에 기능을 발휘하고 불량한 생존을 예고하므로 항암 치료의 유망한 표적이 될 수 있음을 지적했습니다[14]. 앞서 언급한 분석들을 고려할 때, 본 연구는 IA에서 miR-133a-3p/PSAT1/GSK3β/β-카테닌 축의 기능적 역할에 대한 새로운 접근에 기여할 것으로 기대되었습니다.
본 연구는 천진중의약대학 제1부속병원 기관윤리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 참가자는 서면 동의를 제공했습니다. 모든 동물 실험은 국제위원회의 실험동물 관리 및 사용 지침을 준수했습니다.
2016년 1월부터 2018년 3월까지 천진중의약대학 제1부속병원 신경외과에서 IA로 인한 SAH로 치료받은 환자들을 선정했습니다. 미세수술로 얻은 75례의 IA 병리 시료를 수집하여 IA군으로 분류했으며, 남성 29명, 여성 46명, 연령 31-55세, 평균 연령 44.98±6.79세였습니다. 동기간 동 병원 신경외과에서 치료받은 뇌외상 환자를 대조군으로 선정했습니다. 또한 외상 수술이나 감압 수술로 얻은 75례의 정상 두개내 세동맥 조직을 수집했으며, 남성 43명, 여성 32명, 연령 34-56세, 평균 연령 48.14±8.68세였습니다. 고혈압, 당뇨병, 종양 병력이 있는 환자는 제외했습니다. IA군과 대조군 사이에 성별과 연령에 유의한 차이는 없었습니다(모두 P>0.05).
수술적 절제 후 두 그룹의 일부 시료는 포르말린으로 고정하고, 저농도에서 고농도로 단계적 알코올 탈수 후 파라핀 포매했습니다. 이후 시료를 절편하여 헤마톡실린-에오신(HE) 염색과 면역조직화학 염색을 수행했습니다. 일부 시료는 액체질소 탱크에 빠르게 넣은 후 -80°C 초저온 냉동고로 옮겨 웨스턴 블롯 분석과 역전사 정량적 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR) 검출용으로 보관했습니다. 일부 시료는 글루타르알데히드로 고정하여 전자현미경 관찰용으로, 일부 시료는 EC 분리에 사용했습니다.
시료를 3% 글루타르알데히드로 고정하고, 1% 사산화오스뮴으로 재고정했습니다. 아세톤으로 탈수하고 Epon812로 포매한 후 두께 3μm의 반박편으로 절편했습니다. 마지막으로 초산 우라닐과 구연산 납으로 이중 염색하고 H-600IV 투과 전자현미경(히타치, 도쿄, 일본)으로 관찰했습니다.
준비된 파라핀 절편을 60°C에서 30분간 굽습니다. 위 단계 완료 후 조직 절편을 자일렌에 고정하고, 단계적 무수 알코올로 탈수하고, 인산완충식염수(PBS)로 세척했습니다. 조직 절편을 헤마톡실린으로 염색하고 암모니아수로 수초간 처리한 후 에오신으로 2분간 염색하고, 탈수, 투명화했습니다. 이후 중성 검메틀로 방울 떨어뜨리고 커버 글라스로 봉입했습니다. 마지막으로 현미경(니콘, 도쿄, 일본)으로 관찰하고 기록했습니다.
면역조직화학 키트는 Zymed Laboratories(샌프란시스코, 캘리포니아, 미국)에서 생산했습니다. 파라핀 절편을 탈납 및 수화하고, 자일렌 용액에 5분×3회 담갔습니다. 절편을 100% 무수 알코올에 3분×2회 넣고 95-75% 알코올에 순차적으로 3분간 담갔습니다. 탈납 후 절편을 3% 과산화수소에 15분간 담가 내인성 과산화효소 활성을 제거했습니다. 절편에 차단액을 떨어뜨리고 정상 염소 혈청 작업용 용액으로 15분간 배양한 후, 기질 금속단백질분해효소(MMP)-9(5μg/mL)와 혈관내피성장인자(VEGF)(1:250, Abcam, 케임브리지, 매사추세츠, 미국)에 대한 일차 항체로 탐침했습니다(PBS를 음성 대조군(NC)으로 사용). 1-2시간 배양했습니다. 절편을 생물소표지 이차 항체 작업용 용액으로 30-60분간 재탐침했습니다. 절편에 무즙 과산화효소 표지 스트렙타비딘/과산화효소 작업액을 첨가하고, 새로 제조한 다이아미노벤지딘(DAB) 용액을 떨어뜨리고, 대조 염색하고 차단했습니다. 이미지는 니콘 SPOT FlexTM 이미징 시스템으로 획득했습니다. MMP-9와 VEGF 단백질 발현 면적은 면역조직화학 정량 분석 소프트웨어로 측정했습니다. 각 시료에서 양성 세포 축적 영역의 고배율 시야 5개를 무작위로 검출하고, 각 화면의 평균 흡광도를 평균값으로 통계 분석에 사용했습니다.
정상 두개내 세동맥 조직과 IA 조직에서 EC를 분리하여 배양했습니다. 조직을 3mm² 크기로 절편하고 0.1% 콜라게나제 B/0.1% 디스파제(로슈, 바젤, 스위스)에서 25분간 배양했습니다. 조직을 분리하고 2mL 피펫으로 2분간 분쇄한 후 100-μm 스트레이너(BD Biosciences, NJ, 미국)로 여과하여 EC를 분리했습니다. 세포 현탁액을 원심분리한 후 성장인자와 20% 태아소혈청(FBS, PromoCell, 하이델베르크, 독일)을 함유한 배양 배지 MV2에 재현탁했습니다. 다음으로 세포를 피브로넥틴(시그마 알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국) 코팅된 접시(10⁴ cells/cm², 1μg/cm²)에 파종하고 5% CO₂ 조건에서 1일간 배양했습니다. 파종 다음 날, PBS로 세척하여 부착하지 않은 세포를 제거하고 신선한 배지로 교체했습니다. 80-100% 융합도에 도달하면, Ulex europaeus Agglutinin I(UEA) 코팅된(벡터 래버러토리스, 피터버러, 영국) 비드(다이나비즈 M-450 토실활성화, 옥소이드, 햄프셔, 영국)를 이용한 면역분리로 순수 EC를 얻었습니다. 렉틴 코팅 비드에 결합한 EC를 자기 입자 농축기로 모으고, 비결합 세포를 기초 배지로 2회 세척하여 제거했습니다. UEA 양성 세포를 배양 배지에 재현탁하고 피브로넥틴 코팅된 접시에 파종하여 부착과 성장을 개선했습니다. 배양은 4-6일 내에 융합도에 도달했습니다.
