간암의 방사선 요법은 방사선에 대한 간의 내성이 낮기 때문에 제한됩니다. 방사선 증감제는 필요한 방사선량을 효과적으로 줄일 수 있습니다. AGuIX 나노 입자는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 형광 이미징 및 다중 모드 이미징을 위한 방사성 동위원소 또는 형광 마커를 전달할 수 있는 작은 다기능 가돌리늄 기반 나노 입자입니다. 또한 가돌리늄의 원자 번호가 높기 때문에 종양 방사선 증감제로도 작용할 수 있습니다. 방사선 치료 중 종양 미세 환경 내에서 이들의 보유 기간과 크기를 정량화하기 위해 이러한 가돌리늄 기반 나노 입자의 생체 분포 및 약동학을 정의하는 것이 중요합니다. 따라서 이 연구에서는 AGuIX에 64 레이블을 성공적으로 지정했습니다. 편리한 내장 킬레이터를 통한 Cu. 생체 분포 연구에 따르면 방사성 추적자 64 Cu-AGuIX는 누드 마우스의 HepG2 이종이식편에서 높은 수준으로 축적되어 간세포암종에서 영상 유도 방사선 요법을 위한 잠재적인 치료학적 나노프로브가 될 수 있음을 시사합니다. 우리는 또한 HepG2 세포에서 AGuIX 흡수를 확인하기 위해 투과 전자 현미경을 사용했습니다. 방사선 요법 연구에서 18 감소 F-FDG 흡수는 1시간 전에 주사된 AGuIX로 조사된 누드 마우스의 이종이식편에서 관찰되었습니다. 이러한 결과는 AGuIX가 간암에 대한 방사선 요법을 안내하기 위해 PET 영상을 위한 치료학적 방사선 감작제로 사용될 수 있다는 개념 증명을 제공합니다.
<섹션 데이터-제목="배경">간세포 암종(HCC)은 세계에서 가장 흔한 악성 종양 중 하나입니다. 2012년 새로 진단된 간암 사례는 782,500건이었고 간암으로 인한 사망은 745,500건이었으며 이 중 70~90%가 간세포암종이었다[1]. 대부분의 간세포암종 환자는 처음 진단될 때 진행성 또는 말기기로 분류되기 때문에 환자의 20-25%만이 근치적 치료에 적합하다[2, 3]. 따라서 간암의 치료는 임상적으로 가능한 주요 기술로서 방사선 요법을 포함하는 종합적인 다학제적 치료가 필요하다[4].
간세포암종 환자에 대한 방사선 요법의 주요 한계 중 하나는 주변의 정상 간 조직에 대한 방사선 관련 독성입니다. 용량이 증가함에 따라 RILD(radiation-induced liver disease)를 포함한 방사선 치료 합병증의 발생은 환자의 생명에 심각한 위협이 되고 있다[5]. 이 문제를 피하기 위한 전략 중 하나는 종양 조직에 축적될 수 있는 방사선 증감제를 사용하여 방사선에 대한 종양 세포 민감도를 증가시켜 종양 세포가 더 낮은 선량의 방사선에 의해 더 많이 죽도록 하는 것입니다[6].
2013년 Mignot et al. 새로운 유형의 다기능 가돌리늄 나노입자인 AGuIX는 직경이 작고(약 5nm) 신장에서 빠르게 배설되는 것으로 보고되었으며[7] SPECT, PET, MRI, 또는 형광 이미징. 이러한 나노입자는 많은 수의 가돌리늄(원자번호 64)을 운반하기 때문에 종양 방사선 치료 감작제로 사용할 수 있습니다[8]. 많은 연구에서 AGuIX 나노입자가 시험관 내 다양한 종양 세포(방사선 내성 세포주 포함)에서 방사선 요법에 대한 종양 세포의 민감도를 증가시키는 것으로 나타났습니다. 과민성 향상 비율(SER)은 1.1에서 2.5 범위에서 관찰되었습니다[8]. EPR(Enhanced Permeability and Retention) 효과로 인해 대부분의 종양 모델에서 AGuIX의 높은 종양 흡수와 비교하여 AGuIX의 간 배경이 훨씬 낮음을 감안할 때 이러한 유형의 나노 입자는 HCC에 대한 이상적인 방사선 요법 증감제로 개발될 큰 잠재력을 가지고 있습니다. [9].
