기존의 화학 요법 약물의 단일 치료 효율성은 종양의 생리학적 장벽에 의해 불쾌하게 감소합니다. 이러한 점에서 나노입자는 항종양제를 필요한 부위에 전달함으로써 표적 암 치료의 의학적 목적을 달성하는 데 매력적이게 되었다. 새로운 약물 전달체인 폴리(에틸렌 글리콜) 카르복실-폴리(ε-카프로락톤)(PEG-PCCL)는 높은 친수성과 안정한 것으로 보고된 반면, 유기 독성에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 이 연구는 PEG-PCCL의 전신 독성 평가에 초점을 맞추었습니다. PTX-loaded PEG-PCCL(PEG-PCCL/PTX)의 약동학 및 항종양 효과를 예비 조사했습니다. 현재 작업에서 PEG-PCCL은 레이저 입자 크기 분석기와 투과 전자 현미경으로 특성화되었습니다. 세포독성은 MTT 검사, LDH 누출 분석, 면역형광 및 투과전자현미경으로 조사하였다. 용혈, 정맥염 및 장기 독성 테스트를 수행하여 생체 적합성과 급성 생체 독성을 입증했습니다. H22 종양 보유 마우스를 사용하여 PEG-PCCL/PTX 마이셀의 약동학 및 항종양 효과를 평가하였다. 결과는 PEG-PCCL 나노스피어의 크기가 97 ± 2.6 nm임을 보여주었다. PEG-PCCL 처리는 세포독성이 적고 생체적합성이 우수하며 장기독성을 나타내지 않았다. PTX 로딩 효율은 49.98%였다. H22 종양 보유 마우스에 대한 약동학 연구는 PEG-PCCL/PTX가 PTX 단독보다 더 높은 안정성과 더 느린 방출을 갖는 것으로 밝혀졌습니다. 함께, 이러한 결과는 PEG-PCCL 나노구가 유기체에 대한 독성이 거의 없으며 소수성 약물에 대한 생체적합성 약물 매개체의 잠재적 후보임을 시사합니다.
최근 수십 년간 인구 고령화와 함께 암 발병률의 증가 추세가 지속되고 있다[1]. 기존의 항암화학요법은 전체 선량이 종양 부위에 도달하는 양이 적기 때문에 효과가 제한적이었고 나머지는 건강한 조직 전체에 분포하여 특히 호중구감소증과 심근병증에 부정적인 영향을 미쳤습니다[2]. 나노입자는 독특한 물리적 및 화학적 특성으로 인해 화학요법 약물의 전달을 위한 잠재적 플랫폼을 나타냅니다[3]. 그 결과 부작용을 줄이고 치료 효과를 높일 수 있습니다. 공중합체 기반 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)(MePEG)/폴리(ɛ-카프로락톤)(PCL)은 약물 전달 시스템(DDS)에 사용되는 유망한 유기 나노 입자로 간주되며 이미 FDA 승인. 이러한 나노 입자는 생체 적합성, 생분해성 및 열 민감성과 같은 제어가 쉬운 특성을 가지고 있습니다[4]. PCL 나노스피어[5], PEG-PCL-PEG[6,7,8] 및 PCL-PEG-PCL[9] 하이드로겔과 같은 일부 이중 블록 및 삼중 블록 중합체가 생물 의학 응용 분야에서 조사되었습니다. PCL 블록은 소수성 약물을 캡슐화하는 소수성 코어를 구성하는 반면, PEG 블록은 코어-쉘 미셀 나노구조를 만드는 친수성 쉘을 형성합니다. 이러한 이중 블록 및 삼중 블록 고분자는 구조가 안정적이고 혈액 순환이 오래 지속되며 투과 및 체류 효과가 향상되어 수동적 표적화와 같은 특성으로 인해 많은 관심을 받고 있습니다[10]. 그러나 독성, 낮은 약물 탑재량, 원치 않는 약물 누출 및 세망내피 시스템에 의한 제거를 포함하여 유기 고분자에 대한 논란의 여지가 있는 문제가 여전히 존재합니다[11,12,13].
앞서 언급한 고분자와 비교하여 카프로락톤에 카르복실을 추가로 수식한 PEG-PCCL은 이전 연구[14, 15]에서 제조 및 특성화되었으며 수소 결합 효과를 통해 더 높은 친수성과 더 나은 안정성을 보여줍니다. . 물리화학적 특성 결과를 제외하고 고분자 담체의 생체 내 및 시험관 내 독성 연구와 관련된 데이터는 거의 보고되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 예측 모델과 검증된 표준 방법에는 나노입자의 독성 분석과 관련된 일련의 설계 규칙이 필요합니다.
