방광암 세포를 억제하기 위해 소수성으로 변형된 풀루란 나노입자를 포함하는 미톡산트론의 새로운 전달 및 억제 효율에 대한 나노 약물 크기의 영향
초록
새로운 나노입자를 이용하여 전달 효율을 높여 항암제 투여량을 줄이는 것은 암 치료에 큰 잠재력을 가지고 있다. 여기에서 우리는 콜레스테롤 치환된 풀루란 폴리머(CHPs)를 사용하여 미톡산트론 전달을 개선하는 데 초점을 맞추고 방광암 세포의 성장을 억제하는 데 적합한 나노 약물 크기를 선택했습니다. 우리는 CHP-1, CHP-2, CHP-3이라는 세 종류의 CHP를 합성했습니다. 이들의 화학구조는 NMR로 확인하였으며, 콜레스테롤 치환도는 각각 6.82%, 5.78%, 2.74%였다. 직경은 86.4, 162.30, 222.28nm였습니다. 우리는 인산완충식염수에서 48시간 동안 미톡산트론의 방출률을 테스트했습니다. 방출률은 세 가지 CHP에 대해 38.73%, 42.35%, 58.89%였습니다. 고분자의 소수성 치환 정도는 나노입자의 자기조립 과정과 관련이 있었고, 이는 나노입자의 크기와 약물 방출 속도에 영향을 미쳤습니다. 3개의 약물-로딩된 나노입자의 방출은 산 방출 매질에서 상당히 가속화되었다. 나노 입자가 클수록 약물 방출 속도가 빨라집니다. 24시간에 IC50 값은 0.25M으로 방광암 세포에서 미톡산트론을 가장 잘 억제했습니다.
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) 실험에서 가장 큰 크기의 약물이 탑재된 CHP-3 나노입자가 방광암에 가장 독성이 있음이 입증되었습니다. 세포. 면역형광 및 유세포분석을 통해 가장 큰 크기의 약물이 로딩된 CHP-3 나노입자가 방광암 세포의 세포자멸사 촉진에 가장 강력한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 또한, 3개의 약물이 로딩된 나노입자는 모두 MB49 세포의 이동을 억제할 수 있으며, 큰 크기의 CHP-3 나노입자는 가장 강력한 억제를 나타냅니다.
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배경
화학 요법은 종양에 대한 일반적인 치료법입니다. 그러나, 조직 특이성이 없기 때문에 화학 요법의 치료 효과는 제한적이며 종종 강한 부작용이 있습니다[1, 2]. 따라서 나노입자(NP) 제제를 사용하여 화학요법 약물의 표적 능력을 증대시키는 연구가 증가하고 있다[3,4,5].
EPR(Enhanced Permeability and Retention) 효과를 통해 종양 조직을 수동적으로 표적화한 후, NP가 로딩된 소분자 항종양 약물과 같은 나노 약물은 주로 두 가지 방식으로 효능을 발휘합니다. 세포가 자유 형태로 존재하여 효능을 발휘하고 (2) 미세 입자 형태로 세포에 흡수되어 약력학적 효과를 발휘하기 위해 세포에서 방출됩니다[6, 7]. 나노 약제가 수동적으로 종양을 표적으로 하는 경우 두 가지 방법 중 어느 것이 중요한 역할을 하는지, 또는 두 가지가 동시에 중요한 역할을 하는지, 다른 요인이 관련되어 있는지 여부는 복잡한 문제입니다. 종양 조직의 대사 활성, 허혈 및 저산소증 및 젖산 축적으로 인해 종양 조직의 세포외액은 약산성을 나타내므로 많은 나노 약물은 산성 환경에서 증가된 방출을 나타내어 효능을 향상시킨다[8]. 산성 환경에서 나노 약물의 약물 방출 효율은 나노 물질의 물리화학적 특성과 밀접한 관련이 있으며 나노입자의 크기에도 영향을 받는다[9,10,11]. 나노입자가 종양 조직을 수동적으로 표적화한 후, 종양 세포는 식균 작용을 하기 때문에 나노제약 제제는 주로 세포막 단백질에 의해 매개되는 음세포 작용 및 복잡한 과정을 통해 세포에 들어간다[12, 13]. 세포내 라이소자임이 분해되면서 나노의약품이 약물을 방출하고 효능을 발휘한다[14].
