세륨 산화물 나노 입자는 우수한 항산화 성능으로 인해 최근 생물 의학 응용 분야에서 많은 관심을 받고 있습니다. 이 연구에서는 전구체로 황소 혈청 알부민(BSA)의 생체 광물화를 사용하여 세륨 도핑된 탄소질 나노 입자(Ce 도핑된 CNP)를 합성하기 위해 간단하고 온화하며 친환경적인 접근 방식을 개발했습니다. 생성된 Ce 도핑된 CNP는 평균 크기가 14.7nm인 균일하고 초소형 형태를 나타냈습니다. XPS 및 FTIR 결과 Ce가 도핑된 CNP의 표면에 친수성 그룹이 존재하여 물에서 우수한 분산성을 나타냈다. CCK-8 분석은 Ce가 도핑된 CNP가 유리한 생체 적합성과 무시할만한 세포 독성을 가지고 있음을 보여주었습니다. H2 사용 O2 -유도된 활성 산소 종(ROS)을 모델로 하여 Ce가 도핑된 CNP는 높은 하이드록실 라디칼 소거 능력을 보여주었습니다. 또한, 유세포 분석 및 생사 염색 결과는 Ce가 도핑된 CNP가 H2로부터 세포를 보호한다는 것을 보여주었습니다. O2 - 항산화 성능에 대한 직접적인 증거를 제공하는 용량 의존적 효과로 유발된 손상. 이러한 발견은 새로운 ROS 제거제로서 Ce가 도핑된 CNP가 산화 스트레스와 관련된 질병 치료에 잠재적인 치료 전망을 제공할 수 있음을 시사합니다.
<섹션 데이터-제목="배경">지속적이고 조절되지 않는 염증은 수많은 병리학적 과정의 일반적인 단계로 간주됩니다[1]. 산화 스트레스는 항산화 효소의 제거보다 ROS가 훨씬 더 많이 발현되는 많은 임상 질병에서 발견되었으며[2,3,4], 최종적으로 산화 및 항산화 성능 간의 불균형으로 정의됩니다. 반응성이 높은 ROS는 자유 라디칼을 생성하는 경향이 있습니다(초산화물 포함(O2 - ), HO2ˋ 및 하이드록실(ˋ OH))는 단백질 및 핵산과 같은 유기체의 거대 분자에 손상을 일으키는 반면, ROS의 과잉 생산은 지속적인 산화 손상에 중요한 차이를 만들어 염증성 침윤과 같은 세포 구조 및 기능의 상당한 파괴를 초래합니다[5,6 ,7], 세포막과 DNA의 손상 [8, 9], 심지어 세포 사멸을 증가시킵니다. 따라서 산화 스트레스는 대혈관 질환[10,11,12], 암 및 기타 신경계 질환[13]의 발병에 중요한 역할을 합니다. 따라서 살아있는 유기체의 활성산소 활성산소의 농도를 조절하고 적절한 범위로 유지하는 것이 중요하고 시급한 문제이며, 이는 일련의 산화적 이상을 줄이는 기본이기도 합니다.
최근에는 산화세륨 나노입자(CeO2 NPs)는 에너지, 촉매 및 생물 의학 분야에서 광범위하게 적용되는 독특한 산화 환원 특성으로 인해 큰 주목을 받았습니다[14,15,16]. 특히 CEO2 나노 입자는 생물 의학 응용 분야에서 ROS 관련 질병을 치료하기 위한 이상적인 항산화제로서 엄청난 잠재력을 보여주었습니다[17, 18]. 세리아 나노입자의 항산화 활성은 슈퍼옥사이드(•O 2- ) 및 하이드록실 라디칼(•OH)을 제거하고 효소로서의 항산화 효과를 지속적으로 유지합니다[19]. CEO2가 나노 입자는 일반적으로 형석 유형의 결정 구조를 가지며 세륨 이온은 3가(3+)와 4가(4+) 사이의 가역 변환 능력을 가지고 있습니다[20]. Ce 3+ 의 스위치 Ce 4+ 까지 산화 상태는 O2를 제거할 수 있습니다. - SOD(Superoxide dismutase)-모방체를 통해, 그리고 •OH는 산화환원 반응을 통해 반면 Ce 4+ Ce 3+ 까지 스위치 제거 H2 O2 카탈라아제(CAT) 모방체를 통해 [21]. 그러나 CeO2의 물리화학적 성질은 NP는 생체 분포, 약동학, 독성, 용해 및 제거를 포함한 생물학적 행동에 영향을 미칠 수 있습니다[22]. Ce가 도핑된 CNP의 표면적 화학에 대해 잘 확립되어 있다는 가설을 감안할 때 Ce가 도핑된 CNP를 치료적 접근으로 생물학적 활용에 대해서는 여전히 광범위하게 탐구해야 합니다[23, 24].