세포 표면 CD31 항체와 FVII 인자 관련 항원으로 면역세포화학 염색하여 EC를 확인했습니다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 3% H₂O₂로 10-15분간 배양하여 내인성 과산화효소 활성을 제거한 후 0.1% Triton X-100으로 10분간 배양하여 세포를 천공했습니다. 세포에 특이적 일차 항체: Factor VII(1:200), CD31(1:400, 로슈, 바젤, 스위스)을 떨어뜨리고 4°C에서 하룻밤 배양했습니다. 그런 다음 과산화효소 표지 면역글로불린 G(1:50) 이차 항체를 떨어뜨렸습니다. 세포를 37°C에서 45분간 배양하고 DAB로 암실에서 4분간 현상했습니다. 그런 다음 증류수로 현상을 정지하고 현미경으로 사진을 관찰했습니다. 형광 위상차 현미경으로 세포를 관찰하고, 10개 시야에서 무작위로 양성 세포 수와 총 세포 수를 계수했습니다. 양성 염색 세포율 = (양성 세포 수/총 세포 수) × 100%. 해당 NC 그룹을 설정하고 일차 항체를 PBS로 대체하여 위 단계와 동일하게 수행했습니다.
IA의 EC에서 miR-133a-3p와 PSAT1 간의 효과를 연구하기 위해 EC를 대조군(형질도입 없는 정상 혈관 EC), IA군(형질도입 없는 IA 혈관 EC), 미믹 NC군(miR-133a-3p 미믹 NC 형질도입), miR-133a-3p 미믹군(miR-133a-3p 미믹 형질도입), si-NC군(si-PSAT1 NC 형질도입), si-PSAT1군(si-PSAT1 형질도입), miR-133a-3p 미믹 + oe-PSAT1군(miR-133a-3p 미믹과 oe-PSAT1 형질도입)으로 분류했습니다. 이 중 미믹 NC, miR-133a-3p 미믹, si-PSAT1, si-NC, oe-PSAT1은 GenePharma Co., Ltd.(상하이, 중국)에서 설계 및 합성했습니다. 형질도입은 Lipofectamine™ 2000 형질도입 시약(써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠, 미국)의 지침에 따라 엄격하게 수행했습니다.
배양 접시의 배지를 버리고 PBS로 2회 세척했습니다. 세포를 0.25% 트립신으로 분리하고 800rpm으로 5분간 원심분리한 후 1× 결합 완충액에 현탁하고 세포 밀도를 1×10⁷ cells/mL로 조절했습니다. 세포 현탁액(100μL)을 5μL 요오드화 프로피디움(PI, 20μg/mL)과 annexin V-FITC로 20분간 배양한 후 400μL 1× 결합 완충액과 혼합했습니다. 유세포분석기(BD FACSArial I cell sorter)를 사용하여 1시간 이내에 세포 세포자살을 검출했습니다. 결과는 산점도에서 좌하 사분면(Q4)이 건강한 생존 세포(FITC⁻/PI⁻), 우하 사분면(Q3)이 초기 세포자살 세포(FITC⁺/PI⁻), 우상 사분면(Q2)이 후기 세포자살 및 사멸 세포(FITC⁺/PI⁺)를 나타내며, 세포자살률 = 초기 세포자살 비율(Q3) + 후기 세포자살 비율(Q2)입니다.
세포를 트립신으로 분리하여 세포 현탁액을 제조했습니다. 도립 현미경으로 세포를 계수했습니다. 세포 농도를 5×10⁴ cells/mL로 조절했습니다. 세포를 96웰 배양판에 파종했습니다. 48시간 후 20μL MTT 용액으로 4시간 배양했습니다. 각 웰의 MTT를 150μL 디메틸 술폭시드로 용해했습니다. EC의 광학 밀도(OD) 값을 570nm 파장에서 측정했습니다. OD 값을 기반으로 EC의 증식률을 계산했습니다.
각 그룹의 세포를 2×10⁵ cells/well 밀도로 24웰 플레이트에 파종했습니다. 각 그룹당 3개의 평행 웰을 설정했습니다. 약 90% 융합도에 도달하면 멸균된 1mL 마이크로피펫 팁으로 세포 성장면을 긁었습니다. 각 웰을 한 번 긁고 긁힌 길이와 깊이를 일정하게 유지했습니다. 긁은 후 부유 세포를 제거하고 배양액을 신선한 것으로 교체한 후 24시간 배양 후 현미경으로 긁힌 간격을 관찰했습니다. 스크래치 상처 치유 면적을 National Instrument Vision Assistant 8.6 소프트웨어로 계수했습니다. 세포 이동률 = 상처 치유 면적/초기 스크래치 상처 면적 × 100%.
7주령, 체중 180-200g의 Sprague-Dawley(SD) 쥐 84마리(북경 군사의학연구원 실험동물센터)를 선정했습니다. 쥐를 동물실험센터에 사육했습니다. 사육 조건은 22-25°C, 50-60% 습도, 자연광으로 제어했습니다. 모든 쥐를 표준 쥐 케이지에 4마리씩 사육했습니다. 도시 위생 식수와 일반 쥐 사료를 제공했습니다. 깔개를 3일마다 교체하고 케이지를 세척 및 살균했습니다. IA 쥐 모델은 문헌[15]에 따라 구축했습니다. 쥐에서 다음 증상이 나타나면 파열된 동맥류로 판정했습니다[16]: 1, 24시간 동안 체중 감소(약 10%)로 인한 섭식 또는 음수 활동 감소; 2, 들어 올릴 때 몸통과 앞다리 굴곡; 3, 정상 자세로 한쪽으로 걷기; 4, 휴식 시 한쪽으로 기울어짐, 자발적 활동 없음. 이러한 증상을 보인 쥐는 수술 후 3개월 후에 안락사시켰습니다. 수술 중 IA 조직을 얻고 PBS로 관류한 후 글루탐산을 함유한 청색 염료를 뇌동맥으로 관류했습니다.