표적 조직에서 표적 세포의 흡수 효율은 나노 물질의 특성, 표면 변형, 형태, 전하 및 NP 크기와 밀접한 관련이 있습니다[15,16,17,18]. 세포 흡수는 NP 크기에 크게 의존합니다. Her-gold 나노입자의 내재화(endocytosis)는 크기에 크게 의존하며, 25~50nm 범위의 나노입자에서 가장 효과적인 흡수가 일어난다[19]. 매우 작거나 큰 NP는 비효율적인 흡수를 갖습니다. 40~50nm 크기는 수용체 매개 엔도사이토시스의 중요한 지점입니다[20]. 또한, NP 크기는 세포 독성에 영향을 미칩니다. 45nm와 90nm의 나노입자를 비교할 때 고분자 나노입자의 크기는 세포독성과 반비례한다[21]. NP의 크기는 종양 조직에서 약물의 방출과 세포의 흡수 효율에 영향을 미치며 궁극적으로 약물의 효능에 중요한 역할을 합니다.
다당류의 국소 부착은 국소화 및 표적화 기능을 향상시킵니다. 외부 암세포의 산성 환경은 다당류 나노 약물의 부분적 방출을 유도하여 종양 조직을 수동적으로 표적화한 후 약물이 로딩된 나노입자와 유리 약물의 이중 치료 효과를 유발합니다[22, 23].
무독성인 풀루란은 체내에서 쉽게 분해되고 콜레스테롤은 체내 고유의 물질이므로 안전하고 약물의 담체로 적합하다[24, 25]. 소수성 콜레스테릴 그룹과 친수성 당 사슬을 갖는 콜레스테롤 소수성 변형 풀루란(CHP) 폴리머는 소수성 중심 코어와 친수성 껍질을 가진 나노구형 구조로 자가 조립될 수 있습니다[26, 27]. 양친매성 폴리머는 콜레스테릴 그룹과 같은 소수성 그룹에 의해 형성된 소수성 코어와 함께 회전 타원체 구조의 NP로 자가 조립됩니다[28].
DNA를 삽입하고 토포이소머라제 II를 억제할 수 있는 광범위한 항암 활성 안트라사이클린 항생제인 Mitoxantrone은 고전적인 항종양 약물입니다. 그러나 심장 독성 때문에 mitoxantrone 사용은 제한적입니다. Mitoxantrone은 소수성 상호작용에 의해 CHP NP의 소수성 중심에 로드되어 EPR 효과를 통해 수동 표적화 효과를 갖는 CHP 나노미터 제제를 형성합니다. 자유 약물과 비교하여 약물이 탑재된 CHP 나노입자는 약물의 독성 효과가 감소하고 항암 효율이 증가합니다[29, 30]. CHP 고분자의 소수성기인 cholesteryl은 NP의 핵심구조 형성을 유도하며, 일정 범위 내에서 소수성기의 치환도가 높을수록 NP의 크기가 작아진다[31, 32]. CHP의 안정성은 크기 및 제타 전위 변화 없이 최소 2개월 이상 우수했으며 풀루란 나노입자는 종양 조직을 표적으로 삼아 EPR 효과에 의해 암세포를 죽일 수 있습니다[33, 34].
이 연구에서 우리는 콜레스테롤로 소수성으로 변형된 풀루란(CHP) NP를 항종양 약물 운반체로 사용하여 미톡산트론을 로드했습니다. 약물의 지속 방출, 산성 환경에서의 약물 방출, 방광암에 대한 독성에 대한 NP 크기의 영향을 연구하기 위해 상이한 석신산 무수물 콜레스테롤 에스테르(CHS) 전하 비율에서 CHP 중합체를 합성함으로써 상이한 크기의 미톡산트론 로딩된 풀루란 NP가 생성되었습니다. 세포, 세포 흡수 효율 및 세포 이동. 이 실험은 약물 운반체로 적합한 NP를 스크리닝하고 더 강력한 약물 효율성을 위해 수동 표적화로 NP의 크기 범위를 평가했습니다.
