광열 치료 및 광음향 영상을 위한 폴리피롤 코팅 철-백금 나노입자의 합성 및 시험관 성능

결과 및 토론

FePt@PPy NP의 합성 및 특성화

FePt NP의 합성 과정은 Scheme 1에 나와 있습니다. 이러한 나노 입자의 EDS 분석 결과 Fe와 Pt의 최종 원자 구성이 각각 20%와 80%인 것으로 나타났습니다(추가 파일 1:그림 S1). 소수성 FePt NP는 3-MPA로 수정되었습니다. 따라서 평균 크기가 8.3nm인 친수성 FePt NP가 됩니다. 소수성 FePt 나노입자는 표면에 올레산과 올레일 아민이 존재하기 때문에 헥산에 분산됩니다. 그러나 입자는 리간드 교환 후에 물에 용해됩니다. 소수성 FePt 나노입자와 친수성 FePt 나노입자의 FTIR 스펙트럼은 표면의 올레산, 올레일 아민, 3-MPA의 흡수 리간드의 특징적인 밴드를 보여주었다(그림 3, 반응식 2)[14, 18]. FTIR 데이터(그림 2)와 물에 대한 친수성 FePt 나노입자의 우수한 용해도(Scheme 1, step 2)는 성공적인 리간드 교환 과정을 확인시켜줍니다.

광열 요법 및 광음향 영상에 대한 FePt@PPy NP의 합성 및 적용에 대한 도식적 표현

FePt NP는 (NH₄를 사용하여 화학적 산화 중합을 통해 PPy로 코팅되었습니다. )S₂ O₈ 산화제와 PVA를 안정제로 사용합니다. PPy 층은 두께가 약 10nm인 TEM 이미징(그림 1c)으로 명확하게 관찰되었으며 FePt@PPy NP의 평균 크기는 42nm입니다(그림 1d). FePt@PPy NP의 FTIR은 또한 FTIR 주파수 변화를 조사하여 PPy NP의 코팅을 확인하기 위해 구현되었습니다(그림 3c). PPy의 특징적인 피크는 이전 보고서에서 잘 분석되었다[19]. 1620 및 1446cm ⁻¹ 의 FTIR 진동 대역 PPy 링의 C–C 및 C=C 신축 진동에 할당되었습니다. 1236cm의 밴드 ⁻¹ CN 신축 진동에 기인했으며 1076cm ⁻¹ 의 밴드 C-N 면내 변형 모드의 존재를 나타냅니다. 또한 798 및 600cm의 밴드 ⁻¹ C-H 및 NH 면내 변형 진동 및 C-H 외부 굽힘 진동에 각각 기인. TEM과 함께 FTIR은 PPy 외부 FePt NP의 성공적인 코팅을 보장합니다.

아 TEM 및 b 순수한 FePt NP의 해당 크기 분포. ㄷ TEM 및 d FePt@PPy NP의 해당 크기 분포

(a) 소수성 FePt NP, (b) 친수성 FePt NP 및 (c) FePt@PPy NP의 FTIR 스펙트럼

순수한 FePt, PPy 및 FePt@PPy NP의 UV-Vis-NIR 스펙트럼

동일한 양의 FePt를 갖는 순수 FePt NP와 FePt@PPy NP의 광열 가열 곡선. 모든 용액은 1-W/cm ² 로 조사되었습니다. 6분 동안 808nm 레이저

아 다양한 농도의 FePt@PPy NP의 UV-Vis-NIR 스펙트럼. ㄴ 농도가 다른 FePt@PPy NP의 광열 붕괴. ㄷ 조사된 샘플의 해당 NIR 열화상 이미지. 모든 용액은 1-W/cm ² 로 조사되었습니다. 5분 동안 808nm 레이저

아 50μg/mL의 FePt@PPy NP의 광열 거동은 6분 동안 다양한 전력 밀도에서 808nm 레이저로 유지되었습니다. ㄴ 켜짐/꺼짐 레이저 실험(1 W/cm ² )에서 FePt@PPy NP 50μg/mL의 6가지 가열/냉각 주기의 실시간 온도 기록 ). ㄷ 조사 전후의 FePt@PPy NP의 UV-Vis-NIR 스펙트럼

48시간 동안 다양한 농도의 FePt 및 FePt@PPy NP와 함께 배양된 MDA-MB-231 세포의 세포 생존율(MTT 분석 포함)

다른 레이저 출력 밀도와 다른 조사 시간에서 FePt@PPy NP로 처리된 세포에서 살아 있는 세포의 백분율. 아 조사는 4분 동안 수행되었습니다. ㄴ 조사는 6분 동안 수행되었습니다.