이 AGuIX 나노 입자는 주로 MRI 유도 방사선 요법(RT)을 위해 개발되었습니다. 그러나 AGuIX의 약동학은 완전히 이해되지 않았습니다. 방사선 치료에 대한 선량 효과를 정량적으로 결정하려면 이러한 나노 입자의 생체 분포 및 약동학을 정의하는 것이 중요합니다. 64 양전자방출단층촬영(PET)에서 가장 일반적으로 사용되는 방사성 동위원소 중 하나인 Cu는 붕괴 특성(T 1/2 =12.4 h) 작은 분자와 큰 느린 제거 단백질 및 나노 입자를 이미지화할 수 있는 유연성을 제공합니다. 이 연구에서 우리는 AGuIX를 64 로 방사성 표지했습니다. Cu는 HepG2 종양 보유 누드 마우스에서 생체 내 생체 분포의 초기 평가를 위해 종양 미세 환경 내에서 유지의 크기와 기간을 보다 정확하게 측정합니다. HepG2 종양 보유 누드 마우스에서 방사선 증감제로 AGuIX를 사용하여 개념 증명 연구를 추가로 수행하기 위해 18 을 사용했습니다. F-FDG PET/CT, AGuIX 유무에 관계없이 방사선 요법 전후에 치료 반응을 모니터링하고 HepG2 종양의 포도당 대사를 평가하기 위해 임상적으로 입증된 종양 대사 영상 기술입니다.
탈수된 구형의 5nm 이하 가돌리늄 나노입자(AGuIX)는 Nano-H(프랑스 리옹)에서 입수하여 정제 없이 사용했습니다. 나노 입자는 내장된 DOTA 킬레이터를 통해 폴리실록산 껍질에 부착된 가돌리늄 원자로 구성됩니다. 나노입자는 멸균 DEPC 처리된 물(Invitrogen, USA)에서 재수화되었으며 제조업체의 지침에 따라 사용할 때까지 4°C에서 보관되었습니다. 메게스트롤 아세테이트는 Sigma Chemical Co.(미국 미주리주 세인트루이스)에서 구입했습니다. 인간 HCC 세포주인 HepG2는 American Type Culture Collection(American Type Culture Collection, University of Virginia, VA, USA)에서 입수했습니다. 64 Cu 동위원소는 Wisconsin University에서 구입했습니다. 다른 화학 물질 및 시약은 Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 추가 정제 또는 처리 없이 사용했습니다. 체중이 16~18g인 6주령 수컷 BALB/c 흉선 누드 마우스를 Charles River에서 구입했습니다. 동물 연구는 버지니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
위 용액에서 농도 0.5mM의 AGuIX 나노입자를 HepG2 세포와 함께 1시간 동안 배양했습니다[10]. 그런 다음, 잔류 나노입자를 0.1M의 인산완충식염수로 세척하고 원심분리하여 정제하였다. 나노입자가 있는 세포 펠릿은 이미징을 위해 0.1M Pb에서 4% 포름알데히드와 1% 글루타르알데히드로 염색되었습니다.
AGuIX 나노입자는 64 로 방사성 표지되었습니다. Cu 동위원소. 먼저 200μl의 AGuIX 나노입자 용액(10μmole의 AGuIX)과 100μl의 0.5M NH4를 혼합했습니다. OAc 완충액(pH =5.5). 5분 동안 배양 후 64 의 1–3 mCi CuCl2 0.1N의 HCl을 첨가하고, 반응 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. 이어서, 반응 혼합물을 3k Amicon Ultra Centrifugal Filter(Merck Millipore)를 통한 여과에 의해 멸균하였다. 방사성 화학적 순도는 이전에 설명한 대로 이동상으로 20mM의 시트르산을 사용하여 iTLC에 의해 결정되었습니다[11].
