패혈증은 심각한 미생물 감염에 대한 신체 반응으로 치명적이고 생명을 위협하는 문제를 일으키는 극한 상태입니다. 패혈증은 면역계가 감염과 싸우기 위해 화학 물질을 혈류로 방출하면서 발생하며, 이는 염증을 유발해 응급 의료 상황으로 이어집니다. 석탄 광산 비산회에서 추출한 종방향 제올라이트와 산화철 나노복합체를 이용해 정전용량 바이오센서의 표면 특성을 개선, 패혈증 발병을 식별했습니다. 항-인터루킨-3(anti-IL-3) 항체를 아민 링커를 통해 제올라이트-산화철 복합 정전용량 전극 표면에 고정해 패혈증 바이오마커인 IL-3와 상호작용시켰습니다. 나노복합체의 형태학적, 화학적 성분은 FESEM, FETEM, EDX 분석으로 조사했습니다. 약 30 nm 크기의 종방향 제올라이트-산화철 나노복합체는 선형 곡선에서 3 pg/mL의 IL-3 검출 한계(R² = 0.9673, y = 1.638x - 1.1847)를 달성했습니다. 나노소재로 인한 항체 고정화량 증가와 표면 전류 개선으로 농도 의존 범위(3~100 pg/mL)에서 더 낮은 검출 한계를 얻었습니다. 관련 생체분자로 대조 실험 시 정전용량 변화가 없었고, 사람 혈청에 스파이크한 IL-3는 정전용량을 증가시켜 IL-3의 특이적·선택적 검출을 입증했습니다. 이 연구는 잠재적으로 유용한 방법으로 IL-3를 식별 및 정량화해 패혈증 발병 진단을 돕습니다.
패혈증은 신체가 감염에 심각하게 반응할 때 발생하는 치명적 상태입니다. 패혈증 발병 시 신체는 '사이토카인'이라 불리는 높은 수준의 신호 생체분자를 생성해 면역 세포를 끌어들입니다. 이 세포들이 더 많은 사이토카인을 분비하면 사이토카인 폭풍이 더 많은 면역 세포를 모집합니다. 초기 감염을 제어하는 대신 면역 인자가 신체 장기와 조직을 공격합니다. 또한 이 감염은 전신에서 연쇄 반응을 유발해 장기 부전과 조직 손상을 초래합니다. 특히 패혈증은 폐, 피부, 비뇨기, 위장관에서 시작해 다른 장기로 퍼져 장기 손상을 일으킵니다. 따라서 적절한 바이오마커로 패혈증을 조기에 식별해 환자에게 신속한 치료를 제공하고 생명을 구하는 것이 필요합니다. 연구자들은 인터루킨-3(IL-3) 염증 인자가 톨유사수용체 활성화 후 선천 면역 활성화 B 세포(IRA B 세포)에 의해 생성되는 패혈증 발병과 사망의 독립적 예측 인자임을 발견했습니다. 또한 높은 IL-3 수치가 패혈증 환자의 높은 사망률과 연관되며, IL-3가 패혈증 중 면역 조절과 코르티코스테로이드에 대한 높은 반응에 주요 역할을 함이 확인되었습니다. 본 연구는 제올라이트-산화철(제올라이트-철) 나노복합체로 개질한 정전용량 전기화학 센서를 이용해 IL-3 수준을 정량화하는 것을 목표로 했습니다.