이 연구는 단순하고 친환경적인 합성 경로를 사용하여 생체 적합성이 우수한 새로운 세륨 기반 나노 입자(Ce-도핑된 CNP로 명명됨)의 개발에 집중하고 생물 의학 응용을 위한 항산화제로서의 가능성을 더 탐구합니다. 일련의 방법을 사용하여 Ce가 도핑된 CNP의 물리적 및 화학적 특성을 특성화했습니다. 좋은 성능에 고무되어 우리는 준비된 Ce가 도핑된 CNP의 생체 적합성을 추가로 확인하고 H2를 사용하여 활성 산소를 제거하는 항산화제 시약으로 사용했습니다. O2 유도 모델. 마지막으로, Ce가 도핑된 CNP의 항산화 메커니즘은 살아있는 형광 염색 및 유세포 분석을 사용하여 세포 사멸 경로에서 밝혀졌습니다. 이 연구는 병리학적 조건에서 산화 스트레스 손상을 완화하는 새롭고 효율적인 ROS 제거제를 제공할 것입니다.
황소 혈청 알부민(BSA), 플루오레세인 다이아세테이트(FDA) 및 요오드화 프로피듐(PI)은 Sigma(미국 뉴욕주 뉴욕)에서 구입했습니다. 태아 소 혈청(FBS) 및 Dulbecco의 최소 필수 배지(DMEM)는 Invitrogen China Limited(중화인민공화국 상하이)에서 조달했습니다. Ce (NO3 )3 ·6H2 O, 메틸 바이올렛(MV) 및 황산제일철 7수화물(FeSO4 . 7H2 O)는 Aladdin Reagent Corporation(중화인민공화국 상하이)에서 구입했으며 과산화수소(30%)는 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.(중화인민공화국 베이징)에서 구입했습니다. 모든 화학 물질은 분석 시약으로 추가 정제 없이 사용되었습니다. 실험에는 탈이온수를 사용했습니다.
Ce 도핑된 CNP는 문서 [24]에 설명된 대로 앨범 기반 바이오 광물화 방법을 약간 수정하여 제조했습니다. 합성 과정은 다음과 같습니다. 1.25g의 BSA를 50.0mL의 탈이온수에 용해하고 지속적으로 교반하여 투명한 용액을 형성합니다. 그런 다음 금속 전구체 300mM Ce(NO3 )3 ·6H2 격렬한 교반 하에 O를 각각 천천히 첨가하였다. 동시에 2.0M NaOH를 50mL 탈이온수에 용해시켜 혼합물의 pH 값을 조정하는 데 사용했습니다. NaOH를 포함한 용액은 천천히 첨가해야 하는 점에 주의할 필요가 있다. Ce 도핑된 CNP는 55°C의 PH 12에서 강력하게 교반한 후에 형성될 수 있습니다. Ce가 도핑된 CNP의 형성을 위한 충분한 반응 시간은 약 8시간이었습니다. 시스템은 자연적으로 실온으로 냉각되는 갈색의 화합물이었습니다. 추가 현탁액을 0.22μm 멤브레인(폴리에테르 설폰)으로 여과하여 이러한 대규모 덩어리를 고갈시켰다. 전자의 용액은 최종적으로 14kDa 분자량 컷오프가 있는 투석 백에서 3일 동안 물에 대해 투석되었습니다. 회수한 투석액을 진공동결건조기를 이용하여 동결건조하였다. Ce 도핑된 CNP 분말은 궁극적으로 얻어지고 추가 특성화를 위해 저장되었습니다.
Ce-도핑된 CNP의 형태는 200kV의 가속 전압에서 JEM-2100 현미경(JEOL, Tokyo, Japan)에서 투과 전자 현미경(TEM)으로 조사되었습니다. 크기 분포는 ImagingJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)에 의해 연구되었습니다. Ce-도핑된 CNP의 화학 구조는 푸리에 변환 적외선(FT-IR) 분광계(Nicolet Nexus 470, GMI 및 Ramsey, MN, USA)를 사용하여 분석되었습니다. 원소 조성은 X선 광전자 분광법(XPS)을 통해 원소 분석을 수행하여 결정하였다. X선 회절(XRD) 분석은 40kV 및 100mA에서 작동되는 Rigaku D/MAX-2000 회절계(일본)에서 수행되었으며, 슬릿은 0.5°이고 스캔 속도는 7° min -1 , Cu Kα 방사선 소스 장착(λ =0.15418 nm). UV-Vis 흡광도 스펙트럼은 UV-2550 UV-Vis Spectrophotometer(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 기록되었습니다.