HepG2 세포는 1mM의 피루브산나트륨, 1mM의 비필수 아미노산, 10% FCS(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY, USA)를 포함하는 MEM에서 성장되었습니다. 세포는 습한 공기/CO2 대기에서 유지되었습니다. (19/1), 2~3일마다 계대배양했습니다.
HepG2 세포(5 × 10 6 )을 0.1ml의 HBSS에 수집한 다음 이 세포 현탁액을 27게이지 바늘을 사용하여 각 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사했습니다. 세포 주사를 받은 누드 마우스의 귀에는 식별을 위해 태그가 지정되었습니다. 일반적으로 HepG2 세포를 주입한 지 2주 후에 고형 종양이 보이기 시작했습니다.
종양이 있는 누드 마우스(수컷 5마리, 암컷 4마리)를 무작위로 세 그룹으로 나누고 64 를 복강 내 주사했습니다. Cu-AGuIX, 약 0.9MBq의 활성, 0.2mL 용량 주사 후 9, 21, 40시간에 이소플루오란 흡입과 함께 마취 하에 경추 탈구로 마우스를 희생시켰습니다. 관심 기관(심장, 근육, 폐, 신장, 비장, 간, 종양 등)을 절개하고 무게를 잰 후 심실에서 100μL의 혈액을 채취했습니다. 각 샘플에 대한 활성은 γ 카운터(CRC-7, Capintec Inc., NJ, USA)를 사용하여 결정되었습니다. 다양한 조직과 기관의 방사능 분포를 계산하여 그램당 주사 용량의 백분율(% ID/g)로 표시했습니다.
64 0.2mL의 생리식염수 용액에 용해된 Cu-AGuIX(22.2MBq)를 종양이 있는 각 누드 마우스에 복강내 주사했습니다. 각 동물은 PET 시스템(SuperArgus, Sedecal, Spain)의 침대에 엎드려 눕혀졌습니다. PET 이미지는 64 의 주사 후 9시간과 21시간에 서로 다른 기간에 대해 획득했습니다. 유도를 위한 4-5% isoflurane과 유지를 위한 1-2%의 마취 하에서 Cu-AGuIX, 둘 다 산소에 의해 균형을 이룹니다.
방사선 치료 중 AGuIX의 방사선 과민성을 평가하기 위한 PET 영상 연구를 위해 HepG2 종양이 있는 12마리의 누드 마우스를 3개의 그룹으로 나누었으며 그룹당 4개의 마우스를 무작위로 할당했습니다. 기준 PET 영상의 경우 마우스에 18 을 주사했습니다. 꼬리 정맥을 통해 F-FDG(16.4 ± 4.7 MBq)를 유지하고 30분 p.i. (주입 후) 작은 동물 PET 스캐너(Madiclab, Shandong, CN). PET 이미지는 3D OSEM 알고리즘, 0.91 × 0.90 × 0.90 mm의 복셀 크기와 1.3 mm의 시야 중심 공간 해상도를 사용하여 재구성되었습니다.
조사 연구를 위해 각 그룹은 0.1mL의 생리 식염수, 1mg(0.1mL)의 AGuIX, 10mg(0.1mL)의 AGuIX를 꼬리 정맥으로 주사했습니다. 주사 후 1시간에 이 누드 마우스에 250kV 및 8mA에서 작동되는 X선 소스(X-RAD 320, Precision X-Ray, North Branford, CT, USA)를 사용하여 방사선을 조사했습니다. mm Al 필터는 1.2Gy/min의 선량률로 총 6Gy의 선량을 제공합니다. 다음 날, 동일한 조사 프로토콜을 마우스에 대해 반복했습니다. 두 번의 방사선 처리 후 1일에 이 마우스는 18 F-FDG(11.1 ± 1.0MBq) PET 첫 번째 PET 스캔과 동일한 프로토콜을 사용합니다. 표준 흡수 값 최대값(SUVmax)은 종양 영역(Madiclab, Shandong, CN)에서 관심 영역(ROI)을 그려서 결정되었습니다.