바이오센서로 생체분자를 검출하는 것은 표적 또는 검출 분자가 트랜스듀서 전극 표면에 고정되는 것에 크게 의존합니다. 적절한 방향성을 가진 더 많은 고정화된 포획 프로브는 더 낮은 표적 검출 한계로 이어집니다. 대부분의 경우 포획 프로브 고정화는 물리적 흡착, 정전기적 상호작용, 공유 결합, 고분자를 이용한 생체분자 포획으로 수행되어 왔습니다. 그러나 위 방법들로 고정된 생체분자의 재현성과 생체적합성을 달성하기는 어려울 수 있습니다. 특히 RNA, DNA, 압타머, 펩타이드 같은 작은 포획 분자를 감지 표면에 부착하는 것은 복잡합니다. 다양한 연구자들이 효율적인 고정화를 위해 다른 기술들을 사용해 왔습니다. 최근 나노소재가 감지 표면에서 생체분자 고정화 과정에 매우 매력적으로 사용되고 있습니다. 금 나노입자는 폴리스티렌 ELISA 기판, 알루미늄 전극 등 다양한 감지 표면에 효율적으로 고정돼 항체, 단백질, DNA, 압타머 등 잠재적 분자들을 포획해 왔습니다. 실리카, 알루미늄, 그래핀도 생체분자 고정화에 흔히 사용되는 소재입니다. 이러한 나노소재들은 포획 분자 수를 늘리고 감지 표면에서 생체분자의 생체적합성과 안정성을 향상시켜 검출 전략을 개선하는 데 도움을 줍니다. 최근 제올라이트, 점토, 졸-겔 같은 무기 물질이 이러한 문제 해결을 위해 연구자들의 주목을 받고 있습니다. 또한 유해 물질이 관여하지 않고 비용이 적게 드는 그린 접근법으로 나노소재를 합성하는 것이 크게 장려되고 있습니다. 게다가 맞춤형 접근법으로 원하는 크기와 형태의 나노소재를 얻을 수 있습니다. 본 연구는 이러한 접근법에 부합하며 제올라이트 나노소재와 분리된 철을 결합해 나노복합체를 제조했습니다.
제올라이트는 TO₄ 사면체와 O 원자로 구성된 결정질 미세다공성 알루미노실리케이트입니다. 더 큰 표면적, 이온 교환 능력, 제어 가능한 소수성/친수성, 높은 기계적·열적 전도성 덕분에 생체분자 고정화에 유망한 소재입니다. 따라서 제올라이트 소재를 생체분자 고정화 과정에 이용해 포도당 센서, 요소 센서 등 더 낮은 검출 한계의 바이오센서를 개발하는 다양한 연구가 수행되었습니다. 마찬가지로 철 나노소재는 양이온 교환 특성 효과를 개선하고 생체분자와의 상호작용 시 전류 변화에 빠른 반응을 보입니다. 본 연구에 사용된 독특한 조성의 제올라이트-산화철 나노복합체는 전도도 향상으로 센서의 고성능을 더욱 강화하고 감도를 개선합니다. 본 연구는 석탄 광산 비산회에서 추출한 제올라이트-철 나노소재를 정전용량 전극 기판으로 이용해 포획 프로브인 항-IL-3 항체를 고정화했습니다. 이전의 다양한 인터루킨 검출 나노소재 매개 검출과 비교해 현재 감지 시스템은 여러 면에서 개선되었습니다. 예를 들어 전기화학 센서에 더 적합해 실험 단계가 적고, 표면 화학적 기능화에 적합하며 높은 비오염 능력을 보입니다.
정전용량 바이오센서는 전극 표면에서 프로브와 표적 간 인력을 기록해 생성되는 전기화학 센서입니다. 정전용량 바이오센서는 표적 생체분자가 감지 표면에 고정된 프로브와 결합할 때 전극 계면의 유전체 층 변화를 측정하는 데 도움을 줍니다. 전극과 전해질 사이 정전용량은 C = (2nε₀εA)/d로 표현되며, ε: 유전율, A: 판 표면적, ε₀: 자유 공간 유전율, n: 반복 핑거 수, d: 절연층 두께입니다. 비패러데이 정전용량 바이오센서는 금속화로 인한 단백질 변성을 피하고 표적과 프로브 결합 상호작용을 개선합니다. 다양한 연구가 정전용량 바이오센서를 이용해 뉴클레오티드, 중금속, 단백질, 유기 분자 등 다양한 표적 분자 식별에 활용했습니다. 본 연구에서는 제올라이트-철 개질 전극 표면에서 비패러데이 정전용량 바이오센서 실험을 수행했습니다. 제올라이트-철을 (3-아미노프로필)-트리메톡시실란(APTMS) 아민 링커로 정전용량 전극에 부착한 후, 항체 카복실기(COOH)와 아민 표면 간 인력으로 항-IL-3를 표면에 부착했습니다. 항-IL-3 항체 개질 전극으로 IL-3를 정량화하고 패혈증 발병을 진단했습니다.