위 84마리 쥐를 7개 그룹으로 무작위 배정하여 각 그룹당 12마리씩 배정했습니다. 처리 방법은 다음과 같습니다: 정상군(모델링 수행 안 함); IA군(PBS와 Lipofectamine 2000 혼합물 100μL 입체정위 주입); 미믹 NC군(miR-133a-3p 미믹 NC와 Lipofectamine 2000 혼합물 100μL 입체정위 주입); miR-133a-3p 미믹군(miR-133a-3p 미믹과 Lipofectamine 2000 혼합물 100μL 입체정위 주입); si-NC군(si-PSAT1 NC와 Lipofectamine 2000 혼합물 100μL 입체정위 주입); si-PSAT1군(si-PSAT1과 Lipofectamine 2000 혼합물 100μL 입체정위 주입); miR-133a-3p 미믹 + oe-PSAT1군(miR-133a-3p 미믹과 oe-PSAT1과 Lipofectamine 2000 혼합물 100μL 입체정위 주입). 위 모든 주입은 하루 1회 수행했으며, 이 쥐들을 특정 병원체 자유(SPF) 동물 실험실에서 12주간 사육했습니다. 12주 후 각 그룹의 쥐를 마취하고 위와 같이 흉강을 열었습니다. 좌심실에서 대동맥으로 관류하여 하대정맥을 절단해 혈액을 배출시켰습니다. 동시에 30mL 헤파린 나트륨 함유 생리식염수(37°C)를 관류관으로 관류한 후, 10% 폴리포름알데히드/0.1M 인산완충액(pH 7.4)을 관류관을 통해 천천히 뇌로 주입했습니다. 관류 고정 후 뇌를 개두했습니다. 두개골 바닥의 동맥환을 수술현미경 하에서 분리 적출하고, 현미경으로 동맥류 변화를 관찰하고 병리적 특성을 조사했습니다. 미믹 NC, miR-133a-3p 미믹, si-NC, si-PSAT1, oe-PSAT1은 상하이 상곤 바이오테크놀로지(상하이, 중국)에서 합성했습니다.
수술 전 3일과 중재 치료 후 12주에 쥐의 좌총경동맥 말단 혈류 속도를 측정했습니다. 방법은 다음과 같습니다: 쥐를 마취기 동물 프레임에 넣고 흡입 마취했으며 유량 파라미터를 조절했습니다. 쥐가 안정적으로 호흡하고 쥐 꼬리를 만졌을 때 뚜렷한 반응이 없으면 고무 밴드로 실험 조작대에 고정했습니다. 전기 면도기로 쥐 목의 털을 깎았습니다. 컬러 도플러 초음파 검출기를 켜고 프로브에 적당량의 커플링제를 바른 후 좌총경동맥 말단 혈류 속도를 측정하고 데이터를 기록했습니다. 측정 후 쥐를 조심스럽게 케이지에 돌려보내 기도를 개방한 채 마취에서 깨어날 때까지 기다렸습니다.
총 RNA를 RNA simple 총 RNA 추출 키트(티앙겐 바이오테크, 베이징, 중국) 기준으로 추출했습니다. 자외선 분석과 포르말린 변성 전기영동으로 고품질 RNA를 확인하고, PrimeScript RT 시약 키트로 상보적 DNA로 역전사했습니다. PCR 반응은 SYBR Premix Ex TaqII(타카라, 다롄, 랴오닝, 중국)로 수행했습니다. PCR 프라이머는 베이징 콤윈 바이오텍(베이징, 중국)에서 설계 및 합성했습니다(표 1). U6를 miR-133a-3p의 내부 기준으로, PSAT1, GSK3β, β-카테닌, Bax, Bcl-2, Ki-67, CyclinD1에는 글리세랄데히드 인산 탈수소효소(GAPDH)를 내부 기준으로 사용했습니다. 데이터는 2⁻ΔΔCt 법으로 측정했습니다.
세포와 조직에서 총 단백질을 추출하고, BCA 단백질 분석 키트(베이타임 바이오테크, 상하이, 중국)로 단백질 시료를 정량했습니다. 시료를 5× 시료 버퍼 1/4 부피와 혼합하고 5분간 끓였습니다. 10% 분리 겔과 5% 농축 겔을 전기영동에 사용했습니다. 막을 5% 탈지분유로 60분간 차단했습니다. 막에 일차 항체 PSAT1(1:500), GSK3β(1:500), β-카테닌(1:5000), Bax(1:1000), Bcl-2(1:1000), CyclinD1(1:200), Ki-67(1:5000), MMP-9(1μg/mL), VEGF(1:1000)(모두 Abcam, 케임브리지, 매사추세츠, 미국)을 첨가했습니다. 그런 다음 이차 항체(1:2000)로 60분간 배양했습니다. 막을 전기화학발광 반응 용액(베이타임 바이오테크, 상하이, 중국)에 1분간 담근 후 액체를 제거하고 랩으로 덮었습니다. 막을 X선으로 노출하고 현상 및 정착 후 결과를 관찰했습니다. GAPDH(1:10000, Abcam)를 로딩 컨트롤로 사용하고, 단백질 이미지를 ImageJ2x 소프트웨어로 분석했습니다.
바이오인포매틱스 웹사이트(https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/)를 이용하여 miR-133a-3p와 PSAT1의 표적 관계와 miR-133a-3p와 PSAT1 3' 비번역 영역(3'UTR) 결합 부위를 예측했습니다. miR-133a-3p 결합 부위를 포함하는 PSAT1 3'UTR 프로모터 영역 서열을 증폭하여 pGL3-basic 루시퍼레이저 플라스미드(타카라 바이오, 오츠, 시가, 일본)에 클로닝하여 PSAT1 3'UTR의 야생형(WT) 플라스미드(PSAT1-WT)를 구축했고, 포인트 돌연변이 키트(타카라 바이오, 오츠, 시가, 일본)로 PSAT1-WT의 miR-133a-3p 결합 부위를 돌연변이시켜 돌연변이(MUT) PSAT1-MUT 재조합 플라스미드를 제조했습니다. 대수 증식기 혈관 EC를 96웰 플레이트에 파종했습니다. 융합도가 약 70%에 도달하면 PSAT1-WT와 PSAT1-MUT 플라스미드를 미믹 NC와 miR-133a-3p 미믹 플라스미드와 Lipofectamine 2000으로 혼합하여 혈관 EC에 공동 형질도입했습니다. 형질도입 48시간 후 세포를 수집 및 용해하고, 루시퍼레이저 검출 키트(프로메가, 매디슨, 위스콘신, 미국)로 루시퍼레이저 활성을 검증했습니다.