이를 감안할 때, 우리는 생체 내에서 높은 내성과 생분해성의 유리한 속성에도 불구하고 PEG-PCCL의 생체 내 및 시험관 내 급성 독성 평가에 질적 및 양적으로 초점을 맞추었습니다. 생물 의학 연구에서 광범위하게 사용되는 나노 입자인 폴리에테르이미드(PEI)가 양성 대조군으로 선택되었습니다. 파클리탁셀(PTX)은 1차 항암제[16], 특히 난소암 및 비소세포폐암에 최적화된 화학요법제로 세계보건기구의 필수 의약품 목록 필수 의약품 목록에 등재되었습니다. 나> . 나노기술의 발달과 함께 나노입자에 PTX 로딩은 다학제적 협력 치료 상황에서 부위 특이적 약물 전달을 위한 잠재적인 솔루션으로 간주된다[17, 18]. 이 연구에서는 PTX가 로딩된 PEG-PCCL을 사용하여 간 H22 종양 보유 마우스 모델에서 생체 내 약동학 및 항종양 효과를 조사했습니다.
ε-카프로락톤(ε-CL, Alfa Aesar, USA), 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG, Mn =1000, Fluka, USA), 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDI, Aldrich, USA), Palladium sur charbon(pd/c, Sigma , USA), Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM, Hyclone, USA), 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT, Sigma, USA), 소 혈청 알부민(BSA) , BR, BoAo Co. Ltd., China)를 추가 정제 없이 사용하였다. 모든 재료는 분석 시약 등급이었습니다.
수컷 Balb/C 마우스(7~8주령, 20~25g 체중) 및 뉴질랜드 토끼(2.5~3.0kg 체중)를 Chengdu DaShuo biotech Companies(중국 쓰촨성)에서 품질 인증서 번호 SCXK2013–로 구입했습니다. 24. 동물은 충분한 음식과 수돗물이 있는 표준 특정 병원체가 없는 환경에서 유지되었습니다. 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침(중국 과학 기술부, 2006)에 따라 실험을 수행했습니다. 모든 동물 실험 절차는 쓰촨 대학교 중국 서부 의료 센터 실험 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.
마우스 H22 간암종 세포(H22), 인간 배아 신장 세포(HEK293T) 및 간암종 세포(Hep G2)는 중국 서부 기초 의학 및 법의학 학교 면역학과에서 입수했습니다. HEK293T 및 Hep G2는 10% 소태아 혈청(FCS)(Hyclone, UT, USA) 및 항생제(페니실린 100U/mL 및 스트렙토마이신)가 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)(Hyclone, UT, USA)에서 배양되었습니다. 100U/mL), 37°C, 5% CO2.
PEG-PCCL 및 PTX-NP는 우리의 협력자인 중국 전자 과학 기술 대학의 마이크로일렉트로닉스 및 솔리드 스테이트 전자 학교의 Liu 교수가 제공했습니다. PEG-PCCL 이블록 공중합체는 아래 흐름도와 같이 Palladium sur charbon 촉매를 사용하여 PEG 단독 중합체의 존재 하에 ɛ-CL의 개환 중합에 의해 합성되었습니다(그림 1). 얻어진 PEG-PCCL 공중합체를 정제하여 사용할 때까지 밀폐 백에 보관했습니다.
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PEG-PCCL 다이폴리머 합성의 흐름도
PEG-PCCL 나노입자에 PTX를 로딩하기 위해, PEG-PCCL이 제조된 후 독성 유기 용매가 없는 간단하고 유용한 기술인 고체 분산[19]이 수행되었습니다. 그런 다음, 용액을 감압 하에 60°C에서 증발시켰다. 알코올을 증발시킨 후 균질한 공중합체를 얻었다. PTX는 고분자 담체에 의해 무정형 형태로 캡슐화되었습니다. 공증발은 65°C의 물에 용해되어 PTX-NPs 용액을 생성했으며, 이를 0.22nm 필터로 여과하여 깨끗하고 멸균된 용액을 얻었습니다. PTX-NPs 분말은 동결 건조 시스템의 동결 건조 용액에서 얻었습니다. PTX의 포획 효율(EE)은 미니컬럼 원심분리 방법으로 결정되었습니다[20]. PEG-PCCL에 통합된 PTX의 농도(CI ) 또는 PEG-PCCL 분산액의 총 약물(CT )를 HPLC로 분석하였다. EE(%) =(CI / CT ) × 100%.