비산회는 인도 열전력 발전소에서 받았습니다. 수산화나트륨과 황산은 Sigma Aldrich(미국 미주리)에서 구입했습니다. (3-아미노프로필)-트리메톡시실란(APTMS)은 Merck(미국 뉴저지)에서 받았습니다. Whatman 여과지는 Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠)에서 구입했습니다. IL-3와 항-IL-3 항체는 Santa Cruz Biotechnology(미국 텍사스)에서 받았습니다. 전계방사 주사전자현미경(FESEM; Hitachi, S-4300 SE, 일본)과 전계방사 투과전자현미경(FETEM; JEM-2100F, JEOL, 일본)을 사용해 이전에 기술된 방법으로 제올라이트-철 나노소재를 분석했습니다.
제올라이트-철 나노소재는 비산회에서 추출한 철, 실리카, 알루미나를 사용해 합성했습니다. 주요 세 단계: (1) 철 입자 분리; (2) 알루미노규산나트륨 추출; (3) 졸-겔 합성법으로 제올라이트-철 나노입자 제조.
비산회 25 g을 증류수 500 μL과 섞어 자석 교반기로 30분 교반했습니다. 자석 교반기에 붙은 철 입자들을 분리한 후, 분리된 입자 1 g을 25% 황산과 섞어 50 °C에서 1시간 교반했습니다. 이후 철 함유 용액과 철 입자를 Whatman 여과지로 분리해 제올라이트-철 나노소재 합성을 위한 산화철 기초로 사용했습니다.
알칼리 추출법으로 비산회에서 알루미노규산나트륨을 추출했습니다. 철 분리된 비산회 25 g을 2 M 수산화나트륨 500 μL과 섞어 100 °C에서 6시간 교반 가열했습니다. 용액 냉각 후 알루미노규산나트륨(혼합물 내 용액)을 Whatman 여과지로 분리했습니다. 여과액을 제올라이트 합성 기초로 사용했습니다.
추출한 철과 알루미노규산나트륨을 기초로 졸-겔법으로 제올라이트-철 나노소재를 합성했습니다. 첫 단계로 pH 12의 알루미노규산나트륨 200 mL를 비커에 담아 교반하며 가열했습니다. 이후 pH 1의 철 용액을 방울방울 떨어뜨려 pH 7이 될 때까지 적정했습니다. pH 7에서 백색 겔이 생성됐으며, 이 겔을 하룻밤 동안 계속 교반해 균일하게 분포된 제올라이트-철 나노입자를 얻었습니다. 다음 날 겔을 원심분리(10,000×g, 10분) 후 25% 에탄올과 증류수로 세척했습니다. 최종 생성물을 100 °C에서 1시간 건조해 제올라이트-철 나노소재 분말을 얻었습니다. 제올라이트-철 나노소재 표면은 FETEM과 FESEM으로 특성화했으며, EDX 분석으로 제올라이트-철 내 원소를 확인했습니다.
실란 커플링제 APTMS로 제올라이트-철 표면에 아민을 코팅했습니다. 제올라이트-철 1 g을 1% KOH와 10분 혼합 후 증류수로 과량 KOH를 제거했습니다. 이후 KOH 처리된 제올라이트-철을 1% APTMS와 혼합해 가열 교반기에서 하룻밤 두었습니다. 다음 날 나노소재를 에탄올로 세척 후 원심분리(10,000×g, 10분)했습니다. 이 APTMS-제올라이트-철을 IL-3 식별용 정전용량 전극 표면에 부착했습니다. 이를 위해 APTMS-제올라이트-철을 수산기화된 전극에 떨어뜨리고 실온에서 3시간 두었습니다. 제올라이트-철 산화물 나노복합체, APTMS, 감지 표면 간 결합은 생성된 산화기와 실란 커플링으로 이루어집니다. 일반적으로 실란 커플링은 산화기에 이용 가능한 다중 팔을 통해 일어나 제올라이트-철 산화물 나노복합체, APTMS, 감지 표면 간 연결을 생성합니다. 이러한 다중 연결로 감지 표면에 공간적 배열이 형성됩니다. 에탄올과 물로 표면 세척 후 항-IL-3 항체 고정화 과정을 수행해 IL-3와 상호작용시켰습니다.