Ce-도핑된 CNP 항산화 성능과 자유 라디칼 소거 활성은 UV-vis 광도 측정 실험에 의해 평가되었습니다. MV 용액은 3.0× 10 −4 농도의 탈이온수에서 준비했습니다. M. 및 0.15mM FeSO4 . 7H2 O는 대안으로 용해되었다. Ce가 도핑된 CNP의 현탁 용액은 pH 5.0에서 0.1M Tris-HCl 완충액에 분산시켜 10μM 농도에서 사용하도록 예약했습니다. 적절하게 초음파 처리는 Ce 도핑된 CNP의 용해도를 향상시킬 수 있습니다. 측광용 반응 솔루션은 3.0 × 10 −5 을 수용했습니다. M MV, 0.15mM FeSO4 . 7H2 O, 1.0M H2 O2 , 0.1M Tris-HCl 완충액(pH 5.0) 및 0.17mM Ce-도핑된 CNP를 사용하여 필요한 부피 10mL에 도달합니다(MV/FeSO4의 혼합 용액). . 7H2 O/H2 O2 /CeO2 ) 최종적으로. 반응 용액의 흡광도는 상온에서 5분간 배양한 후 측정할 수 있습니다.
Ce-도핑된 CNP의 세포 생존율은 절단된 테트라졸륨 고리 및 탈수소효소에 의한 포르마잔 염료 양의 수용성 테트라졸륨 염의 하강을 기반으로 하는 CCK-8 분석법(일본 쿠마모토 Dojindo)에 의해 VSMC 및 7721 세포에서 평가되었습니다. 살아있는 세포에서. 간단히 말해서 VSMC 및 7721 셀(1.5 × 10 4 웰당 세포 수)를 각 그룹에 대해 5회 반복하여 96웰 플레이트에 접종했습니다. 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 부화한 후 세포 밀도가 80% 합류에 도달하면 성장 배지를 다양한 농도(0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400μg/ml)의 Ce-도핑된 CNP 용액을 함유하는 새로운 DMEM으로 교체하고 24시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 PBS로 세포를 세척하고 각 웰에 10μL CCK-8 용액을 첨가했습니다. 다음으로, 96웰 플레이트를 37°C 및 5% CO2에서 추가로 4시간 동안 배양했습니다. 기하급수적인 세포 성장을 허용합니다. 마지막으로 Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader(Bio-Tek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 490nm의 방출 파장에서 각 웰의 흡광도를 감지했습니다. 처리하지 않은 세포(DMEM에서)를 대조군으로 사용하고 Abs 샘플/Abs 대조군 × 100%를 사용하여 상대적 세포 생존율(평균± 평균의 표준 오차)을 계산했습니다.
강력한 산화 활성 산소의 일종으로 과산화수소(H2 O2 )은 세포막을 통과하기 쉽고 세포 내 철 이온과 반응하여 Fenton 이론에 의해 반응성이 높은 자유 라디칼을 형성하여 일련의 변화를 일으킵니다. 동시에 H2에 의해 유도된 다양한 세포 산화 스트레스 O2 apoptosis 과정에 직접적으로 관여한다. 따라서 30% H2 O2 IC50로 사용될 수도 있는 이 연구에서 세포의 세포자멸사를 시뮬레이션하기 위해 선택되었습니다. 산화 손상에 대한 Ce 도핑된 CNP의 보호 효과를 추가로 조사하기 위한 모델입니다. 위의 논의를 기반으로 VSMC 및 7721 세포는 초기에 1.5 × 10 4 밀도로 시딩되었습니다. 세포/웰을 96웰 플레이트에 넣습니다. 세포가 부착된 후 추가 24시간 동안 계속 배양했습니다. 그리고 신선한 준비 30% H2 O2 세포의 성장을 자극하기 위해 다른 농도(50, 100, 200, 400, 800 umol/ml)로 각 웰에 첨가했습니다. 4시간 부화 후 PBS로 세척한 후 10μL CCK-8 용액을 각 웰에 4시간 동안 37°C, 5% CO2에서 첨가했습니다. 인큐베이터. Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader(Bio-Tek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 490nm에서 각 웰의 흡수 값을 결정했습니다. 세포 활성의 백분율은 대조군에 대한 세포 생존율 측정에 의존하는 세포 생존율에 대한 영향의 지표로 간주되었습니다.