PEG-PCCL의 입자 크기 및 제타 전위는 레이저 입자 크기 분석기(Malvern Nano-ZS 90)로 측정하였다. 투과전자현미경(TEM, H-6009IV, Hitachi, Japan)을 사용하여 PEG-PCCL의 형태를 평가하였다. 구체적으로, 나노입자 용액을 니트로셀룰로오스로 덮인 구리 그리드에 놓고 샘플을 인텅스텐산으로 염색하고 실온에서 건조시켰다.
세포 독성은 Hep-G2 및 HEK293T에서 MTT 및 LDH 누출 분석에 의해 평가되었습니다. MTS 대사는 MTT의 절차에 따라 손상되지 않은 세포에서 정량화되었습니다[21]. 세포 현탁액은 트립신/EDTA(HyClone, UT, USA)에 의해 제조되었습니다. 총 0.4 × 10 4 세포를 96웰 플레이트(Corning, MA, USA)에 접종하였다. 플레이트를 12시간 동안 배양하여 세포가 배양 플레이트의 플라스틱 표면에 부착되도록 했습니다. 그런 다음, 배지를 제거하고 200μl의 새로운 배양 배지 또는 다양한 농도의 PEG-PCCL(0~1mg/mL)을 함유하는 배지를 웰에 첨가했습니다. 24시간 노출 기간 동안 배지에 FCS를 추가하지 않았습니다. 생존율은 세포독성 매개변수에 의해 결정되며 다음 방정식으로 표시됩니다. 생존율(%) =(ODT /ODC ) × 100. 여기서, ODT 및 ODC PEG-PCCL 또는 PEI 나노입자 처리 세포 및 처리되지 않은 세포의 흡광도 값(570nm에서 분광 광도계 판독기로 측정)을 각각 참조하십시오.
LDH assay kit(Biotech, China)를 사용하여 배양액의 LDH 누출을 조사하였다. 나노 입자 처리 그룹의 모든 분광 측정은 무세포 대조군에 의해 보정되었습니다. 형태학적 연구를 위해 HepG2 세포를 세포독성 분석과 동일한 방식으로 파종하고 노출시켰다. 세포를 4% 파라포름알데히드에 고정하고 투과전자현미경(TEM)으로 관찰하였다.
아폽토시스는 Annexin V-FITC 및 PI 이중 염색에 의해 결정되었습니다[22]. 간단히 말해서, HepG2 세포를 4 × 10 4 의 밀도로 12웰 플레이트에 접종했습니다. 세포/웰에 넣고 48시간 동안 PEG-PCCL(0.5mg/mL) 및 PEI(0.5mg/mL)로 처리했습니다. 그런 다음 세포를 차가운 PBS(인산염 완충 식염수)로 3회 세척한 후 Annexin V-FITC 15분 배양 및 4°C 암실에서 15분 PI 염색을 수행했습니다. 염색된 세포는 형광현미경(Olympus Co. Ltd., Tokyo, Japan)으로 30분 이내에 관찰되었습니다.
PEG/PCCL의 혈액적합성은 이전에 보고된 체외 적혈구(RBC) 용혈 검사에 따라 평가되었다[23]. 마우스 혈액 샘플을 수집하고 적혈구를 PBS(2% RBC 용액)에 용해시켰다. 생리 식염수, PEI 또는 0.5mg/ml의 PEG-PCCL을 2% RBC 용액과 혼합했습니다. 동일한 부피의 적혈구 현탁액 및 증류수를 첨가하여 양성 용혈 대조군을 제조하였다. 혼합물을 37°C에서 1시간 및 3시간 동안 유지한 다음 2000r/min에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 마이크로플레이트 판독기(Bio-Rad, CA, USA)로 570nm에서 검출했습니다. 용혈의 백분율은 다음 방정식으로 계산되었습니다. 용혈 % =(ODT –ODNC )/(ODPC –ODNC ) × 100. 여기서, ODT , ODNC 및 ODPC 샘플, 음성 대조군 및 양성 대조군의 흡광도 값을 각각 참조하십시오. 또한 생리 식염수, PEI(20mg/kg) 또는 PEG-PCCL(20mg/kg)을 3시간 동안 처리한 마우스의 꼬리 정맥을 통해 수집된 혈액 샘플의 RBC 수를 계산하여 생체 내 용혈을 분석했습니다.