자료 및 방법
시약 및 기구
Mitoxantrone은 Aladdin Chemistry(Shanghai)의 제품이었습니다. 투석 백(BioSharp, USA, 8000~12,000 Da)은 Tianjin Junyao Biotechnology의 것이었습니다. 다른 시약은 Beijing Xinze Technology의 제품이었습니다.
Japan F-4500 Fluorescence Spectrophotometer, J-810 원형 이색성 크로마토그래피(Jasco Co., Japan), 입도 분석기(MALVERN, Nano 2S-90, Japan), 투영전자현미경(JEM-100CXII, Japan)을 사용하였다. .
CHP 폴리머의 합성 및 특성화 및 콜레스테롤 치환도 계산
숙신산 무수물 CHS의 합성은 이전에 보고되었습니다[35]. 0.5g의 풀루란 샘플을 예비를 위해 15mL의 탈수된 디메틸 설폭사이드에 용해시켰다. CHS(당 단위/CHS =0.20, 0.15, 0.05mmol/mmol), 4-디메틸피리딘(DMAP∕CHS =1 mmol/mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프롤)-3-에틸-카르보디이미드 염산염 CHS =1.2mmol/mmol)을 10mL DMSO에 별도로 용해하고 실온에서 교반하고 1시간 동안 활성화했습니다. 활성화 반응을 풀루란 용액에 떨어뜨렸습니다. 반응은 48시간 후에 중단되었습니다. 반응물을 200mL 무수 에탄올에 떨어뜨린 다음 흰색 침전물이 형성되었습니다. 여과는 흡인하고, 생성물은 적당량의 에탄올, 테트라히드로푸란, 디에틸에테르로 세척한 후 80℃에서 건조하였다. CHP-1, CHP-2, CHP-3과 같이 콜레스테롤 치환 정도가 다른 세 종류의 CHP 고분자가 얻어졌다[36]. 풀루란 다당류 및 CHP 중합체 10–20mg을 초음파 조건에서 DMSO-d6에 용해시키고
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H NMR 스펙트럼을 조사하였다. CHP 중합체에서 콜레스테롤의 치환 정도는 α-1,4 및 α-1,6 글리코시드 결합과 메틸렌 피크 아래 면적을 기준으로 결정되었습니다.
약물 로딩 CHP NP의 준비 및 특성화
[37, 38]에 설명된 대로 미토산트론 부하 CHP NP의 합성, 다양한 수준의 콜레스테롤로 대체된 3개의 CHP NP 각각 40mg과 백업용 미톡산트론 4mg을 사용하여 투석하여 약물 부하 NP를 얻었습니다. 새로 준비된 약물이 담지된 나노입자 또는 동결건조 후 증류수에 분산된 약물이 담지된 나노입자를 탄소 지지막이 있는 구리 그리드에 적하하고 여과지를 배수하였다. 그리드를 데시케이터에 넣은 다음 2%(w /와 ) 인텅스텐산(2%)을 첨가했는데, 이는 자연 건조 후 음성이었고 투과전자현미경(TEM)으로 관찰되었다[38]. 새로 제조된 약물이 로딩된 나노입자 또는 동결건조 후 증류수에 분산된 약물이 장착된 나노입자의 용액을 큐벳에 붓고 검출을 위해 입자 크기 분석기에 넣었다. 각 샘플은 균일한 크기와 NP의 잠재력을 얻기 위해 세 번 처리되었습니다.
약물 부하 CHP NP의 약물 부하 및 캡슐화 효율성 측정
미톡산트론이 로딩된 CHP 나노입자의 약물 로딩 함량(LC%) 및 캡슐화 효율(EE%)은 다음과 같이 [31, 39]에 설명된 대로 측정되었습니다.
3가지 유형의 미톡산트론이 로딩된 NP를 인산완충식염수(PBS)와 pH =6.8 및 4.0의 방출 매질에 넣었습니다. Mitoxantrone 방출은 투석에 의해 시험관 내에서 연구되었고 누적 방출 백분율(Q%)은 설명된 대로 계산되었습니다[40].