위 표면은 아민 테더링으로 형성돼 항체 부착 시 이용 가능한 COOH기와 반응할 수 있습니다. IL-3를 항-IL-3 고정화 정전용량 전극 표면에서 식별했습니다. 100 pg/mL IL-3를 PBS 완충액에 희석해 항체 개질 전극 표면에 방울방울 떨어뜨렸습니다. 항체 고정화 후 남은 비결합 표면은 PEG-COOH(1 mg/ml)로 차단했습니다. PEG-COOH 부착 시 항체-APTMS와 유사한 반응이 일어납니다. IL-3와 상호작용 전후 정전용량 값을 기록했습니다. 값의 차이를 IL-3와 항체 결합으로 간주했습니다. 또한 검출 한계 계산을 위해 IL-3를 3~50 pg/mL로 적정해 항체 개질 표면에 각각 떨어뜨렸습니다. 다른 실험 과정은 앞서 기술한 대로 수행했습니다. 각 IL-3 농도에 대한 정전용량 값 차이를 계산해 엑셀에 플로팅하고 R² 값으로 IL-3 검출을 계산했습니다. IL-3가 항체 고정화 표면에 부착되면 진정한 상호작용이 일어납니다.
세 가지 다른 생체분자 조건에서 바이오파울링 실험을 수행했습니다: 비면역 항체 또는 대조 단백질 존재, IL-3 항체 부재. 첫 번째 경우 IL-3 항체 대신 비면역 항체 사용, 두 번째 실험에서 IL-3 대신 대조 단백질 사용, 마지막 실험은 IL-3 항체 없이 수행. 정전용량 값을 비교해 IL-3 항체와 IL-3의 특이적 상호작용을 확인했습니다. 선택성 실험은 사람 혈청 1:100 희석액에 IL-3를 스파이크해 항-IL-3 개질 전극 표면에 방울방울 떨어뜨려 수행했습니다. 각 IL-3 농도에 대한 정전용량 변화를 기록해 IL-3의 선택적 식별을 확인했습니다. 재현성은 동일 배치 제작으로 만든 유사 장치로 실험을 3회 반복(삼중 측정)해 확인했습니다. 프로브 고정화 표면의 수명 저장 안정성도 측정했습니다.
패혈증은 면역계에서 많은 화학 물질이 방출돼 광범위한 염증을 유발하고 궁극적으로 장기 손상을 초래하는 상태입니다. 도 1a는 패혈증 관련 상태 결정을 위한 항-IL-3 개질 정전용량 전극 표면에서 IL-3 식별 개략도입니다. APTMS 개질 제올라이트-철로 포획 항체를 감지 전극 표면에 부착했습니다. 제올라이트-철 표면의 APTMS가 나노소재의 아민과 전극 표면의 OH기 간 상호작용으로 전극 표면에 고정됐습니다. 항체는 제올라이트-철의 아민과 COOH기를 통해 표면에 연결됐습니다. 제올라이트-철은 감지 전극에 더 많은 APTMS를 부착하게 해 정전용량 전극 표면에 더 많은 항체를 포획합니다. 다양한 연구에서 포획 프로브의 감지 표면 고정화가 표적 분자 검출 한계 낮추기에 결정적 역할을 함을 보였습니다. 본 연구에서는 제올라이트-철 나노소재로 항-IL-3 항체를 감지 전극 표면에 부착했습니다. 적절한 방향성을 가진 더 많은 항-IL-3 항체 고정화가 IL-3의 더 낮은 검출 한계 달성에 도움을 줍니다.
도 1c, d(삽입도)는 FESEM으로 얻은 제올라이트-철 나노소재의 다양한 배율 형태 이미지와 EDX 원소 분석을 보여줍니다. 획득한 제올라이트-철 나노소재는 매끄럽고 균일하게 분포된 조밀한 종방향 나노구조를 가집니다. 이 나노구조 크기는 약 30 nm이며, 이미지는 나노복합체가 균일한 모양으로 적절한 거리에 잘 분포돼 있음을 보여줍니다. FETEM 이미지도 FESEM에서 얻은 것과 유사한 형태의 제올라이트-철 나노복합체 형성을 입증합니다(도 2a, b). EDX 결과는 합성된 제올라이트-철 나노복합체에 Fe, Al, Si, O가 존재함을 확인했습니다(도 2c, d). Si, Al, Fe, O의 주요 원소 원자 비율은 각각 3.46%, 0.78%, 2.13%, 24.39%로 나타났습니다. 이 FESEM과 EDX 결과는 제올라이트-철 나노소재 형성을 확인합니다.