모든 실험은 3중으로 수행되었으며 결과는 평균 ± 표준 오차(SE)로 표시되었습니다. 통계적으로 유의한 차이는 양측의 쌍을 이루지 않은 t를 사용하여 계산되었습니다. 테스트 또는 단방향 분산 분석; 피 <0.05(*) 및 <0.01(**)의 값은 유의한 것으로 간주되었습니다.
AGuIX 기반 영상유도 방사선치료에서는 조영증강 MRI가 광범위하게 사용되어 왔지만, 나노입자의 약동학을 더 오랜 시간 측정하기 때문에 나노입자 농도의 검출 한계가 우려된다. 훨씬 더 민감하고 더 높은 정량적 용량으로 PET는 농도의 동적 범위를 조영제 강화 MRI로 감지할 수 없는 훨씬 더 낮은 나노몰 농도로 확장합니다. 이 보고서에서 우리는 64 를 사용하여 AGuIX의 생체 분포 및 약동학의 라벨링 및 평가를 설명했습니다. 잠재적 PET 영상 유도 방사선 요법을 위한 Cu.
세포 배양 연구의 경우 발표된 데이터를 기반으로 0.5mM 농도의 AGuIX 나노입자를 선택하고 AGuIX 나노입자를 HepG2 세포와 함께 1시간 동안 배양했습니다[10]. HepG2 세포의 세포질로의 흡수가 관찰되었다(그림 1). 이 결과는 AGuIX 나노입자를 다른 유형의 세포주와 함께 배양한 이전에 발표된 연구와 일치합니다[12, 13]. 우리는 또한 AGuIX가 HepG2 세포에서 우수한 분산 형태를 보이는 것을 관찰했으며, 이는 AGuIX가 세포에서 안정적임을 시사합니다.
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HepG2 세포 내 AGuIX의 국소화. 아 . TEM 이미지(× 6500)는 AGuIX가 HepG2 세포로 흡수되는 것을 보여줍니다. ㄴ . 확대 TEM 이미지(× 52000)는 세포질에서 AGuIX 나노 입자의 분포를 보여줍니다.
라벨링은> 98% 방사화학적 수율을 위해 한 단계에서 내장 킬레이터 DOTA가 있는 현재 형태의 AGuIX로 편리하게 수행되었습니다. iTLC 테스트를 사용하여 원래 반점에 유지된 방사성 표지된 나노입자를 식별한 결과 표지는 각각 약 3–10MBq/μmol 및 98%의 비활성 및 방사성 화학적 순도를 나타냈습니다. 각 합성에 의해 최종 제품의 평균 50–100MBq가 얻어졌습니다.
64 Cu-AGuIX 나노 입자를 복강 내 주입하고 HepG2 종양을 가진 누드 마우스에서 생체 분포를 결정하고 이전에보고 된 것과 비교했습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 각 장기/조직의 생체 분포는 조직 그램당 투여된 활성(주사된 용량)의 백분율(% ID/g)로 표시됩니다. 결과는 64 Cu-AGuIX는 종양에 축적되어 9, 21, 40시간 p.i. 흡수율은 각각 7.82 ± 1.50, 8.43 ± 6.23, 6.84 ± 1.40% ID/g입니다. 이러한 장기 체류는 세포 내부의 AGuIX 나노입자의 흡수에 기인할 수 있으며 따라서 64 세포에 있는 Cu 거주. 다른 보고서[11, 14]와 일치하게, 비록 다른 동위원소 방사성 표지와 주입 경로가 사용되었지만 64 Cu 방사성 표지된 나노프로브는 다른 정상 기관 및 조직에서 훨씬 더 낮은 흡수(1% ID/g 미만) 및 빠른 제거를 나타냈다. 종합적으로 이 데이터는 64 의 잠재적인 사용을 시사합니다. Cu로 표지된 AGuIX는 AGuIX의 생체분포 및 약동학을 측정하여 이러한 나노입자가 방사선 과민제로 사용되는 방사선 요법 계획을 안내하는 데 도움이 됩니다. 본 연구에서는 복강내 주사를 사용하였기 때문에 다른 연구에서 보고된 것보다 신장 흡수율이 훨씬 낮다[11, 14].