토끼의 양쪽 귀에 있는 정맥을 사용하여 염증 세포 침윤과 표피 변성을 비교했습니다[24, 25]. 토끼를 무작위로 두 그룹으로 나누었습니다. 각각에게 1ml 생리식염수 또는 0.5mg/ml PEG-PCCL을 귀 정맥을 통해 제공했습니다. 토끼는 나노 입자 주입 후 24시간에 염소 수화물(4%, Sigma, USA)의 과다 복용으로 사망했습니다. 근위 및 원위 모두 카테터 팁에서 10-15mm 영역을 포함하여 2개의 귀 정맥 샘플을 얻었습니다. 이 정맥은 4% 파라포름알데히드 용액에 고정되었습니다. 그런 다음 파라핀 단면을 준비하고 헤마톡실린과 에오신(HE)으로 염색했습니다. 조직병리학적 검사는 맹목적으로 수행되었다. 결과는 표피 변성이 추가된 Kuwahara[17]의 결과를 기반으로 하여 표에 표시된 기준에 따라 등급이 매겨졌습니다.
마우스에 PEG-PCCL(0.5mL, 20mg/kg)을 투여한 후 7일 후, 안와 정맥총(2mL)에서 혈액 샘플을 추출하고 즉시 1300g, 4°C에서 원심분리했습니다. 상청액을 회수하였다. 그런 다음, 동물 생화학적 자동 분석기(Dri-Chem 3000)를 사용하여 아스파르테이트 아미노전이효소(AST), 알라닌 아미노전이효소(ALT), 알칼리성 인산분해효소(ALP), 빌리루비, 크레아티닌, 요산 및 알부민을 포함한 혈청 생화학 매개변수[26]를 평가했습니다. , Fuji Photo, Tokyo, Japan), 간 및 신장 기능의 간접 지표입니다.
마우스를 통해 PEG-PCCL, PEI 용액 또는 생리식염수(0.5mL, 20mg/kg)를 주입한 후 24시간, 48시간, 7일에 H&E 염색으로 폐, 간, 신장의 조직병리학적 변화를 조사했습니다. 꼬리 정맥. 이 장기는 동물을 희생한 후에 얻었습니다. 조직병리학 섹션 및 H&E 염색은 다른 곳에서 설명한 대로 수행되었습니다[26]. 조직병리학적 변화는 광학현미경으로 관찰하였고 다양한 카메라(Leica, Co. Ltd., Germany)로 기록하였다.
PTX의 혈중 농도는 분광광도계(LAMBDA 950, PerkinElmer, China)를 사용하여 계산하였다. 처리 후 0.08, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 6, 12, 24시간에 마우스 궤도에서 혈액 샘플을 채취했습니다. 10분 동안 1300g에서 원심분리한 후 상층액(100μL)을 수집했습니다. 각 혈액 샘플의 PTX 농도는 760nm에서 분광광도계로 측정되었습니다.
H22 세포 현탁액(0.25mL, 4 × 10 6 세포/마우스)를 0일에 Balb/C 마우스에 복강내 주사했습니다. 복수가 형성되면(3~5일에), 종양이 있는 마우스를 무작위로 세 그룹(n =5) 치료가 시작되었습니다. 항종양 효능을 평가하기 위해 3일과 10일에 생리 식염수, PEG-PCCL/PTX(20mg/kg) 또는 PTX(10mg/kg)를 0.5mL의 부피로 마우스에 복강 내 주사했습니다. IPAP =(P) 공식과 같이 AP(IPAP)의 증가된 백분율을 계산하기 위해 복부 둘레(AP)를 매일 측정했습니다. n − 피 0 )/피 n . 10일째에 생존한 마우스를 경추 탈구로 희생시키고 복수를 수집하고 무게를 쟀다. 생쥐의 생존 시간은 20일까지 관찰되었습니다. 종양이 있는 생쥐는 높은 호흡수, 털갈이, 구부린 자세, 활동 감소 및 진행성 복수 형성을 포함한 조난 징후와 함께 종말점에서 처형되었습니다[27]. 항종양 활성은 생존일수, 복부 둘레, 복수 부피로 종합적으로 평가하였다. 마우스는 표준 실험실 조건에서 먹였습니다.