세포주 및 배양 조건
P Guo 박사가 제공한 쥐 방광암 세포주 MB49(Institute of Urology, Xi'an Jiaotong University, Xi'an, Shaanxi, China)는 10% 소 태아 혈청(Hyclone, Logan)이 보충된 DMEM(Lonza)에서 배양되었습니다. , UT, USA) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신, 37°C, 5% CO2를 포함하는 가습 공기 중 .
세포 생존 분석
세포 생존력은 테트라졸륨 기반 분석에 의해 평가되었습니다. 간단히 말해서, 세포는 2 × 10
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로 시딩되었습니다. 96웰 배양 플레이트에 웰당 24시간 동안 부착되도록 허용했습니다. 실험 초기에 다양한 씨뿌리기 밀도가 최적화되었습니다. 세포는 배양기에서 24시간 동안 다양한 농도의 미톡산트론으로 처리되었습니다. 0.0078, 0.0156, 0.03125, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 및 1μM의 미톡산트론을 1% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM에 용해했습니다. Hank의 균형 용액에 2mg/mL로 용해된 50μL의 MTT 테트라졸륨 염(Sigma)을 표시된 처리로 각 웰에 첨가하고 CO2에서 배양했습니다. 5시간 동안 인큐베이터 마지막으로 각 웰에서 배지를 흡인하고 150μL DMSO(Sigma)를 첨가하여 포르마잔 결정을 용해했습니다. 테스트 파장 490nm 및 기준 파장 630nm에서 Dynatech MR5000 플레이트 판독기를 사용하여 각 웰의 흡광도를 얻었습니다.
IC50 mitoxantrone에 대한 값은 용량-반응 곡선에 의해 결정되었습니다. 3가지 치환도가 있는 3가지 농도의 NP(0.0625, 0.125, 0.25μM)를 MTT로 비교했습니다. 실험 절차는 mitoxantrone과 동일했습니다.
아폽토시스 평가
세포 사멸 속도는 Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)를 사용한 유세포 분석에 의해 결정되었습니다. 간단히 말해서, 처리된 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척한 다음, 2 × 10
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의 결합 완충액에 재현탁했습니다. 제조업체의 지침에 따라 세포/mL. 그런 다음 5μL Annexin V-FITC 및 5μM PI를 100μL 세포 현탁액에 첨가하고 암실에서 실온에서 30분 동안 배양했습니다. 300μL 결합 완충액을 추가한 후 1시간 이내에 유세포 분석으로 표지된 세포를 검출했습니다.
모든 조기 세포사멸 세포(Annexin V-FITC-양성[염색된 녹색], PI-음성), 괴사성 세포(Annexin V-FITC-음성, PI-양성), 후기 세포사멸 세포(이중 양성) 및 살아있는 세포( 이중 음성)은 유세포 분석(FCM)으로 검출하고 Cell Quest 소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 분석했습니다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)의 경우 아르곤 레이저 여기 파장이 488nm이고 방출 파장이 530nm(FL-1 채널)이고 PI의 경우 670nm(FL-3 c3 채널)입니다. 또한, 형광현미경으로 세포사멸을 조사하였다. 첫째, 1.0 × 10
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세포를 96웰 배양 플레이트에 접종하고 24시간 후 세포를 위와 같이 처리한 다음 24시간 후 100μL 결합 완충액, 1μL Annexin V-FITC 및 1μLPI를 암실 상온에서 세포에 첨가했습니다. 15분 동안 저온에서 보관하고 형광현미경으로 관찰합니다.
세포 이동 분석
총 8 × 10
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세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 완전한 합류에 도달하도록 하였다. 칵테일 스틱을 사용하여 단층을 손상시켰다. 표시된 대로 세포를 무혈청 DMEM과 함께 인큐베이션했습니다. 디지털 이미지는 0, 6, 12, 24, 48시간에 촬영되었습니다. 평균 면적은 Image J를 사용하여 계산되었으며 실험은 3회 반복되었습니다.