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64 의 생물 분포 HepG2 종양이 있는 누드 마우스의 Cu-AGuIX. 각 조직/기관의 방사능 흡수는 64 의 복강 내 주사 후 9, 21, 40시간에 %ID/g로 표시되었습니다. Cu-AGuIX(평균 ± SD, n =3)
Micro-PET 이미징은 64 의 높은 흡수율을 보여주었습니다. Cu-AGuIX는 종양이 있는 누드 마우스의 종양, 신장 및 간에서 관찰되었습니다(그림 3). 64 투여 후 종양이 명확하게 보였습니다. Cu-AGuIX는 9시간에, 그리고 배경이 감소함에 따라 주입 후 21시간까지 훨씬 더 명확하게 나타납니다.
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종양 마우스의 마이크로 PET 이미지. 종양이 있는 누드 마우스의 PET 이미지(상단, 관상면, 하단, 횡단면)(빨간색 화살표 )은 64 의 복강 내 주사 후 9시간(왼쪽) 및 21시간(오른쪽)에 획득했습니다. Cu-AGuIX
AGuIX 투여 여부에 관계없이 다양한 방사선 요법 반응을 평가하려면 18 F-FDG PET/CT 영상은 두 가지 다른 투여량에서 AGuIX 주사 유무에 관계없이 방사선 조사 후 대사 변화를 모니터링하기 위해 수행되었습니다. 18 감소 방사선 조사된 모든 마우스에서 이종이식편의 F-FDG 흡수가 관찰되었습니다(그림 3). 방사선 감작 효과의 주요 지표인 SUVmax(B/A)는 생리 식염수, 1mg의 AGuIX 및 10mg의 AGuIX를 투여받은 마우스의 경우 각각 1.03 ± 0.03, 1.04 ± 0.04, 1.24 ± 0.02였습니다. 4). AGuIX 10mg 그룹의 경우 T/L(B/A)이 AGuIX 1mg 그룹에 비해 유의하게 증가했습니다(p <0.001, 독립 샘플 테스트) 및 일반 식염수 그룹(p <0.001, 독립 표본 테스트). 1mg의 AGuIX와 생리 식염수(p =0.83, 독립 표본 테스트)(그림 5). 이러한 결과는 이종이식편의 포도당 대사가 AGuIX 10mg 주사를 받은 조사된 마우스에서 대부분 억제되었음을 시사한다. 방사선 요법은 FDG 흡수로 이어질 수 있는 염증을 유발할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 전신 오류를 상쇄하기 위해 모든 그룹에 대해 동일한 방사선량과 RT 치료 후 동일한 시점을 선택합니다. 따라서 RT에 의해 유발된 염증의 정도는 세 그룹 모두에서 거의 동일해야 하며 염증에 의해 유도된 FDG 흡수에 대한 기여도 거의 동일한 수준이어야 합니다. 이 문제를 피하기 위해 다른 PET 이미징 프로브를 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 발견은 AGuIX가 HepG2 종양 보유 마우스에서 종양 방사선 증감제로 사용될 수 있다는 개념 증명을 제공합니다.
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18 방사선 조사 전후의 마우스의 F-FDG PET 이미지. 18 F-FDG PET 이미지는 조사 전(좌)과 조사 후 1일(우) 각각의 패널에서 비교되었고, 세 개의 패널은 생리 식염수(좌), 1mg의 AGuIX( 중간 패널) 및 10mg의 AGuIX(오른쪽 패널). 각 이미지에 동일한 색상 스케일이 적용되었습니다.