통계 분석은 SPSS 19.0(IBM, NY, USA)을 사용하여 수행되었습니다. 모든 실험적 처리는 적어도 세 번 독립적으로 반복되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시되었습니다. 통계 분석을 위해 분산 분석(ANOVA)을 사용했습니다. 각 정맥염 소견의 등급은 Wilcoxon rank sum test로 분석하였다. Dunnett의 테스트는 개별 개입을 비교하는 데 사용되었습니다. 통계적 유의성은 P에 표시되었습니다. <0.05.
<섹션 데이터-제목="결과">레이저 입도 분석기의 결과는 PEG-PCCL의 평균 직경이 97 ± 2.6nm인 것으로 나타났습니다. PEG-PCCL의 TEM 결과(그림 2)는 PEG-PCCL이 구형이고 용액에서 균일한 것으로 나타났습니다. PEG-PCCL의 평균 제타 전위는 - 18.4mV였습니다. 미니컬럼 원심분리 방법은 EE%가 55.98%임을 보여주었습니다.
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PEG-PCCL의 특성:TEM 이미지. 눈금 막대는 100nm였습니다.
PEG-PCCL의 세포독성은 HEK293T 및 Hep-G2 세포주에서 대표적인 나노규모 비히클인 PEI와 비교하여 평가하였다. PEG-PCCL 또는 PEI의 농도 범위(0~1mg/mL) 내에서 HEK293T 세포(그림 3a)와 종양 세포(Hep-G2)(그림 3b) 모두의 생존율은 농도 의존적으로 감소했습니다. 방법. 배아 세포는 0.25mg/mL 농도에서 더 민감한 것으로 나타났고 종양 세포는 1mg/mL 이상에서 더 민감했습니다. PEI와 비교하여 PEG-PCCL은 특히 더 높은 농도, 즉 0.75 및 1mg/mL(P =0.023). LDH 분석은 배아 세포와 종양 세포 모두에서 시간이 지남에 따라 사망률이 증가함을 보여주었습니다. (i) PEI보다 0.5mg/mL PEG-PCCL(그림 3c)에서 각각 24시간 및 48시간에 19% 및 42% 낮았습니다. (ii) PEI(P =0.037) (그림 3d).
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PEI와 비교한 PEG-PCCL의 세포독성. 아 , b MTT assay는 음성대조군(PEI)에 비해 293T와 HepG2 농도 의존적으로 생존율을 보였다. ㄷ , d 48시간 후 PEG-PCCL 및 PEI에 노출된 293 T 및 HepG2의 LDH 누출 분석. *피 <0.05 대 PEI 그룹
손상되지 않은 Hep-G2 세포와 PEG-PCCL 나노입자를 처리한 세포의 전자현미경 이미지를 그림 4에 나타내었다. 손상되지 않은 Hep-G2 세포에서는 각 표면에 풍부한 미세융모(Mv)가 있었고 핵(N)은 정점 부분보다 기부쪽으로 더 위치합니다. 수많은 미토콘드리아(Mt), 골지 복합체(Go) 및 거친 소포체(RER)가 세포질에 분포되어 있습니다. PEG-PCCL 처리된 세포에서는 음세포 소포가 확실히 증가하였다. 유의한 조직병리학적 변화는 관찰되지 않았으며 원형 N 및 Mt, RER 및 Go를 포함한 세포질 소기관은 손상되지 않았습니다.
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전자 현미경 사진. 아 , b 정상 HepG2 세포. ㄷ , d PEG-PCCL 나노입자를 SEM(주사전자현미경)으로 처리한 세포. 어두운 화살표는 pinocytotic vesicles를 가리킵니다.
세포 생존력의 현저한 감소는 입자 크기, 표면 화학 및 농도의 특성과 관련이 있을 수 있으며 [28], 이는 HepG2 세포에서 관찰된 세포 사멸의 기본 메커니즘에 대한 우리의 관심을 촉발했습니다. 세포 사멸이 세포 사멸 또는 괴사로 인한 것인지 확인하기 위해 HepG2 세포를 Annexin V 및 PI 동시 염색에 대해 PEI 또는 PEG-PCCL로 처리했습니다. 형광현미경(Fig. 5)에서 관찰된 바와 같이, annexin V에 의해 염색된 녹색 형광에 의해 나타난 바와 같이, PEI 또는 PEG-PCCL로 처리된 세포는 블랭크 대조군에 비해 더 빠른 세포자멸사를 나타냈다. MTT assay의 이전 결과와 일치하는 PEG-PCCL의.