같은 방법으로 VSMC와 7721 세포를 96웰 플레이트에 파종하여 배양하였다. 다음날, 세포를 서로 다른 농도의 Ce-도핑된 CNP(0, 12.5, 25, 50, 100, 200 및 400μg/ml)로 약 24시간 동안 전처리하고 새로운 제제 30% H2에 노출시켰다. O2 각 well에 적당한 농도로 반면에 30% H2가 없는 공백 그룹으로 설정해야 합니다. O2 및 Ce-도핑된 CNP 및 대조군은 H2만 사용했습니다. O2 솔루션. 각 그룹은 6개의 평행선으로 설정되었습니다. 4시간 동안 처리한 후 PBS로 세척한 후 CCK-8 분석을 사용하여 위에서 설명한 대로 490nm의 광학 밀도에서 각 웰의 세포 사멸 조건을 측정했습니다.
Ce가 도핑된 CNP의 잠재적인 항산화 효과를 평가하기 위해 4.0 × 10 4 의 6웰 플레이트에서 7721개의 세포를 성장시켰습니다. 웰당 100ul 배지에 세포를 넣고 24시간 동안 발달되도록 둡니다. 그런 다음 6개 그룹을 동시 대비로 설정했습니다. 여기에는 컨트롤, H2가 포함되었습니다. O2 그룹, 50μg/mL Ce-도핑된 CNP + H2 O2 , 100μg/mL Ce 도핑된 CNP + H2 O2 , 200μg/mL Ce 도핑된 CNP + H2 O2 및 400μg/mL Ce-도핑된 CNP + H2 O2 . 각 그룹에서 세포가 80%까지 성장하는 동안 첫 번째 그룹은 H2가 없는 정상적인 성장 조건에 노출되었습니다. O2 및 Ce-도핑된 CNP; 두 번째 그룹은 선택한 H2와 함께 배양되었습니다. O2 4시간 동안 Ce-도핑된 CNP 없이, 즉 치료 없음; 세 번째 그룹에서 여섯 번째 그룹은 서로 다른 농도의 Ce 도핑된 CNP(50, 100, 200 및 400μg/mL)를 포함하고 H2를 표시했습니다. O2 각각 4시간 동안 배양합니다. 그 후, FDA와 PI working buffer를 세포 염색에 사용하였다(Calcein AM/Ethidium Homodimer, Invitrogen). 형광 현미경으로 염색된 세포의 형광을 관찰했습니다. 살아있는 세포는 녹색, 죽은 세포는 붉은 색을 나타냅니다.
또한 Annexin V-FITC/propidium iodide(PI) Apoptosis 키트를 사용하여 이중 형광 염색에 의한 세포의 세포 사멸 속도를 정량화했습니다. 간단히 말해서, 7721 세포가 7721 세포 부착 성장이 될 때까지 24시간 동안 위의 단계에 따라 6-웰 배양 플레이트에서 사전 배양되었습니다. 그 후, 처리 방법이 다른 세포를 수확하고 각 그룹에서 4°C에서 PBS로 3회 세척했습니다. 세포가 부드럽게 소화되고, 수집되고, 원심분리된 다음 5분 동안 2000rpm이 되어야 함을 알았습니다. 그 후, 세포를 500μl 결합 완충액으로 재현탁하고 1× 10 6 의 농도로 조정했습니다. 세포/ml. 그런 다음, 세포 현탁액을 각각 5μl의 Annexin V-FITC와 5μl의 20μg/ml PI 용액으로 염색한 유동관에 넣었습니다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양하기 전에 500μl PBS를 반응 튜브에 추가해야 합니다. 마침내 Beckman Coulter Epics XL MCL 유세포 분석기 시스템(BD Accuri C6)에서 Annexin-V 방법을 사용하여 실험 결과를 검출했으며, 소프트웨어 분석(Flowjo 7.6.2)을 통해 세포 사멸 세포의 비율을 명확히 했습니다.