결과 및 토론
CHP 접합체 및 콜레스테롤 대체 정도
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CHP(DMSO-d6 with TMS, ppm)에 대한 H NMR 값은 2.53ppm(2개의 메틸렌 그룹, -OCH2 채널2 영형-). 그림 1은
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을 보여줍니다. H NMR 스펙트럼으로 콜레스테롤이 석신산 스페이서 암을 통해 풀루란 장쇄에 화학적으로 결합되었음을 확인했습니다. 다른 공급 비율(a, b, c)에서 합성된 3개의 CHP NP에 대한 스펙트럼은 풀루란의 특징적인 피크를 보여주었습니다. α-1-4 및 α-1,6 글리코시드 결합은 ∂4.68 (1Hα1–6 ), ∂5.05 (1Hα1–4 ) 및 ∂2.53 (2개의 메틸렌 그룹, –OCH2 채널2 O-)로 구분하여 쉽게 구분할 수 있습니다. 0.40 ~ 2.40(콜레스테릭 골격의 수소)에서 새로운 특징적인 피크가 나타나 세 개의 CHP 폴리머가 성공적으로 합성되었음을 확인했습니다. 피크 아래의 면적은 원자의 수를 반영하며 콜레스테릭 치환 정도는 다음과 같이 계산할 수 있습니다[41].
여기서 A ∂4.68의 합 및 A ∂5.05 설탕 단위의 수를 나타냅니다. A∂ 2.53 -OCH2의 수소 원자 수입니다. 채널2 콜레스테릴 숙신산의 O-, 그리고 A∂ 2.53 /4는 –OCH2의 수입니다. 채널2 O-, 즉 숙신산 무수물 CHS의 콜레스테롤 수입니다. 따라서, 위의 공식은 100 글루코스 단위당 콜레스테릴기의 수로서 CHP 분자의 콜레스테릭 치환 정도를 나타낸다. 계산된 콜레스테릴 및 풀루란 당 단위의 사료비 및 몰비는 각각 1/5, 3/20 및 1/20이었고, 합성된 CHP-1, CHP-2 및 CHP-3의 치환도 폴리머는 각각 6.82%, 5.78% 및 2.74%였습니다. 풀루란 사슬의 콜레스테롤 치환 정도는 사료비 증가에 따라 증가하였다. 그러나 실제 대체 정도는 두 사료 비율보다 낮았습니다.
풀루란 사슬은 용매에 유연하고 꼬인 사슬로 존재할 수 있으며 일정량의 콜레스테롤을 첨가한 후 그래프트된 콜레스테롤은 더 큰 분자 입체 장애를 보여 숙시닐 콜레스테롤과 히드록실기의 직접적인 에스테르화 반응에 영향을 줍니다. 풀루란 체인에. 반응의 난이도가 크게 높아져 치환도가 작아졌다.
약물이 들어 있는 CHP NP 및 그 크기
CHP-1, CHP-2 및 CHP-3에 대한 3개의 비어 있는 CHP NP의 크기는 79.1, 104.9, 166.8nm였습니다. 어느 정도의 치환에서는 콜레스테롤의 치환도가 높을수록 소수성이 강화된다. 소수성이 강할수록 CHP 자가-응집된 NP가 더 조밀한 소수성 코어를 형성하여 NP의 크기를 감소시켰다[42]. 그림 2는 약물이 장착된 CHP NP의 크기를 보여줍니다. CHP-1, CHP-2, CHP-3의 입자 크기는 각각 86.4, 162.30, 222.28nm였습니다. 약물과 물질의 동일한 비율에서 고분자 소수성기의 치환도가 높은 약물이 담지된 NP의 입자크기는 작았으나 비봉입 약물보다 약물이 담지된 NP의 입경이 컸음 - 치환도가 동일한 빈 NP를 포함합니다. mitoxantrone이 소수성 코어에 들어가면 NP의 입자 크기가 증가합니다. 그림 2d에서 약물 부하 CHP NP의 제타 전위는 - 1.12mV입니다. 그림 2e는 약물이 장착된 NP가 구형임을 보여주는 TEM 이미지입니다.