다양한 조건에서 MDA-MB-231 세포의 명시야 및 형광 이미지. 아 제어. ㄴ 레이저 전용. ㄷ 50μg/mL FePt@PPy NP + 레이저 d 70μg/mL FePt@PPy NP + 레이저 이 100μg/mL FePt@PPy NP + 레이저 모든 용액은 1W/cm ² 로 조사되었습니다. 6분 동안 808nm 레이저

아 FePt@PPy NP를 주입하기 전 누드 마우스의 광학 이미지 및 해당 NIR 열화상 이미지. ㄴ 왼쪽:피하 주사를 사용한 누드 마우스의 광학 이미지. 점선 빨간색 원은 주입 위치를 나타냅니다. 오른쪽:808nm 레이저(1 W/cm ² ) 조사 6분 후 누드 마우스의 NIR 열화상 이미지 ). 최대 가열은 주입 부위에 해당합니다. ㄷ 주사 부위와 808nm 레이저(1W/cm ² 조사)를 조사한 쥐의 피부 표면 온도 변화 ) 6분 동안

PAI 시스템의 실험적 설정

다양한 농도에서 FePt@PPy NP의 PA 반응에 대한 평가:a 팬텀 및 b 해당 PA 이미지

순수한 FePt, PPy 및 FePt@PPy NP의 UV-Vis-NIR 흡수 스펙트럼이 그림 3에 나와 있습니다. NIR 영역에서 강한 흡수가 복합 나노입자에 대해 관찰되었습니다. FePt와 PPy의 흡수 스펙트럼은 함께 FePt@PPy NP의 흡수 스펙트럼에 기여할 수 있습니다. 다양한 농도(20~120μg/mL)의 FePt@PPy NP 수성 분산액의 광학 특성도 UV-Vis-NIR 분광법으로 기록했습니다. 그림 4a에 표시된 대로 FePt@PPy NP 농도가 증가함에 따라 전체 UV-Vis-NIR 영역의 광흡수 강도가 증가했습니다.

FePt@PPy NP의 광열 성능

순수한 FePt 및 FePt@PPy NP의 광열 거동은 그림 4에서 비교되었습니다. FePt 양이 고정된 순수한 FePt 및 FePt@PPy NP는 1W/cm의 출력 밀도에서 808nm 레이저로 조사되었습니다. 2 . FePt@PPy NP는 순수한 FePt NP와 비교하여 우수한 광열 거동을 보였다. 이 데이터는 PPy 층이 전체 시스템의 광열 효율을 향상시켰음을 나타냅니다.

그림과 같이 5a, 동일한 NIR 레이저 조건(5분, 1W/cm ² ), 20μg/ml FePt@PPy NP를 포함하는 용액의 온도는 25°C에서 39.3°C로 증가한 반면 120μg/ml FePt@PPy NP를 포함하는 용액의 온도는 빠르게 71°C에 도달했습니다. 또한 열화상 이미지(그림 5c)는 808nm 레이저로 조사된 FePt@PPy NP를 포함하는 샘플의 광열 유효 변환을 나타냅니다. FePt@PPy NP(50μg/mL)는 0.5, 1.0 및 1.5W/cm ² 의 서로 다른 레이저 출력 밀도에서 NIR 레이저 조사에 노출되었습니다. 6분 동안 유지하고 결과 온도는 각각 41.1, 51.3, 59.4°C였습니다. 이러한 실험 결과는 노출 시간, 나노 입자의 농도 및 레이저 출력 강도가 FePt@PPy NP의 광열 성능에 큰 영향을 미치는 중요한 매개변수임을 보여주었습니다.