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FITC-Annexin V 염색은 세포 사멸을 나타냅니다. 0.5mg/mL 농도의 나노입자와 함께 48시간 동안 배양한 다음 요오드화 프로피디움(빨간색) 및 아넥신 V(녹색)로 공동 염색한 HepG2 세포를 × 40
에서 이미지화했습니다.생체적합성 나노입자는 혈관내 적용을 목적으로 설계되었기 때문에 혈액적합성 및 내피세포독성에 대한 연구가 필요하다. 시험관 내 테스트에서 관찰 3시간 동안 시간이 지남에 따라 용혈이 증가했으며 PEG-PCCL이 일반 식염수보다 용혈 비율이 더 낮은 것으로 나타났습니다(그림 6a). 생체 내 시험에서도 비슷한 경향을 보였다. 대조적으로, PEI는 시험관 내 및 생체 내에서 심각한 용혈을 유발했습니다(그림 6b).
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용혈 비율 및 세포 수(× 10 9 /L) 3시간 후의 혈액 샘플. 시험관 내(a ) 생체 내(b ) *피 <0.05 대 음성 대조군
조직병리학적 검사(그림 7)는 귀 연골에 연골세포 괴사가 없는 온전한 혈관 내피를 보여줍니다. 정맥의 근위부에서 약간의 부종이 관찰되었습니다. 정맥내피세포 소실 및 염증세포 침윤과 관련하여 12시간 및 24시간 후 PEG-PCCL을 처리한 그룹의 동시주입(표 1)은 증가하는 경향이 있었지만 개선은 통계적으로 유의하지 않았습니다( 피> 0.05).
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H&E로 염색한 24시간 주입 후 귀 정맥의 현미경 사진. 아 , b 생리 식염수 주입 그룹. ㄷ , d PEG-PCCL 주입 그룹. 바늘은 귀 연골을 나타냅니다. (왼쪽 이미지 × 10, 오른쪽 이미지 × 40)
주요 장기에서 PEG-PCCL의 급성 독성을 평가하기 위해 마우스에 0.5mg/mL의 PEG-PCCL을 3일 동안 정맥 투여한 후 폐, 간, 신장의 조직병리학적 검사를 수행했습니다(n =5). 일반 식염수와 PEI를 대조군으로 사용했습니다. 결과는 PEI가 약간의 염증과 소엽 간질 두께 및 간세포 핵융합증을 유발함을 보여주었습니다(그림 8). PEG-PCCL을 처리한 그룹에서는 정상 식염수 그룹과 비교하여 모든 검사 기관에서 뚜렷한 조직병리학적 변화가 관찰되지 않았지만(그림 7); 무독성의 추가 확인을 위해 간 기능을 검사했습니다(표 2).
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H&E는 폐, 간, 신장의 광학현미경 이미지를 염색합니다. 이미지는 NS, PEI 및 PEG-PCCL이 정맥내 투여된 마우스로부터 수집됩니다. 바늘은 간세포의 핵결석을 나타냅니다. (왼쪽 열의 이미지, × 10, 오른쪽 열의 이미지 × 40)
약동학 연구는 Taxol® 10mg/kg PTX 또는 20mg/kg PEG-PCCL/PTX(PP + PTX)(50% 로딩 비율)를 정맥 주사한 후 수행되었습니다. 혈장 농도(Cmax)의 피크는 312 ± 2.59μg/mL(PTX) 및 283 ± 2.79μg/Ml(PP + PTX)였습니다. 최대 농도 시간(Tmax)과 혈장 농도-시간 곡선 아래 면적은 0.54 ± 0.20 h, 52.00 ± 4.30 μg h/mL 및 4 ± 1.22 h, 282.21 ±08 21의 NP에 대한 PTX 및 282.21 ±0. , 각각. 혈액 농도-시간 곡선은 그림 9에 나와 있습니다.
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혈액 농도-시간 곡선. 마우스에서 PTX 또는 PP + PTX를 정맥내 투여한 후. (n =6)
생체 내에서 PEG-PCCL/PTX의 항종양 효과를 조사하기 위해 (i) H22 종양 보유 마우스의 복부 둘레(IPAP)의 증가된 백분율을 매일 계산했습니다(그림 10a). 3일째에는 복수가 형성되기 시작하여 각 그룹의 IPAP가 급격히 상승하였으며, PP/PTX 그룹과 PTX 그룹은 NS 그룹에 비해 시간이 지남에 따라 느린 증가를 보였다. (ii) 10일째에 복수를 채취하여 부피를 측정하였다(Fig. 10b). NS군에 비해 PTX군과 PP/PTX군 모두 복수의 양이 유의하게 감소하였다(P =0.0005 및 P =0.0052), 여기서 PP/PTX 그룹은 PTX 그룹(P =0.0138). (iii) 각 군의 생존은 0일부터 20일 동안 관찰되었다. PP/PTX군과 PTX군은 NS군보다 수명이 길고 생존율이 높았다.