모든 데이터는 SPSS 21.0 소프트웨어(IBM Corp., 아몬크, 뉴욕, 미국)로 분석했습니다. 계수 데이터는 비율이나 백분율로 표시하고 카이제곱 검정이나 피셔 정확 검정으로 분석했습니다. 정규분포를 따르는 측정 데이터는 평균±표준편차로 표시했습니다. 두 그룹 간 비교는 t-검정으로, 다중 그룹 간 비교는 일원분산분석(ANOVA) 후 Tukey 사후 검정으로 수행했습니다. P값 <0.05를 유의한 것으로 간주했습니다.
표 2에 IA군과 대조군의 일반 자료 비교를 나타냈습니다. 구체적 정보는 표 2에 나열되어 있습니다.
miR-133a-3p 발현과 IA의 병리학적 특징 간의 관계를 분석한 결과, 표 3에 자세히 나와 있듯이 IA에서 miR-133a-3p의 평균 상대 발현을 기준으로 75례 IA를 miR-133a-3p 고발현군(n=47)과 저발현군(n=28)으로 나누었습니다. 카이제곱 검정 또는 피셔 정확 검정으로 miR-133a-3p와 다양한 병리학적 매개변수 간의 관계를 통계적으로 분석했습니다. 결과는 miR-133a-3p 발현이 연령, 성별, 동맥류 모양과 위치와는 관련이 없으나(모두 P>0.05), 동맥류 개수 및 크기와는 관련이 있음(모두 P<0.05)을 보였습니다.
RT-qPCR로 IA에서 miR-133a-3p 발현을 측정한 결과, 정상 두개내 세동맥 조직(대조군)에 비해 IA 조직(IA군)에서 miR-133a-3p 발현이 감소했습니다(P<0.05)(그림 1a). RT-qPCR과 웨스턴 블롯 분석 결과, PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현이 정상 두개내 세동맥 조직에 비해 IA 조직에서 증가했습니다(모두 P<0.05)(그림 1a-c).
IA 조직에서 miR-133a-3p 발현 감소, PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현 증가. a IA군과 정상군에서 miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현. b PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현 단백질 밴드. c 웨스턴 블롯 분석으로 측정한 IA군과 정상군에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 단백질 발현. n=75, *P<0.05 vs. 대조군. 측정 데이터는 평균±표준편차로 표시, 두 그룹 간 비교는 독립 표본 t-검정으로 수행
정상 두개내 세동맥 조직과 IA 조직을 직접 관찰한 결과, 대조군에서는 동맥 조직의 혈관이 선홍색을 띠고 관강 내에 뚜렷한 죽상경화반과 측부 혈전이 없었습니다. IA군의 동맥류 종양은 대부분 갈색 또는 암적색이었고, 외형은 주머니 모양이나 방추형이었으며, 질감은 대부분 단단했습니다. 종양을 절개했을 때 일부 종양 샘플의 종양 벽에서 백색 또는 암적색의 죽상경화반이 관찰되었으며, 이는 편평형, 원형, 타원형이었습니다. 일부 종양 샘플에서는 종양 공동 내에 벽혈전이 있었고, 혈전 질감은 부드러웠습니다. 종양 벽 두께는 종양 목에서부터 점차 얇아져 일부는 종양 꼭대기에만 얇은 섬유막만 있었고, 일부는 심지어 파열되었습니다. 파열된 동맥류의 균열은 종양 꼭대기 또는 그 근처에 위치했습니다.
HE 염색 결과, 광학현미경 하에서 대조군의 정상 두개내 세동맥 조직 벽 두께는 균일했고, 내막, 중막, 외막의 해부학적 구조가 명확하고 완전했으며, 각 층 세포 형태가 정상이었고, 인접 세포의 근막이 밀접하게 형성되었으며, 벽의 염증세포는 드물었습니다. IA군에서는 두개내 동맥 분기 꼭대기 원위부 측부 혈관강에 국소 돌출이 형성되어 동맥류 벽이 둔해지고 작아졌으며, 국소 EC가 소실되었습니다. 소수 샘플에서 평활근세포층에서 내막층으로의 이동과 근원성 내막세포 증식이 나타났습니다. EC가 감소하거나 소실되었습니다. 내피세포층은 증식성 근내막세포와 선형으로 배열된 EC로 구성되거나, 관강에 부착된 세포자살성 EC와 혈액세포로 구성되었습니다. 소포 변성이 나타나고 연속성이 중단되었습니다. 일부는 기저막과 함께 박리되었고, 내막 콜라겐 섬유가 증가했습니다. 죽상경화 변화가 있었고, 세동맥 벽이 현저히 얇아지고 대량의 결합 조직으로 채워졌습니다. 모든 층에서 염증세포 침윤과 부분적 확산이 관찰되었으며, 주로 중막과 외막에 있었습니다. 일부 세포에서 지질과 콜레스테롤 결정 침착이 관찰되었습니다. 일부 종양 벽은 완전히 또는 국소적으로 얇아지고 외부로 팽창했습니다(그림 2a, b).
동맥류 병리학적 변화와 IA에서 MMP-9, VEGF 발현. a 대조군 정상 두개내 세동맥 조직 절편 HE 염색(×10). b IA 조직 절편 HE 염색(×10). c 대조군 정상 두개내 세동맥 조직 초미세구조 전자현미경(×10,000). d IA 조직 초미세구조 전자현미경(×10,000). e 대조군과 IA군에서 MMP-9 면역조직화학 염색 발현(×200). f 대조군과 IA군에서 VEGF 면역조직화학 염색 발현(×200)
정상 두개내 세동맥 조직과 IA 조직 절편을 전자현미경으로 관찰한 결과, 정상 조직에서는 뇌혈관 벽의 기질 섬유가 명확히 보였고, 내피 손상, 세포 농축, 변성이 없었습니다. IA 조직에서는 명백한 내피세포 손상, 세포 농축, 소포 변성이 관찰되었고, 중막 평활근세포 수가 감소했으며, 대부분 핵 농축이 나타났고, 크로마틴 응집과 세포자살 소체가 보였습니다. 일부 세포는 미토콘드리아 부종과 정상 내부 구조 소실을 보였습니다. 세포골격을 형성하는 세포외 기질이 흐려지고 무정형 편모를 보였습니다. 세포 소실 부위에 많은 파편이 있었습니다(그림 2c, d).