항-IL-3 항체 고정화는 각 생체분자 고정화 후 정전용량 레벨 변화를 통해 확인했습니다. 도 3a는 제올라이트-철 개질 표면에서 항체 부착 과정 중 정전용량 변화를 보여줍니다. 도 3a에서 KOH 테더링된 정전용량 전극 표면은 1.74 × 10⁹ nF의 정전용량 값을 보였고, APTMS-제올라이트-철 방울방울 첨가 후 2.02 × 10⁹ nF로 증가했습니다. 이 정전용량 증가는 나노소재의 감지 전극 부착을 확인합니다. 또한 항-IL-3 항체 첨가 시 정전용량 값이 3.42 × 10⁹ nF로 급격히 증가했습니다. 이 큰 증가는 APTMS 개질 제올라이트-철에 더 많은 항체가 고정화됐기 때문입니다. 또한 나노소재가 감지 전극 표면에 더 많은 APTMS로 적절히 배열돼 궁극적으로 더 많은 항체를 끌어당겼습니다. 마지막으로 차단용으로 PEG-COOH를 첨가했고 정전용량은 3.64 × 10⁹ nF로 증가했습니다. 센서는 표면 전하 변화, 궁극적으로 정전용량 변화 기반으로 작동합니다. 표면 전하 변화는 분자 부착/상호작용에 따라 달라지며, 각 분자는 서로 다른 전하를 띠고 센서 정전용량에 영향을 미칩니다. 따라서 정전용량 차이를 측정값으로 사용했습니다. 감지 전극 표면에 IL-3 항체가 더 많이 점유돼 더 큰 정전용량 변화가 관찰됐습니다(도 3b). PEG-COOH는 감지 전극 표면에서 IL-3의 비특이적 결합을 줄이고 위양성 결과를 제거합니다. 다양한 연구에서 감지 표면의 PEG 기반 고분자가 생체적합성 개선, 신호대잡음비 감소, 고정화된 생체분자의 적절한 방향성 제공으로 센서 검출 한계 낮추기에 기여함이 입증됐습니다. APTMS 표면이 다른 생체분자를 정전기적으로 끌어당기므로, 제올라이트-철 나노소재의 과잉 APTMS 표면을 PEG-COOH로 덮어 바이오파울링을 줄였습니다. 이 항-IL-3 개질 표면으로 IL-3를 식별했습니다.
항-IL-3 개질 정전용량 전극 감지 표면에서 IL-3를 정량화했습니다. 처음에 더 높은 농도 IL-3(100 pg/mL)를 항체 개질 표면에 테스트했고, 정전용량 값이 3.74 × 10¹⁰ nF에서 13 × 10¹⁰ nF로 증가했습니다. 이 증가는 IL-3와 항-IL-3 항체 간 상호작용을 확인합니다(도 4a). 3~50 pg/mL IL-3 농도로 유사 실험을 수행했습니다. 도 4b에서 정전용량 값이 각각 4.56 × 10¹⁰, 5.84 × 10¹⁰, 6.64 × 10¹⁰, 8.39 × 10¹⁰, 12 × 10¹⁰ nF로 증가했습니다. IL-3 농도 증가에 따라 정전용량 값이 점진적으로 증가함을 확인했습니다(도 5a). 정전용량 값 차이를 계산해 엑셀 시트에 플로팅했고, IL-3 검출을 3 pg/mL, R² 값 0.9673으로 계산했습니다(도 5b). 항-IL-3와 상호작용하는 다양한 IL-3 농도(3~100 pg/mL)에서 선형 농도 의존 반응을 보였으나, 더 높은 농도에서 포화됐습니다.