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18 조사 전후의 F-FDG PET 정량 평가. T/L(B), 조사 전 SUVmax(종양) 대 SUVave(간)의 비율; T/L(A), 조사 후 SUVmax(종양) 대 SUVave(간)의 비율; T/L(B/A), T/L(B) 대 T/L(A)의 비율; AGuIX(1mg), AGuIX 1mg 주입, AGuIX(10mg), 10mg AGuIX 주입
마지막으로, 핵영상 탐침 자체에서 흡수되는 방사선량 역시 임상 적용을 고려할 때 중요한 고려 사항입니다. 현재 형태의 AGuIX 나노입자는 생체 내 대사 및 독성에 대해 철저히 조사되었으며 FDA의 인체 연구 승인을 받았습니다[15]. 68 에 레이블을 지정하여 Ga(~ 1 h 붕괴 반감기) 또는 89 Zr(78시간 붕괴 반감기), 정맥 주사에 의한 생쥐의 생체 분포 연구 결과 빠르면 30분부터 68 89 까지 최대 72시간까지 Zr [11, 14]. 신장에 의한 빠른 배설은 일반적으로 유익하지만 신장이 방사선에 민감하기 때문에 신장이 이러한 높은 흡수율을 견딜 수 있는지 여부와 장기간의 체류 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. 이 연구에서 신장 흡수는 ~ 5% ID/g으로 전체 조사 기간 동안 간 및 종양보다 낮았습니다. 이 차이는 주입 경로가 다르기 때문이라고 가정할 수 있습니다. 복강내 주사의 경우 AGuIX 나노입자가 복막에 지속적으로 흡수된 반면, 정맥 주사의 경우 나노입자가 신장에서 빠르게 배설되었다. 각 장기와 조직의 방사선 민감도가 다르기 때문에 임상 사용으로 번역하기 위한 방사성 테라노스틱 프로브의 최종 결정은 더 자세한 선량 측정 연구가 필요합니다.
AGuIX 나노입자가 64 로 성공적으로 라벨링되었습니다. 높은 수율의 Cu. 생체 분포 연구에 따르면 방사성 추적자 64 Cu-AGuIX는 종양에서 높은 축적을 보였고 누드 마우스의 HepG2 이종이식편에서 장기간 유지되어 HCC에서 영상 유도 방사선 요법을 위한 잠재적인 치료학적 나노프로브임을 시사합니다. 18 의 상당한 감소 AGuIX를 주사한 종양 누드 마우스 그룹에서 방사선 요법 후 F-FDG 흡수는 AGuIX가 HepG2 종양 보유 마우스에서 방사선 요법을 향상시키기 위한 종양 방사선 증감제로 사용될 수 있다는 증거를 제공했습니다. 임상 적용으로의 잠재적 번역을 위한 방사선 독성을 결정하기 위해서는 선량 측정에 대한 추가 조사가 필요합니다.
나노물질
초록 배경 MicroRNA(miR)는 패혈증에 참여하는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 우리는 생쥐의 패혈증 유발 폐 손상에 대한 성 결정 영역 Y 관련 고이동성 그룹 상자 6(Sox6)을 표적으로 하는 miR-499-5p의 보호 효과를 논의하는 것을 목표로 합니다. 방법 패혈증 유발 폐 손상 모델은 맹장 결찰 및 천자에 의해 확립되었습니다. 마우스의 폐 조직에서 습윤/건조 중량(W/D) 비율, miR-499-5p, Sox6, Caspase-3 및 Caspase-9 발현을 테스트했습니다. 폐 손상 점수, 콜라겐 섬유 및 폐 조직
초록 기존의 암 치료제는 다양한 부작용과 표적 종양에 대한 불충분한 손상으로 인해 비판을 받아왔다. 나노 입자의 돌파구는 전통적인 치료법과 진단을 업그레이드하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 실제로 나노 입자는 기존의 암 진단 및 치료의 단점을 해결할 뿐만 아니라 종양 진단 및 치료를 위한 새로운 관점과 첨단 장치를 만들 수 있습니다. 그러나 나노입자에 대한 연구는 대부분 in vivo 및 in vitro 단계에 머물고 있으며, 나노입자에 대한 임상 연구는 극히 소수에 불과하다. 이 리뷰에서 우리는 먼저 암 진단 및 치료에