면역조직화학 염색으로 MMP-9와 VEGF 발현을 검사한 결과, 대조군 75례에서 MMP-9와 VEGF 발현이 없었습니다. IA 샘플 75례 중 60례에서 MMP-9 양성 발현이 있었습니다. MMP-9 양성 발현은 IA 벽의 내막과 외막에 나타났으나 균일하지 않았습니다. 양성 발현은 주로 갈색 황색 세포질로 특징지어졌습니다. VEGF 양성 발현은 IA 샘플 75례 중 66례에서 나타났습니다. IA 벽에서 중막과 외막에 높은 양성 발현이 있었고 내막에 낮은 양성 발현이 있었습니다. 양성 발현도 주로 갈색 황색 세포질로 특징지어졌습니다(그림 2e, f). 두 그룹의 MMP-9와 VEGF 발현은 표 4에 나와 있습니다.
면역조직화학 염색으로 EC에서 인자 VIII와 CD31 발현을 분석했습니다. 결과는 혈관 EC가 인자 VIII와 CD31 관련 항원 항체에 양성 반응을 보였고, 양성률은 95%였습니다. 또한 세포질에 다수의 갈색 입자가 있었고, 5대 계대 세포의 갈색 염색이 1대 계대 세포보다 현저히 높았습니다(그림 3a, b).
혈관 EC가 FVIII와 CD31 관련 항원 항체에 양성 반응. a CD31로 EC 확인. b FVII로 EC 확인
유세포 분석, RT-qPCR, 웨스턴 블롯 분석으로 miR-133a-3p 미믹 또는 si-PSAT1 처리 후 IA EC의 세포자살과 Bax, Bcl-2 발현을 관찰했습니다. 대조군에 비해 IA군에서 세포 세포자살률과 Bax 발현이 증가했고 Bcl-2 발현은 감소했습니다(모두 P<0.05). IA군, 미믹 NC군, si-NC군에서 세포자살률과 Bax, Bcl-2 발현에 유의한 변화는 없었습니다(모두 P>0.05). si-NC군과 미믹 NC군에 비해 si-PSAT1군과 miR-133a-3p 미믹군에서 세포자살률이 억제되었고, Bax 발현은 감소했으며, Bcl-2 발현은 증가했습니다(모두 P<0.05). miR-133a-3p 미믹군에 비해 miR-133a-3p 미믹 + oe-PSAT1군에서 세포자살률과 Bax 발현이 증가했고, Bcl-2 발현은 감소했습니다(모두 P<0.05)(그림 4a-e).
고발현 miR-133a-3p와 저발현 PSAT1이 IA EC의 세포자살 억제, 증식 및 이동 촉진. a 유세포 분석으로 EC 세포자살 검출. b 각 그룹 EC 세포자살률 검출. c RT-qPCR로 검출된 EC에서 Bax, Bcl-2 발현. d Bax, Bcl-2 발현 단백질 밴드. e 웨스턴 블롯 분석으로 검출된 EC에서 Bax, Bcl-2 단백질 발현. f MTT 분석으로 각 그룹 EC 증식 활성 검출. g RT-qPCR로 각 그룹 EC에서 Ki-67, CyclinD1 발현 검출. h Ki-67, CyclinD1 발현 단백질 밴드. i 웨스턴 블롯 분석으로 검출된 EC에서 Ki-67, CyclinD1 단백질 발현. j 스크래치 테스트로 각 그룹 EC 이동 검출. k 각 그룹 내피세포 이동 통계 결과. N=3, *P<0.05 vs. 대조군. #P<0.05 vs. 미믹 NC군. &P<0.05 vs. si-NC군. +P<0.05 vs. miR-133a-3p 미믹군. 측정 데이터는 평균±표준편차로 표시; 데이터는 일원분산분석 후 Tukey 사후 검정으로 평가
MTT 분석, RT-qPCR, 웨스턴 블롯 분석으로 miR-133a-3p 미믹 또는 si-PSAT1 처리 후 IA EC의 증식과 Ki-67, CyclinD1 발현을 관찰했습니다. 대조군에 비해 IA군에서 증식 활성과 Ki-67, CyclinD1 발현이 감소했습니다(모두 P<0.05). IA군, 미믹 NC군, si-NC군에서 증식 활성과 Ki-67, CyclinD1 발현에 유의한 차이는 없었습니다(모두 P>0.05). si-NC군과 미믹 NC군에 비해 si-PSAT1군과 miR-133a-3p 미믹군에서 증식 활성과 Ki-67, CyclinD1 발현이 증가했습니다(모두 P<0.05). miR-133a-3p 미믹군에 비해 miR-133a-3p 미믹 + oe-PSAT1군에서 증식 활성과 Ki-67, CyclinD1 발현이 감소했습니다(모두 P<0.05)(그림 4f, i).
miR-133a-3p 미믹 또는 si-PSAT1 처리 24시간 후 각 그룹 EC의 이동을 스크래치 테스트로 관찰했습니다. IA군에서 세포 이동이 대조군에 비해 억제되었습니다(P<0.05). IA군, si-NC군, 미믹 NC군에서 세포 이동에 현저한 변화는 없었습니다(모두 P>0.05). si-NC군과 미믹 NC군에 비해 si-PSAT1군과 miR-133a-3p 미믹군에서 세포 이동이 증가했습니다(모두 P<0.05). miR-133a-3p 미믹군에 비해 miR-133a-3p 미믹 + oe-PSAT1군에서 세포 이동이 감소했습니다(P<0.05)(그림 4j, k).