FePt@PPy NP의 광열 안정성 테스트

강력한 광열 변환 외에도 나노 입자의 광안정성은 PTT에서 중요합니다. 50μg/mL의 FePt@PPy NP 용액에 1.0W/cm ² 의 808nm NIR 레이저를 조사했습니다. 용액이 최고 온도에 도달할 때까지 레이저를 끄고 실온으로 자연 냉각합니다. 6회의 가열 및 냉각 주기 후에 FePt@PPy NP의 열 곡선은 각 주기에 대해 거의 동일하게 유지되었습니다(그림 4d). 레이저 노출 전후의 UV-Vis-NIR 스펙트럼은 그림 6c에 나와 있습니다. 전체 스펙트럼에서 큰 변화가 관찰되지 않았습니다. 위의 결과는 NIR 레이저 조사의 장기간에 대한 FePt@PPy NP의 우수한 광열 안정성을 나타냅니다.

장기 보관 테스트

제조된 나노입자의 입자 크기 및 UV-Vis-NIR 흡수 스펙트럼을 보관 30일 동안 모니터링했습니다. 첫째, FePt@PPy NP를 포함하는 모든 솔루션에서 응집이 관찰되지 않았습니다(추가 파일 1:그림 S3a). 둘째, 120μg/mL 농도의 세포 배양 배지에서 FePt@PPy NP는 보관 30일 후 UV-Vis-NIR 스펙트럼(추가 파일 1:그림 S3b)에서 유의한 변화를 나타내지 않았습니다. 또한 FePt@PPy NPs의 평균 입자 크기는 장기 보관 기간 동안 거의 변하지 않은 상태로 유지되었습니다(추가 파일 1:그림 S3c). 위의 모든 결과는 제조된 나노 입자의 안정성을 분명히 입증했습니다.

체외 세포 세포독성 분석

암 치료를 위해서는 나노 입자가 우수한 생체 적합성을 가져야 합니다. 그림 7과 같이 MDA-MB-231 유방암 세포를 다른 농도의 순수한 FePt 및 FePt@PPy NP로 처리하고 48시간 동안 배양했습니다. FePt@PPy NPs의 유의미한 세포독성은 가장 높은 시험 농도(120μg/mL)에서도 관찰되지 않았으며, MDA-MB-231 유방암 세포의 세포 생존율은 여전히 ​​95% 이상이었습니다. 순수한 FePt 나노입자에 대해 120μg/mL 조사된 나노입자는 20% 암세포를 죽였습니다. 이 결과는 PPy 층의 코팅이 FePt 나노입자의 생체적합성을 향상시켰으며 FePt@PPy 나노입자는 무독성 물질로 간주될 수 있음을 나타냅니다.

세포 흡수

FePt@PPy 나노입자의 세포 흡수를 감지하기 위해 산성 용액에서 철과 페로시안화칼륨의 반응을 기반으로 하는 프러시안 블루 염색을 수행했습니다. 추가 파일 1:그림 S2에서 볼 수 있듯이 대부분의 세포가 세포 내부에 파란색 얼룩으로 염색되어 FePt@PPy NP의 세포 흡수를 나타냅니다.

체외 광열 요법

MDA-MB-231 유방암 세포의 사멸 능력에 대한 조사된 FePt@PPy NP의 효능을 평가하기 위해 표준 MTT 분석을 수행하였다. 먼저 암세포를 다른 농도의 FePt@PPy NP와 함께 24시간 동안 배양한 다음 1W/cm ² 의 808nm 레이저에 노출시켰습니다. 4분 동안 도 8에 나타난 바와 같이, 처리된 나노입자의 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 점차 감소하였다. 약 50%의 세포가 100μg/mL 농도의 조사된 FePt@PPy NP에서 사망했습니다. 더 많은 암세포를 죽이기 위해 조사 시간을 최대 6분으로 늘렸습니다. 100μg/mL 농도에서 죽은 세포의 약 70%가 관찰되었습니다. A comparison of the photothermal therapy performance between the proposed system and some reported nanoparticles was conducted in Additional file 1:Table S1. It is found that the proposed system shows comparable capability in killing cancer cells (i.e., 70% cell death) with quite low nanoparticle concentration (i.e., 100 μg/mL) under relatively weak power density condition (i.e., 1 W/cm ² ) and short irradiation time (i.e., 6 min).