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H22 종양 보유 마우스에서 PP/PTX의 항종양 효과. 아 Balb/C 마우스(n =5) 3일차에 PP/PTX 또는 PTX를 복강내 주사했습니다. b 각 그룹의 복수(n =5) 10일째에 수집되었습니다. c 각 그룹의 생존(n =10)이 매일 관찰되었다. *피 <0.05, **P <0.01, ***P <0.001
PEI를 포함한 많은 중합체는 적절한 접합을 위한 화학 및 생물 약제의 운반체로 제안되었습니다. PEI는 널리 조사된 양이온성 폴리머이며 형질감염 효율에 관한 분석에서 황금 표준으로 간주되어 왔습니다[29]. 그러나 부작용(예:세포 독성)으로 인해 PEI를 의료용으로 적용하는 데 방해가 됩니다. 보다 안전하고 효과적인 나노 기반 물질을 찾기 위해 우리는 약물 전달의 새로운 후보를 성공적으로 준비했습니다. PEG-PCCL은 높은 친수성과 수소결합의 영향으로 안정성이 좋은 것이 특징입니다. 이 연구의 주요 목적은 PEG-PCCL의 생체 내 및 시험관 내 독성을 평가하여 암 치료를 위한 잠재적인 치료 창을 여는 것이었습니다.
향상된 투과성 및 체류 효과는 종양 선택 전달 메커니즘으로 간주되기 때문에 나노 크기의 약물이 상당한 주목을 받고 있다[30, 31]. 더 작은 직경의 나노입자는 면역적합성이 더 우수하고[32] 간에 의한 흡수가 적고, 혈액 순환 시간이 더 길며, 생체이용률이 더 높습니다[33]. 당사의 이중합체는 적절한 크기(97 ± 2.6nm)(그림 2)로 침투합니다. 그리고 종양 혈관 밖으로 뿐만 아니라 숙주 면역 체계를 회피하는 반면, 긍정적인 제타 전위를 갖는 양이온성 폴리머는 독성이 있는 것으로 보고되었습니다[34]. 음의 제타 전위를 갖는 PEG-PCCL의 이러한 독성은 이상적으로는 피해야 합니다. 실제로, 본 연구의 독성 평가에서 PEG-PCCL에 대한 독성 문제는 거의 없었습니다. 다른 연구실에서도 유사한 결과가 보고되었습니다[35,36,37].
시험관 내 실험에서 PEG-PCCL에 대한 무독성 특성이 밝혀졌습니다. SEM에서 관찰된 바와 같이(그림 4), (i) 어두운 화살표로 인식된 음세포 소포는 엔도사이토시스(endocytosis)를 나타내었다[38]. (ii) 완전한 핵 및 손상되지 않은 세포소기관(Mt, RER 및 Go)은 세포 수준에서 PEG-PCCL의 세포독성이 거의 없고 우수한 생체적합성을 나타냈다. MTT 분석 및 LDH 누출 분석(그림 3)에서 PEI와 PEG-PCCL은 293 T 세포와 HepG2 세포 모두에서 용량 및 시간 의존적 방식으로 유사한 세포 생존 경향을 나타내었지만 PEG-PCCL은 더 낮은 특히 더 높은 농도에서 세포독성(P <0.05). 이러한 결과는 카르복실의 공유 결합이 추가 독성을 증가시키지 않는다는 것을 시사했습니다. 시험관내 용혈은 NP 혈액 적합성을 평가하는 유용하고 신뢰할 수 있는 방법으로 널리 받아들여지고 있습니다. 체외 용혈 검사에서 PEG-PCCL은 생리 식염수보다 낮은 용혈 비율을 보였다(그림 6a). 이것은 혈액 세포를 보호하는 PEG-PCCL의 부정적인 잠재력 때문일 수 있습니다. 생체 내 용혈 시험에서도 비슷한 경향을 보였다. 대조적으로, PEI는 심각한 용혈을 나타냈다. 종합하면, PEG-PCCL 나노입자는 시험관 내 및 생체 내 모델에서 용혈 효과를 나타내지 않았기 때문에 혈액 적합성입니다(그림 6b).