RT-qPCR로 IA EC에서 miR-133a-3p 발현을 검출한 결과, 대조군에 비해 IA군에서 miR-133a-3p 발현이 감소했습니다(P<0.05). IA군, 미믹 NC군, si-NC군에서 miR-133a-3p 발현에 현저한 변화는 없었습니다(P>0.05). miR-133a-3p 미믹군에서 미믹 NC군에 비해 miR-133a-3p 발현이 증가했습니다(P<0.05). si-NC군에 비해 si-PSAT1군에서 miR-133a-3p 발현에 뚜렷한 변화는 없었습니다(P>0.05). miR-133a-3p 미믹군에 비해 miR-133a-3p 미믹 + oe-PSAT1군에서 miR-133a-3p 발현에 유의한 차이는 없었습니다(P>0.05)(그림 5a).
miR-133a-3p 상향조절과 PSAT1 하향조절이 IA EC에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현 감소. a RT-qPCR로 검출된 EC에서 miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현. b PSAT1, GSK3β, β-카테닌 단백질 밴드. c 웨스턴 블롯 분석으로 검출된 각 그룹 EC에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 단백질 발현. N=3, *P<0.05 vs. 대조군. #P<0.05 vs. 미믹 NC군. &P<0.05 vs. si-NC군. +P<0.05 vs. miR-133a-3p 미믹군. 측정 데이터는 평균±표준편차로 표시, 데이터는 일원분산분석 후 Tukey 사후 검정으로 평가
웨스턴 블롯 분석과 RT-qPCR로 IA EC에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현을 검사했습니다. 대조군에 비해 IA군에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현이 증가했습니다(모두 P<0.05). IA군, 미믹 NC군, si-NC군에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현에 극적인 변화는 없었습니다(모두 P>0.05). miR-133a-3p 미믹군과 si-PSAT1군에서 미믹 NC군과 si-NC군에 비해 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현이 감소했습니다(모두 P<0.05). miR-133a-3p 미믹군에 비해 miR-133a-3p 미믹 + oe-PSAT1군에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현이 증가했습니다(모두 P<0.05)(그림 5a-c).
모델링 후 쥐의 혈역학적 변화를 검사하여 수술 전 3일과 중재 치료 후 12주에 각 그룹 쥐의 혈류 속도를 모니터링했습니다. 수술 전 3일 각 그룹 혈류 속도에 뚜렷한 차이는 없었습니다(P>0.05). 12주 중재 후 IA군 쥐의 혈류 속도가 정상군에 비해 감소했습니다(P<0.05). IA군, 미믹 NC군, si-NC군, miR-133a-3p 미믹 + oe-PSAT1군에서 혈류 속도 감소 정도에 뚜렷한 차이는 없었습니다(모두 P>0.05). si-NC군과 미믹 NC군에 비해 miR-133a-3p 미믹군과 si-PSAT1군에서 혈류 속도가 증가했습니다(모두 P<0.05). miR-133a-3p 미믹군에 비해 miR-133a-3p 미믹 + oe-PSAT1군에서 혈류 속도가 감소했습니다(P<0.05)(그림 6a).
상향조절된 miR-133a-3p와 하향조절된 PSAT1이 IA 조직 병리학적 변화 완화. a 모델링 성공 후 시점별 쥐 혈역학적 변화. b 형질도입 후 IA 조직 변화. n=12, *P<0.05 vs. 정상군. #P<0.05 vs. 미믹 NC군. &P<0.05 vs. si-NC군. +P<0.05 vs. miR-133a-3p 미믹군. 측정 데이터는 평균±표준편차로 표시, 데이터는 일원분산분석 후 Tukey 사후 검정으로 평가.
HE 염색으로 IA 조직 변화를 검증했습니다. 결과는 정상군에서 두개내 혈관 조직 중막의 탄력섬유가 정돈되어 있고, 정상 탄력단백 파동 구조가 나타나며, 파열과 분해가 없었습니다. 정상군에 비해 IA군에서 두개내 혈관 조직 관강이 확대되었고, 정상 탄력단백 파동 구조가 소실되었으며, 국소 탄력단백 혈관 중막 탄력섬유가 파열되었고, 일부 탄력섬유가 완전히 분해되었습니다. si-NC군, 미믹 NC군, IA군, miR-133a-3p 미믹 + oe-PSAT1군에서 IA 조직 형태에 뚜렷한 변화는 없었습니다. si-NC군과 미믹 NC군에 비해 miR-133a-3p 미믹군과 si-PSAT1군 쥐의 두개내 혈관 조직 탄력단백 파동 구조가 존재했고, 국소 탄력단백 혈관 구조가 약간 무질서했으나 파열과 용해는 없었습니다(그림 6b).
RT-qPCR로 생체 내 IA 조직에서 miR-133a-3p 발현을 검사한 결과, 정상군에 비해 IA군에서 miR-133a-3p 발현이 감소했습니다(P<0.05). IA군, 미믹 NC군, si-NC군에서 miR-133a-3p 발현에 명백한 변화는 없었습니다(모두 P>0.05). miR-133a-3p 미믹군에서 미믹 NC군에 비해 miR-133a-3p 발현이 증가했습니다(P<0.05). si-NC군에 비해 si-PSAT1군에서 miR-133a-3p 발현에 뚜렷한 변화는 없었습니다(P>0.05). miR-133a-3p 미믹군에 비해 miR-133a-3p 미믹 + oe-PSAT1군에서 miR-133a-3p 발현에 유의한 차이는 없었습니다(P>0.05)(그림 7a).
miR-133a-3p 과발현과 PSAT1 저발현이 생체 내 IA 조직에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌, VEGF, MMP-9 발현 감소 및 PSAT1이 miR-133a-3p 표적 유전자임. a RT-qPCR로 각 그룹 쥐 IA 조직에서 miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현 검출. b PSAT1, GSK3β, β-카테닌 단백질 밴드. c 웨스턴 블롯 분석으로 각 그룹 쥐 IA 조직에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 단백질 발현 검출. d VEGF, MMP-9 단백질 밴드. e 웨스턴 블롯 분석으로 각 그룹 쥐 IA 조직에서 VEGF, MMP-9 단백질 발현 검출. f Target Scan으로 PSAT1이 해당 miR-133a-3p에 결합하는 표적 부위 예측. g 이중 루시퍼레이저 리포터 유전자 분석 결과. a-e, n=12; f-g, N=3, *P<0.05 vs. 정상군/Wt+NC군. #P<0.05 vs. 미믹 NC군. &P<0.05 vs. si-NC군. +P<0.05 vs. miR-133a-3p 미믹군. 측정 데이터는 평균±표준편차로 표시, 데이터는 일원분산분석 후 Tukey 사후 검정으로 평가
웨스턴 블롯 분석과 RT-qPCR로 생체 내 IA 조직에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현을 검사했습니다. 정상군에 비해 IA군에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현이 증가했습니다(모두 P<0.05). IA군, 미믹 NC군, si-NC군에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현에 현저한 변화는 없었습니다(모두 P>0.05). miR-133a-3p 미믹군과 si-PSAT1군에서 미믹 NC군과 si-NC군에 비해 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현이 감소했습니다(모두 P<0.05). miR-133a-3p 미믹군에 비해 miR-133a-3p 미믹 + oe-PSAT1군에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌 발현이 증가했습니다(모두 P<0.05)(그림 7a-c).