모든 실험 데이터는 평균 ± 평균의 표준오차로 표현하였다. 다른 그룹의 비교를 위해 ANOVA의 통계적 기법과 사후 최소 유의차(LSD) 테스트를 적용하여 얻은 데이터를 분석했습니다. 피 0.05 미만의 값(P <0.05)는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
이 연구에서 Ce가 도핑된 CNP의 수분산액은 Ce(NO3 )3 . 6H2 O 및 BSA를 생체 광물화에서 영감을 받은 합성 방법에 의한 전구체로 사용합니다. 제조 과정에서 주요 탄소원 물질로 사용되는 BSA는 독특한 공간 구조와 분자 사슬 유연성으로 인해 금속 이온을 금속 나노 입자에 통합할 수 있습니다. 즉, 제조된 금속이 도핑된 나노입자는 탄소질 골격과 금속이 담지된 원소로 주로 구성되어 있어 기존의 무기세륨 나노입자와 다를 수 있다[25]. 형태학적 검사는 투과전자현미경(TEM)에 의해 특성화되었고 결과 입자 크기는 ImagingJ 소프트웨어로 분석되었습니다. 그림 1a는 생성된 Ce 도핑된 CNP의 특징적인 TEM 이미지를 보여줍니다. 이는 Ce-도핑된 CNP가 명백한 응집 없이 다각형 구조, 균일한 분산 및 불연속적인 모양을 가지고 있음을 반영합니다. 통계 분석에 따르면 Ce 도핑된 CNP는 평균 직경이 14.7 ± 0.8nm인 좁은 크기 분포를 나타냈으며(그림 1b), 이는 TEM 이미지와 일치했습니다. Ce-도핑된 CNP가 며칠 동안 물에 있을 때 침전이 없었고 여전히 균질한 용액의 진술을 유지하여 수용액에서 장기간 안정성을 나타내는 것을 알 수 있으며, 이는 다음 생의학 응용에 도움이 될 수 있습니다. .
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아 Ce 도핑된 CNP에 대한 TEM 이미지. 삽입된 이미지는 고해상도 TEM 이미지를 보여줍니다. ㄴ Ce 도핑된 CNP의 직경 분포
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Ce 도핑된 CNP 설계의 개략도
X선 광전자 분광법(XPS) 패턴과 푸리에 변환 적외선(FT-IR) 스펙트럼을 사용하여 Ce가 도핑된 CNP의 표면 작용기 및 조성을 조사했습니다. XPS는 샘플 표면의 세륨 이온의 산화 상태를 특성화하는 데 사용되었습니다. 조사 XPS 스펙트럼(그림 2a)은 902.0, 285.0, 531.8eV에서 세 개의 주요 피크를 보여주었으며, 이는 Ce가 도핑된 CNP의 세륨, 탄소 및 산소 원소의 존재를 나타냅니다. 164.0eV에서 유황(S 2p) 신호는 BSA가 Ce-도핑된 CNP에 성공적으로 접합되었음을 시사했습니다. Ce가 도핑된 CNP 촉매에서 Ce(III)과 Ce(IV)의 공존은 그림 2b의 스펙트럼에 의해 입증될 수 있습니다. Ce3d의 고해상도 스펙트럼(그림 2b)은 Ce3d3로 분할될 수 있습니다. 및 Ce3d5 (32 eV의 스핀-궤도 분할로 인한 결과)는 각각 882.0, 884.0 및 902.0 eV에 위치한 인덱싱된 피크와 강한 피크의 존재를 나타냈습니다. Ce3d 신호는 주로 O2 , 3d5/2 및 3d3/2 , 875와 895 eV 사이의 피크는 Ce3d3/2에 속함 이는 이전에 발표된 스펙트럼과 거의 일치하는 수준입니다[26]. 또한 XPS 스펙트럼은 Ce3d의 15.99%를 의미하기도 합니다. 이러한 관찰은 CeO2에 대한 문헌의 결과와 일치합니다. 나노 입자 [25]. 그림 2c와 같은 C1s 스펙트럼은 각각 CeO2 나노 입자는 C의 1s, C=O, CF 및 COOR 에너지 수준으로 기능화되었습니다. 그림 2d에 표시된 대로 O1s 스펙트럼의 존재는 530.5 및 531.8eV에서 두 개의 주요 피크에 의해 지배되었으며, 이는 O2 사이의 결합 - 및 Ce 3+ .