In addition, by using the fluorescence imaging technique of five groups, we conducted experiments on the cancer cells to consider the killing capability of the prepared nanoparticles:the control groups (only cells), the laser-only group (cells were exposed to the 808-nm laser), the 50-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), the 70-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), and the 100-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser).

Double staining of Hoechst 33342 and PI was used to explore the damaged and dead cells. Hoechst 33342 is a DNA dye, which can be permeable in both dead and viable cells [20]. The changes in the size and shape of nuclei of the Hoechst 33342 stained cells can be observed under fluorescence microscopy. With the apoptosis cells, Hoechst 33342 will make the condensed chromatin brighter than that in a normal cell. PI dye also binds to DNA, but it only permeates through the membrane of damaged and dead cells [21]. Thus, double staining can differentiate between dead cells and live cells by each treatment method.

As shown in Fig. 9, the cancer cells exposed to the NIR laser in the presence of the FePt@PPy NPs emit strong fluorescence, whereas the slight fluorescence is emitted by cancer cells in the absence of the nanoparticles. Only a few dead cells with the red nuclei were observed in the control and laser-only group (Fig. 9a, b). In contrast, many cells in the FePt@PPy NPs + 808-nm laser groups died and displayed red nuclei, as observed in Fig. 9c–e. After incubation for 24 h, some dead cells lost the binding ability and were washed out of the cell disk. Therefore, the intensity of cancer cells in the 100-μg/mL of FePt@PPy NPs + 808-nm laser group was less than the others. Conclusively, almost cancer cells which were treated with 100-μg/mL of FePt@PPy NPs was destructed after being exposed to the 808-nm NIR laser at a power density of 1.0 W/cm ² .

In Vivo Laser Heating Experiment

The potential ability of FePt@PPy NPs for laser-induced heating was finally tested in an animal model. The nude mouse was subcutaneously injected with 100 μL of an aqueous FePt@PPy (100 μg/mL) NPs in PBS. Figure 10a presents the optical and NIR thermographic images of the nude mouse before injection, pointing out the temperature of mouse surface’s skin is about 36 °C. Fig. 10b (left side) shows an optical image of the mouse in which the injection site is indicated by a dashed red circle. The injected area was irradiated with the 808-nm laser at 1 W/cm ² for 6 min, and the NIR thermographic image of this mouse is shown in Fig. 10b (right side). The temperature of the skin’s surface was continuously monitored with an NIR thermographic camera. The time evolution of the surface temperature during the 6 min irradiation is shown in Fig. 10c, figuring out a temperature increment of the skin about 19 °C. From that, we can see clearly that the injected FePt@PPy NP area with laser irradiation produced a high temperature, as required for tumor ablation. Moreover, the heating area was found to be well localized at the injection site as shown in the NIR thermographic image (Fig. 10b, right side). Conclusively, with the excellent laser-induced heating properties, FePt@PPy could be a novel promising agent for photothermal therapy.

In Vitro Photoacoustic Imaging

The top-view image of the phantom filled with pretreated cancer cells is shown in Fig. 12a. The corresponding PAI acquired at the 808-nm laser from the sample in Fig. 12a is illustrated in Fig. 12b.

PAI is an emerging imaging modality and can be used to assist phototherapy [22]. All the samples containing pretreated cells were clearly visible, whereas the controlled samples with 4% gelatin did not produce any PA signal. The magnitude of the PA signal was increased when the concentration of nanoparticles increased. The ability to image FePt@PPy NPs inside phantom with the PAI system is very promising for image-guided photo-induced cancer therapy. The laser system for PAI, which was used in conjunction with FePt@PPy NPs, also showed the potential for future implementations.