바이오파울링은 모든 종류의 바이오센서에서 가장 큰 문제로 위양성 표적 식별을 초래합니다. BSA, 에탄올아민, PEG 기반 고분자 같은 차단제가 감지 표면 바이오파울링 감소에 흔히 사용됩니다. 본 연구에서는 PEG-COOH를 차단제로 사용했고, 세 가지 대조 실험(IL-3 항체 없음, 비면역 항체, 대조 단백질 IL-8)에서 바이오파울링 효과를 확인했습니다. 도 6a에서 세 가지 대조 실험 모두 정전용량 값 증가를 보이지 않아 바이오파울링 없이 IL-3 특이적 식별됨을 나타냅니다.
실제 상황을 위해 다양한 농도 IL-3를 사람 혈청에 스파이크해 동일한 실험 절차로 IL-3를 식별했습니다. 도 6b에서 혈청 내 스파이크된 IL-3가 IL-3 농도 증가에 따라 명확히 증가된 정전용량 값을 생성했습니다. 이는 항-IL-3 개질 정전용량 전극에 의한 선택적 IL-3 식별을 확인합니다.
재현성 측면에서 감지 표면은 최소 오차로 잘 작동합니다. 제조된 감지 표면 부착 나노소재의 작동 수명은 데시케이터 내 적절한 보관 시 3개월까지 연장 가능합니다. 그러나 프로브 부착 후 표면은 2주간 안정적이었으나 19% 안정성 손실 경향을 보였고, 3주차부터 손실이 가파르게 증가했습니다. 현재 사용 가능한 센서들과 비교 연구를 수행해 높은 성능을 입증했으며, 여러 경우에서 비교 가능하거나 더 우수한 거동을 보였습니다(표 1).
패혈증은 압도적인 면역 반응을 수반하는 생명을 위협하는 상태로 매우 위험하며 전신에 영향을 미칩니다. 본 연구는 정전용량 전극에서 패혈증 바이오마커(IL-3) 식별을 시연했습니다. 석탄 비산회에서 추출한 제올라이트-철 나노소재를 정전용량 전극에 개질해 생체분자가 감지 전극에 결합할 때 전류 흐름을 증가시켰습니다. 아민 개질로 항-IL-3 항체를 제올라이트-철에 부착했습니다. 항체 개질 전극에서 IL-3 검출을 수행해 3 pg/mL의 IL-3 검출 한계에 도달했습니다. 추가 대조 실험에서 정전용량 값 증가가 없어 IL-3 특이적 검출을 확인했고, 사람 혈청 내 스파이크 IL-3 선택 실험에서 정전용량의 명확한 증가를 보였습니다. 이 실험 방법은 IL-3 수준을 정량화하고 패혈증 발병 진단을 돕습니다.
나노물질
초록 나노바이오센서는 화학 및 생물학적 제제를 감지하고, 신호 변환기 표면에 고정된 생물학적 인식 요소와 생리활성 분자 사이의 물리화학적 검출을 통해 의미 있는 데이터로 변환하는 편리하고 실용적이며 민감한 분석기입니다. 빠르고 정확하며 신뢰할 수 있는 작동 특성 덕분에 나노바이오센서는 임상 및 비임상 응용, 침대 옆 검사, 의료 섬유 산업, 환경 모니터링, 식품 안전 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 있으며, 이러한 중요한 응용 분야에서 핵심적인 역할을 수행합니다. 따라서 바이오센싱 인터페이스의 설계는 나노바이오센서의 성능을 결정하
요약 본 논문에서는 전금속 메타물질 기반 테라헤르츠(THz) 바이오센서를 이론적으로 연구하고 실험적으로 검증했습니다. 이 THz 메타물질 바이오센서는 레이저 드릴링 기술로 제조된 스테인리스강 소재를 사용합니다. 시뮬레이션 결과, 이 메타물질 센서의 최대 굴절률 감도와 성능 지수(FOM)는 각각 294.95 GHz/RIU와 4.03으로 나타났습니다. 이어서 소혈청알부민(BSA)을 검출 물질로 선정해 바이오센서의 유효성을 평가했습니다. 실험 결과 검출 감도는 72.81 GHz/(ng/mm2), 검출 한계(LOD)는 0.035 mg/mL