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아 Ce가 도핑된 CNP의 XPS 스펙트럼. 조사 스펙트럼. ㄴ Ce3d 스펙트럼. ㄷ C1s 스펙트럼. d O1 스펙트럼
반응 과정에서 Ce가 도핑된 CNP의 형성을 확인하기 위해 FTIR 분석을 추가로 수행하였다. 그림 3A와 같이 Ce가 도핑된 CNP의 경우 3400cm -1 에서 강렬하고 넓은 피크가 나타났습니다. , 이는 OH의 신축진동에 의해 발생하며 흡수된 물의 굽힘진동에 할당될 수 있다. 1510cm −1 의 특징적인 피크 –O–C–O 비대칭 스트레치로 설명할 수 있지만 1450cm −1 에서 피크 -O-C-O의 대칭 신축 진동에 할당될 수 있으며, 둘 다 질산염 그룹의 존재를 보여줍니다. 또한 451cm −1 의 흡수 밴드 Ce-O 비대칭 스트레치에 할당되었으며, 이는 Ce 도핑된 CNP의 형성을 나타냅니다. 이러한 결과는 Ce가 도핑된 CNP의 작용기가 주로 특정 -OH 및 -COO - 를 함유함을 보여주었다. 그룹.
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BSA 및 Ce 도핑된 CNP의 FTIR 스펙트럼. B Ce-도핑된 CNP의 XRD 패턴. C Ce가 도핑된 CNP의 UV-Vis 흡수 스펙트럼. D 다양한 처리 후 메틸 바이올렛(MV)의 UV-Vis 흡수 스펙트럼. 아 뮤직비디오, b H2로 처리된 MV O2 및 Ce 도핑된 CNP, c FeSO4로 처리된 MV 및 H2 O2 , 및 d FeSO4로 처리된 MV , H2 O2 , 및 5분의 배양 시간에서 Ce 도핑된 CNP 용액
X선 회절(XRD) 분석에 따라 Ce가 도핑된 CNP의 결정 구조를 조사하였다. 그림 3B에 표시된 것처럼 24.4°, 30.3°, 35.23° 및 43.2°에 4개의 주요 회절 피크가 있습니다. 24.4°에서 이러한 피크 중 하나는 생성된 무기 탄소질 구조에 기인할 수 있으며, 이는 보고된 탄소 양자점 및 흑연 특성 피크와 유사합니다[27,28,29]. 흑연의 정렬된 결정 구조와 비교(002면, 2θ =26.5°), 낮은 이동과 함께 약 24.4°의 Ce 도핑된 CNP의 회절 피크는 약해지며, 이는 고도로 무질서한 탄소와 sp 2 의 증가에 기인할 수 있습니다. (C–C) 탄화 과정에서 층 간격 [30]. 30.3°, 35.23° 및 47.42° 각도에서 회절 피크는 각각 기존의 세리아 나노 입자의 (111), (200) 및 (220) 평면과 대부분 일치했습니다. 또한, 56.30°, 69.00°, 75.57° 및 78.99°의 다른 피크는 참조된 산화세륨의 (311), (400), (331) 및 (402)에 해당합니다(JCPDS 2004 36-1253). 상응하는 간격 \( \left(\mathrm{Fm}3\overline{\mathrm{m}}\right) \)은 브래그 법칙(Cu-Kα 법칙의 파장은 0.154 nm임)에 따라 계산되었습니다. 이러한 결과는 하이브리드 결정 구조를 갖는 Ce가 도핑된 CNP를 예비적으로 확인할 수 있었다.
Fe 2+ 교대로 과산화수소(H2 O2 ) Fenton 반응[31]에 따라 다른 반응성 하이드록실 라디칼로. 발색 시약으로 메틸 바이올렛 용액은 주로 보라색을 나타냅니다. -C=C-를 목표로 하는 하이드록실 라디칼은 메틸 바이올렛과 반응하여 MV를 무색이라도 얕은 색으로 만들 수 있으며 582nm에서 최대 UV-Vis 흡광도가 감소합니다[32]. 우리의 설계에 따르면 Ce가 도핑된 CNP는 히드록실 라디칼을 확실히 제거할 수 있으며, 최종적으로 582nm에서 MV의 흡광도를 증가시킬 수 있습니다.