미톡산트론(CHP-1)이 로딩된 NP 크기의 이미지(a ), CHP-2(b ), CHP-3(c )), 잠재적인 이미지(CHP-2(d) )) 및 TEM 이미지(CHP-2(e) ))
다양한 크기의 약물 로딩 NP 및 다양한 산성 배지에서의 약물 방출
약물과 CHP 폴리머 비율이 같을 때, 약물-로딩된 CHP-1, CHP-2 및 CHP-3 NP의 약물 로딩 및 포획 효율은 8.17% 및 88.92%였으며; 7.62% 및 82.28%; 및 각각 4.83% 및 50.67%입니다. CHP 중합체에서 콜레스테릭 소수성 치환이 높을수록 형성되는 입자 크기가 작아지고 약물 로딩 및 포획 효율이 높아집니다. 그림 3은 세 가지 약물이 포함된 CHP NP에 대한 약물 방출 프로필을 보여줍니다. PBS에서 약물은 48시간 동안 방출되었습니다. CHP-1, CHP-2, CHP-3의 방출율은 각각 38.73%, 42.35%, 58.89%였다. 세 가지 나노입자 모두 서방성 특성을 나타내었지만 나노입자 크기가 작을수록 소수성이 강하고 약물 방출이 느려졌다. pH 6.8에서 CHP-1, CHP-2 및 CHP-3의 약물 방출율은 각각 43.82%, 49.48%, 64.18%였습니다. 약산성 조건에서 CHP NP는 약물을 지속적으로 방출했지만 방출 속도는 크게 증가했습니다. pH 4.0에서 48시간 약물 방출 후 CHP-1, CHP-2 및 CHP-3의 약물 방출율은 각각 51.25%, 56.23%, 75.46%였습니다. CHP NP 약물의 방출은 특히 3가지 CHP NP 중 가장 큰 CHP-3 NP의 경우 낮은 pH에서 훨씬 더 빨랐습니다.
인산염 완충 식염수(검은색 사각형:CHP-1, 흰색 원:CHP-2, 검은색 아래쪽 삼각형:CHP-3)의 풀루란 NP로부터 미톡산트론(MTO) 방출, pH 6.8(흰색 위쪽 삼각형:CHP- 1, 검은색 다이아몬드:CHP-2, 흰색 정사각형:CHP-3) 및 pH 4.0(검은색 삼각형:CHP-1, 흰색 다이아몬드:CHP-2, 검은색 원:CHP-3), 시험관 내 37°C
미톡산트론 부하 CHP NP의 세포독성
MTT 분석(그림 4)에서 IC50 방광암 세포의 성장을 억제하는 미톡산트론 값은 24시간, 48시간, 72시간에 각각 0.25, 0.20, 0.06μM이었습니다(표 1). 24시간을 투여 시간으로 간주했습니다.
방광암 세포주 MB49의 세포 증식에 대한 미톡산트론 및 나노입자 처리의 효과. 쥐 방광암 세포주 MB49에서 0~0.5μg/mL의 나노 약물과 미톡산트론으로 24시간, 48시간, 72시간 처리한 테트라졸륨 기반 분석으로 세포 생존율을 평가했습니다.
<그림>
유리 미톡산트론과 미톡산트론-CHP 나노입자의 농도가 동일하고 동일한 투여로 그림 5의 MTT 실험 결과는 유리 미톡산트론 농도가 미톡산트론-CHP 나노입자보다 방광암 세포에 더 독성이 있음을 보여줍니다. mitoxantrone-CHP 나노입자와 3가지 콜레스테롤 치환도를 비교했을 때 가장 강력한 세포독성 효과는 CHP-3, 그 다음이 CHP-2, 가장 약한 효과는 CHP-1이었다.