웨스턴 블롯 분석으로 생체 내 IA 조직에서 VEGF와 MMP-9 발현을 검증했습니다. 정상군에 비해 IA군에서 VEGF와 MMP-9 발현이 증가했습니다(모두 P<0.05). IA군, 미믹 NC군, si-NC군에서 VEGF, MMP-9 발현에 명백한 변화는 없었습니다(모두 P>0.05). 미믹 NC군과 si-NC군에 비해 miR-133a-3p 미믹군과 si-PSAT1군에서 VEGF, MMP-9 발현이 감소했습니다(모두 P<0.05). miR-133a-3p 미믹군에 비해 miR-133a-3p 미믹 + oe-PSAT1군에서 VEGF, MMP-9 발현이 증가했습니다(모두 P<0.05)(그림 7d, e).
온라인 예측 소프트웨어(https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/)를 이용하여 PSAT1이 miR-133a-3p에 결합하는 표적 부위와 PSAT1과 miR-133a-3p가 결합하는 3'UTR 영역 서열을 예측 분석했습니다. miR-133a-3p의 예측된 결합 부위가 루시퍼레이저 활성 변화를 유도함을 입증하기 위해 miR-133a-3p 결합 부위를 결실한 PSAT1 3'UTR의 돌연변이 서열과 야생형 서열을 설계했습니다. 혈관 EC에서 miR-133a-3p 미믹과 WT(Wt-miR-133a-3p/PSAT1) 또는 MUT(Mut-miR-133a-3p/PSAT1) 재조합 플라스미드를 공동 형질도입하여 루시퍼레이저 활성을 검증했습니다. 결과는 miR-133a-3p 미믹이 Mut-miR-133a-3p/PSAT1군에서 루시퍼레이저 활성에 뚜렷한 영향을 미치지 않았으나(P>0.05), Wt-miR-133a-3p/PSAT1군에서 루시퍼레이저 활성이 현저히 감소했습니다(P<0.05)(그림 7f, g).
IA는 두개내 동맥의 비정상적 확장으로, 혈관 벽을 지속적으로 바깥쪽으로 밀어내어 동맥 벽을 약화시키고 동맥류 파열 위험을 높입니다[17]. Liu 등의 연구에서 일부 miRNA가 혈관 평활근세포 증식 조절에 관여하며 이는 IA와 밀접한 관련이 있음이 밝혀졌습니다[18]. 또한 최근 연구에서는 순환 miRNA가 고위험군 개인의 IA 발생 가능성 평가에 새로운 바이오마커로 사용될 수 있음을 입증했습니다[19]. 일반적으로 PSAT1이 조현병 스펙트럼 장애에 관여하고 세린 대사를 변화시킬 수 있다고 여겨집니다[20]. 본 연구는 miR-133a-3p가 조절하는 혈관 내피 손상 유발 IA에서 PSAT1/GSK3β/β-카테닌 신호 경로 조절을 통한 조절 역할을 탐구하기 위해 설계되었습니다.
본 연구에서 miR-133a-3p 발현과 IA 병리학적 특징 간의 관계를 분석한 결과, miR-133a-3p 발현이 연령, 성별, 동맥류 모양, 위치와는 관련이 없으나 동맥류 개수 및 크기와는 관련이 있음을 보여주었습니다. 일부 학자들은 동맥 벽의 국소 혈류 전단 응력이 섬유아세포와 혈관 내피세포에서 단핵구 화학주성 단백질-1(MCP-1)과 대식세포 염증성 단백질 1α(MIP-1α) 발현을 유도한다고 보았습니다. 고반응성 화학주성 인자 MCP-1과 MIP-1α가 혈관 벽에 대식세포를 집결시키고 염증 반응을 매개하면, 핵 전사 인자 c-Jun의 활성화를 유도하고 활성화 단백질 1(AP-1)의 활성화를 조절하여, 구조 도메인에서 MMP-9 프로모터를 활성화해 MMP-9 mRNA 발현을 증가시키고, 결국 혈관 벽 세포외 기질 용해를 유도하여 두개내 동맥류 형성을 초래합니다[21-23]. Saito 등은 MMP-9 양성 세포가 주로 동맥 중막과 외막의 대식세포에서 유래함을 발견하여, 대식세포가 발현하는 MMP-9가 동맥 벽 퇴행을 매개하여 동맥 동맥류 형성을 초래함을 입증했습니다[24]. 위 연구들은 MMP-9가 IA 형성과 관련됨을 시사합니다. 본 연구 결과 MMP-9가 IA에서 상향조절됨을 보였으므로, miR-133a-3p가 PSAT1/GSK3β/β-카테닌 경로 조절을 통해 MMP-9를 추가로 조절함으로써 IA 발생과 발전에 관여할 수 있다고 추측했습니다. 본 연구에서 miR-133a-3p 회복이 두개내 동맥류 조직에서 PSAT1, GSK3β, β-카테닌, MMP-9 발현을 감소시킴을 확인했습니다. 향후 연구에서 관련 연구를 수행하여 우리 발견을 검증할 예정입니다.