Ce 도핑된 CNP에 대한 기본 자유 라디칼 소거 능력을 확인하기 위해 MV의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 사용하여 몇 가지 통찰력을 제공했습니다. 그림 3C에서 Ce가 도핑된 CNPs 수용액에서 500~700nm에서 유의미한 흡광도는 없었습니다. 그러나 약 582nm에서 methyl violet의 최대 흡광도를 관찰할 수 있었고 H2에서 흡광도가 억제되었습니다. O2 치료(그림 3D). Ce가 도핑된 CNP를 혼합 용액에 첨가하면 흡광도가 분명히 회복되어 Ce가 도핑된 CNP가 이 실험 조건에서 하이드록실 라디칼을 제거하고 MV를 공격으로부터 보호하는 능력이 있음을 입증했습니다. 이러한 결과는 자유 라디칼에 의해 유발되는 질병을 치료하는 데 더 많은 생물의학적 응용을 가질 것입니다.
합성된 Ce가 도핑된 CNP를 산화 스트레스와 관련된 질병 치료에 적용하기 전에 생체 적합성을 평가하는 것이 필수적입니다. 이 연구에서 세포 생존율에 대한 Ce-도핑된 CNP의 효과는 CCK-8 분석의 세포 생존력 테스트를 사용하여 VSMC 및 Ce-도핑된 CNP와 함께 7721 세포의 인큐베이션을 통해 평가되었습니다. 세포 생존율은 24시간 노출 시간 동안 다양한 농도의 Ce-doped CNP 처리 후에도 유의한 변화를 나타내지 않았음을 알 수 있습니다(그림 4a). 400μg/ml의 최고 용량에서도 모든 처리군의 세포 생존율은 약 90%였으며, 이는 Ce가 도핑된 CNP가 세포에 대해 매우 약한 세포독성을 가짐을 보여줍니다. 이러한 발견은 Ce가 도핑된 CNP의 유리한 세포 적합성을 강조하고 생물의학 응용에 적합하도록 했습니다.
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아 다양한 농도의 Ce-도핑된 CNP가 CCK-8에 의한 VSMC 및 7721 세포의 세포 생존력에 미치는 영향. 세포를 24시간 동안 서로 다른 농도로 Ce-도핑된 CNP로 사전 처리한 다음 H2로 투여했습니다. O2 다른 복용량에서. ㄴ VSMC 및 c의 세포 생존율 560μM H2에서 다양한 농도의 Ce 도핑된 CNP로 배양된 7721 세포 O2 -CCK-8 분석에 의한 산화 스트레스 유발
세륨 산화물 나노 물질의 모방 효소의 특성은 잠재적인 치료 응용에 도움이 됩니다. 용액에 Ce가 도핑된 CNP가 VSMC 및 7721 세포를 자유 라디칼로부터 충분히 보호할 수 있는지 여부를 조사했습니다. 이러한 연구의 경우 H2 O2 활성 산소 종(ROS) 생성을 유도하는 데 사용되어 세포 손상이나 사멸을 초래합니다. 첫째, IC50 세포 생존율의 값은 Ce-도핑된 CNP의 보호 효과를 조사하기 위해 결정되었습니다. VSMC 및 7721 세포 생존율은 H2 첨가 후 낮은 값을 나타냄 O2 . VSMC 및 7721 세포에 대한 증가된 세포자멸사 활성의 경향은 H2가 증가함에 따라 관찰되었습니다. O2 용액의 농도(그림 4b). 즉, ROS의 상승은 용량 의존적이었고, 이는 중앙 치사 용량(LD50 ) VSMC 및 7721 세포의 농도는 각각 약 549 및 556 umol/ml였습니다. 결과적으로 LD50 H2 O2 산화 스트레스를 통한 560μM은 문헌[33]의 결과에 가까웠습니다.
다음으로 LD50 미만의 Ce 도핑된 CNP의 항산화 효과 H2의 O2 세포 계수 키트-6(CCK-8) 분석을 사용하여 테스트했습니다. 고유한 전자 특성으로 인해 Ce가 도핑된 CNP는 이중 산화 상태(Ce 3+ 및 Ce 4+ ) 산화 환원 거동을 통해 항산화 활성을 부여합니다. ROS가 있는 경우 Ce 4+ Ce 3+ 로 계속 전환 가능 지속적인 자유 라디칼 소거 활동과 함께 [34, 35]. 그림 4c에서 볼 수 있듯이, 이러한 결과는 VSMC와 7721 세포 모두의 세포 생존율이 동일한 산화 스트레스 하에서 Ce가 도핑된 CNP 농도의 증가에 따라 점진적으로 향상되었음을 의미합니다. 특히 Ce가 도핑된 CNP 농도 400μg/ml에서 세포 생존율이 약 88.0% 회복되었다. 결과적으로 Ce가 도핑된 CNP는 효율적인 자유 라디칼 소거 능력을 통해 용량 의존적으로 뛰어난 항산화 효과를 나타냈습니다.