The innoxious nature of PEG-PCCL was further proved by in vivo experiments. Since phlebitis induced by intravenously administered antineoplastic agents [24] is frequently seen in clinical practice, we tested the inflammatory reaction after PEG-PCCL injection. In the rabbit phlebitis study (Fig. 7), little inflammatory infiltration or tissue edema was observed, indicating that the new formulation of chemotherapeutic drugs captured by PEG-PCCL is biocompatible, and that co-infusion of PEG-PCCL could be a favorable candidate as intravenous drug deliverer. Meanwhile, in the H&E staining assay (Fig. 8), no obvious histopathological changes of organs were observed in PEG-PCCL nanoparticles treatment group compared to normal group. Further hepatorenal function was investigated for safety evaluation (Table 2), in which no significant differences were shown between normal saline group and PEG-PCCL group. Consequently, it is evident that PEG-PCCL is a kind of safe and non-toxic nanoparticles with potentiality to be applied in targeting intervention.
Furthermore, preliminary evaluation of drug-loaded effect in regard of pharmacokinetics and anti-tumor was carried out in H22 tumor-bearing mice. In the pharmacokinetic study (Fig. 9), Tmax of PP + PTX was 4 ± 1.22 h, which exhibited better persistence than that of PTX (0.54 ± 0.20 h). PP + PTX also performed larger area under the plasma concentration-time curve than PTX. These results showed that PEG-PCCL/PTX lasted longer than PTX alone in blood, which indicated higher stability and more delayed release of PEG-PCCL/PTX. However, the EE% of PEG-PCCL was dissatisfactory (55.98%) and sustained drug release was less than ideal (4 ± 1.22 h). Therefore, more research is needed to modify the nanoparticle to achieve a higher EE and longer drug release. For example, adjusting the proportion of PEG and PCCL can be considered [39]. Although no metastasis was seen in abdominal organs in our model, tissue distribution and concentration of PTX-NPs should be investigated in further study to find out the possible side effects. Moreover, the combination of PEG-PCCL and PTX made an improvement in life expectancy and a reduction in tumor ascites formation (Fig. 10). Notably, the anti-tumor effect was enhanced when PTX was loaded with PEG-PCCL, suggesting a possibility of a promising drug carrier. Besides, nanoparticles may be beneficial to confront anti-tumor drug resistance. Modification with folate [40] has been reported to overcome TLR4 driven chemotherapy resistance, and its co-encapsulation of anti-tumor agents [41] could be a promising option. Nanoparticle modified by additional Fe3 O4 [42] may be more easily guided to its targets under the applied magnetic field, which would lower chemotherapeutic drugs-induced systemic toxicity [43].
PEG-PCCL nanospheres showed less cytotoxicity and better biocompatibility than mature medical nanoparticles (PEI) at the therapeutical concentration. PEG-PCCL-loaded PTX revealed higher stability and slower release in tumor mice. These results suggest that PEG-PCCL is a potential candidate of biocompatible drug vehicle for hydrophobic drugs.
나노물질
초록 종양 특이적 억제제의 전달은 암 치료의 도전입니다. 항체로 변형된 나노입자는 로딩된 약물을 특정 종양 관련 항원을 과발현하는 종양 세포에 전달할 수 있습니다. 여기에서 우리는 간세포 암종에서 과발현되는 막 단백질인 글리피칸-3(GPC3 +)에 대한 항체 hGC33으로 변형된 소라페닙이 로딩된 폴리에틸렌 글리콜-b-PLGA 고분자 나노입자를 구성했습니다. 우리는 hGC33 변형 NP(hGC33-SFB-NP)가 GPC3+를 표적으로 한다는 것을 발견했습니다. 간세포암종(HCC) 세포는 HCC 세포 표면의 GPC3에 특이적으로 결
초록 본 연구에서는 고압증기멸균기에서 아미드화 반응을 통해 아미노 하이퍼브랜치 폴리머(HBP)-그라프트된 폴리아크릴로니트릴(PAN) 섬유를 제조하였다. 준비된 PAN-G-HBP 섬유는 Ag+를 복합화할 수 있습니다. 아미노 HBP의 아미노 그룹을 통해, 그리고 뜨거운 증기 조건에서 Ag+ HBP의 환원성을 통해 Ag0로 전환될 수 있습니다. PAN-G-HBP 및 Ag 나노입자(NPs) 코팅된 섬유는 FTIR, UV-VIS DRS, FE-SEM, EDS, XPS 및 항균 측정을 통해 특성화되었습니다. FTIR 결과 HBP가 PAN