본 연구는 miR-133a-3p 발현이 감소하고 PSAT1, GSK3β, β-카테닌이 IA에서 증가한다는 개념에 실질적 증거를 제공했습니다. 새로운 증거는 miR-133a-3p가 다양한 종양에서 억제적 역할을 함을 시사합니다. 최근 연구에서 miR-133a-3p 발현이 비암 조직에 비해 유방암 조직에서 현저히 저하됨 보고되었습니다[25]. 또 다른 연구에서는 miR-133a-3p 발현이 인접 정상 조직이나 양성 전립선 병변 조직에 비해 진행성 전립선암(PCa) 조직에서 감소하며, 특히 뼈 전이 PCa 조직에서 현저하다고 주장했습니다[26]. 다른 유형의 질병에서 PSAT1의 촉진 효과가 일부 문헌에서 발견되었습니다. PSAT1 발현이 비소세포폐암(NSCLC)에서 현저히 증가하고 NSCLC 환자의 불량한 임상 결과를 예측함이 보고되었습니다[27]. 또한 PSAT1이 CRC 종양에서 가장 높게 상향조절된 유전자로 간주되며 화학요법 내성 환자에서 고발현됨도 밝혀졌습니다[28]. GSK3β 활성이 암 조직에서 증가함이 입증되었습니다[29]. 게다가 GSK3β 인산화 수준과 핵 β-카테닌 발현도 증가하여 GSK3β/β-카테닌 경로가 오스테오폰틴 조절에 관여할 수 있음을 시사합니다[30].
우리 데이터에서 나타난 다른 결과는 miR-133a-3p 상향조절과 PSAT1 하향조절이 IA EC의 세포자살을 억제하고 증식과 이동을 촉진하며, IA 조직에서 VEGF와 MMP-9 발현을 감소시킴을 시사했습니다. 이전 연구에서 miR-133a-3p 과발현이 제1형 콜라겐 알파 1(COL1A1)을 표적으로 하여 구강 편평세포암 세포의 침윤, 성장, 유사분열을 억제함이 제안되었습니다[31]. 고발현 miR-133a-3p가 COL1A1을 표적으로 하여 ESCC 세포 증식을 억제하고 세포자살을 촉진하며 ESCC 세포 이동과 침윤을 감소시킴이 보고되었습니다[32]. 또 다른 연구에서는 miR-133a-3p 일시적 상향조절이 재조합 신호 결합 단백질 Jκ를 직접 표적으로 하여 담낭암 세포의 이동, 침윤, 성장 능력을 억제함이 검증되었습니다[33]. 마찬가지로 본 연구는 miR-133a-3p가 PSAT1을 표적으로 하여 IA에서 역할을 수행함을 시사합니다. PSAT1 과발현이 in vitro에서 ESCC 세포 성장과 매트리겔 침윤을 촉진하고, PSAT1 고발현 ESCC 세포를 쥐에 주입하면 in vivo에서 종양 형성을 유도함이 나타났습니다[14]. 다른 연구에서도 PSAT1이 고발현되어 환자 예후 불량을 예측하며, in vivo와 in vitro에서 세포 종양형성과 증식을 촉진함이 보고되었습니다[13]. 선행 연구들은 일반적으로 PSAT1이 세포 주기 진행, 증식, 종양형성을 촉진함을 손실-기능 및 획득-기능 실험으로 확인했습니다[27]. MMPs는 Zn²⁺ 이온을 통해 활성 부위 결합 물 분자를 활성화하는 보존된 메커니즘을 기반으로 단백질 기질을 절단하는 일련의 효소로 구성됨이 지적되었습니다[34]. MMP-9는 많은 생물학적 과정에 막대한 영향을 미치는 독특한 프로테아제입니다[35]. 한 연구에서는 MMP-9가 대조군에 비해 동맥류군에서 증가함을 주장했습니다[36]. 혈관내피성장인자-A(VEGF-A)는 영양막의 혈관내 분화의 핵심 조절자로 인식됩니다[37]. 한 연구에서는 PSAT1 발현 억제가 VEGF, β-카테닌, GSK3β 인산화 발현을 억제함이 밝혀졌습니다[10].
간단히 결론짓자면, 본 연구는 miR-133a-3p 과발현 또는 PSAT1 다운레귤레이션이 GSK3β/β-카테닌 경로 억제를 통해 IA에서 내피세포 손상을 억제하고 내피세포 증식을 촉진한다는 가설을 확인했습니다. 이러한 발견은 IA에 대한 새로운 표적 치료법에 대한 통찰을 제공합니다. 이 발견들은 PSAT1/GSK3β/β-카테닌 경로와 관련하여 IA에서 miR-133a-3p의 역할을 강조합니다. 그러나 이에 대한 알려진 연구가 제한적이어서 miR-133a-3p와 PSAT1의 효과에 대한 명확한 결론을 내릴 수는 없습니다. 향후 임상시험에서 엄격하게 모니터링하고 적절히 보고해야 합니다.
해당 없음
나노물질
요약 파킨슨병(PD)은 중뇌 도파민 신경세포의 점진적 손실이 특징이며, 줄기세포 이식 방법이 치료에 유망한 전략을 제공합니다. 이러한 연구에서 이식된 세포의 생체 내 생물학적 거동 추적은 줄기세포 기능의 기본적 이해와 임상적 효과 평가에 필수적입니다. 본 연구에서는 열분해 법과 2단계 수정을 통해 폴리아크릴산(PAA)과 메톡시폴리에틸렌글리콜아민(PEG)으로 코팅된 새로운 초소형 초상자성 산화철 나노입자(USPIO-PAA/PEG NPs)를 개발했습니다. USPIO-PAA/PEG NPs는 TEM과 FTIR에서 보인 바와 같이 10.07
용접 셀 로보틱스가 보편화됨에 따라, 로보틱스 기업들은 고객 눈길을 끌 다음 큰 것을 내놓기 위해 경쟁하고 있습니다. 쿠카의 답이 바로 새로운 쿠카 플렉시블큐브입니다. 쿠카 플렉시블큐브 용접 셀은 치열해지는 경쟁과 제조 생산에 대한 더 큰 요구에 대한 쿠카의 해답입니다. 회사는 모듈형 로봇 용접 셀을 생산해 이러한 요구에 대응하기로 했습니다. 자동화의 단순화: 플러그 앤 플레이 이 로봇 용접 셀은 자동화를 단순화합니다. 쿠카는 이 시스템을 제조 공정에 단순하고 매끄럽게 통합되도록 설계했습니다. 시스템은 기본적으로 플러그 앤 플레이