Ce가 도핑된 CNP의 세포 항산화 효과를 추가로 밝히기 위해 생사 염색 및 유세포 분석법이 사용되었습니다. 그림 5와 같이 단일 Ce가 도핑된 CNP로 처리된 7721 세포에서는 적색이 없는 강한 녹색 형광이 관찰되었지만 H2에서는 적색 형광이 많이 관찰되었다. O2 H2를 나타내는 556uM의 처리 O2 극적으로 세포 사멸을 유발할 수 있습니다. 하지만 H2 O2 -유도된 세포자멸사는 Ce가 도핑된 CNP 농도의 증가와 함께 점진적으로 완화되었다. 특히 H2에서 400μg/ml의 Ce가 도핑된 CNP 처리 후 소량의 적색 형광만 볼 수 있었습니다. O2 - 더 높은 세포 생존력을 나타내는 유도된 산화 스트레스. Ce가 도핑된 CNP의 항산화 효과를 조사하기 위해 Flow cytometry assay를 추가로 수행하였다. 이중 가변 유세포 분석의 산점도에서 Annexin-V-FITC 방출 신호는 x -축, PI 방출 신호가 y에 플롯되는 동안 -중심선. 세포의 여러 영역은 다음과 같이 정의되었습니다. Annexin V-/PI–는 살아있는 세포로 간주되고, Annexin V+/PI––는 초기 세포사멸 세포를 나타내며, Annexin V+/PI+–는 후기 세포사멸/괴사 세포를 나타냅니다. 도 6에 나타난 바와 같이 대조군은 1.45%의 작고 정상적인 세포 후기 세포사멸 비율을 나타내었지만 H2 O2 치료는 46.4%의 매우 높은 세포 후기 아폽토시스 비율을 나타냈다. 우리가 예상한 바와 같이, 서로 다른 농도의 Ce가 도핑된 CNP로 처리된 세포 사멸 세포의 비율은 점진적으로 감소하는 경향이 있습니다. H2에서 46.4%의 세포 후기 세포사멸과 비교 O2 50, 100, 200, 400μg/ml의 Ce-doped CNP 처리 후 세포자멸사 비율이 24.2, 20.0, 15.1, 11.2%로 현저히 감소했습니다. live-dead staining과 flow cytometry 결과에 따르면 Ce가 도핑된 CNP는 산화 스트레스에 의해 유발된 apoptosis에 대해 용량 의존적으로 유리한 항산화 효과를 나타냅니다.
<그림>
Fluorescent images of 7721 cells incubated with different concentrations of Ce-doped CNPs under H2 O2 -induced oxidative stress for 24 h by live-dead staining (scale bars = 50 μm)
Flow cytometry profiles of 7721 cells were examined to determine the percentages of early apoptosis and late apoptosis cells with different treatments
In summary, we reported a novel Ce-doped CNPs with the capability of scavenging free radicals. The preparation method is simple by using one-step synthesis in the bio-mineralization manner. Different from the former surface modification (such as PVP), the as-prepared Ce-doped CNPs exhibited the improvement in biocompatibility and dispersibility in aqueous solution. Furthermore, in vitro studies showed albumin-based bio-mineralization Ce-doped CNPs not only own superoxide dismutase feature but also alleviate the oxidative damage caused by H2 O2 , which have a protective effect on cells in this periods of study. Furthermore, the concentration of Ce-doped CNPs plays important roles in the recovery of apoptotic cells. Herein, the novel Ce-doped CNPs have promising biomedical applications in diseases prevention and treatment of oxidative stress-mediated.
나노물질
초록 본 연구에서는 고압증기멸균기에서 아미드화 반응을 통해 아미노 하이퍼브랜치 폴리머(HBP)-그라프트된 폴리아크릴로니트릴(PAN) 섬유를 제조하였다. 준비된 PAN-G-HBP 섬유는 Ag+를 복합화할 수 있습니다. 아미노 HBP의 아미노 그룹을 통해, 그리고 뜨거운 증기 조건에서 Ag+ HBP의 환원성을 통해 Ag0로 전환될 수 있습니다. PAN-G-HBP 및 Ag 나노입자(NPs) 코팅된 섬유는 FTIR, UV-VIS DRS, FE-SEM, EDS, XPS 및 항균 측정을 통해 특성화되었습니다. FTIR 결과 HBP가 PAN
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