24시간에서 유리 미토산트론 및 미톡산트론이 로드된 CHP NP의 세포독성(파란색 사각형:미톡산트론, 분홍색 원:CHP-1, 녹색 삼각형:CHP-2, 빨간색 아래쪽 삼각형:CHP-3)
다양한 농도의 미톡산트론-CHP 나노입자가 방광암 세포, 특히 CHP-2와 CHP-3에 미치는 독성 효과는 유사했지만 CHP-1의 효과는 상당히 감소했습니다. CHP-1의 각 농도는 이러한 현상을 보였다. 따라서 mitoxantrone-CHP NP 크기가 클수록 세포 독성이 강해집니다.
NP의 치료 효과는 (1) NP의 세포 흡수 및 (2) NP가 세포 외부로 방출되고 약물이 세포에 자유롭게 들어가 약효를 발휘하는 두 부분이 있습니다. 유리 미톡산트론은 미톡산트론-CHP 나노입자보다 더 강한 효과를 가지기 때문에 CHP-3은 동일한 약물 투여량에서 다른 두 CHP 나노입자보다 더 강력한 치료 효과를 나타냈다. CHP-3의 방출이 가장 빨랐고, CHP 나노입자의 치료 효과는 주로 나노 제제 방출 후 세포 내 유리 미톡산트론의 독성에 의존하였다.
미톡산트론-CHP NP의 세포 사멸
우리는 면역형광 및 유세포 분석을 사용하여 동일한 농도의 0.2μg/mL 미톡산트론과 세 가지 약물이 장착된 CHP NP가 MB49 세포의 세포자멸사에 미치는 영향을 비교했습니다. 유리 미토산트론은 3가지 미톡산트론-CHP NP보다 세포자멸사에 대해 더 강력했습니다(그림 6). 그러나 CHP-3이 가장 강력한 효과를 보였고 가장 약한 효과는 CHP-1이었습니다. 기존 MTT 결과가 더 확인되었습니다.
24시간에 MB49 방광암 세포에서 미톡산트론 및 나노약물의 세포자멸사(a DMSO, b 미톡산트론, c CHP-3, d CHP-2, e CHP-1):A. Annexin V-FITC/PI 이중염색이 형광현미경으로 검출되었으며, 초기 세포사멸 세포는 Annexin V-FITC 양성 염색(녹색), 괴사 세포는 PI 양성(적색), 후기 세포사멸 세포 양성 이중 염색(노란색)을 보였다. B. 아폽토시스율은 FCM에 의해 결정되었다. 살아있는 세포(Q3), 초기 세포사멸 속도(Q4), 후기 세포사멸 속도(Q2), 괴사 세포(Q1). 세포 염색이 클수록 세포사멸 속도가 높아집니다.
미톡산트론이 로드된 CHP NP의 세포 마이그레이션
MB49 세포 이동을 억제하는 유리 미톡산트론과 3개의 CHP NP의 24시간 및 48시간 능력은 대조군과 비교하여 관찰되었습니다(그림 7). 이동 억제는 3개의 CHP NP보다 유리 미톡산트론에 대해 유의하게 더 강하지 않았다. MTT assay와 apoptosis test에서 3개의 CHP NPs보다 free drug에 대한 이동 억제가 더 강했는데, 그 이유는 주로 free drug이 세포에 더 쉽게 들어가 암세포를 죽이기 때문입니다. 세포 이동 실험에서도 자유 약물은 CHP 나노 의약품보다 세포 이동을 더 효율적으로 억제할 수 있는데, 이는 일부 CHP 나노 의약품이 세포 사이에서 탐식되지 않아 암세포의 이동 저항성을 초래하기 때문일 수 있습니다. 또한, 3개의 CHP 나노입자는 암세포의 이동을 억제하는데 차이가 없었기 때문에 나노입자에 의해 형성된 입체저항이 세포 이동에 중요한 역할을 하였다. 따라서 약물이 탑재된 CHPNP는 두 가지 방식으로 암세포를 억제합니다. (1) 세포외 방출이 지배적인 방식으로, 나노 약물이 세포 외부로 약물을 방출하고 CHP-3 NP가 더 독성이 있는 자유 약물로서 암세포를 죽입니다. (2) 암세포 외부의 CHP 나노입자는 입체저항을 생성하여 암세포의 이동을 차단합니다.
미톡산트론 단독 및 미톡산트론 로딩된 CHP NP는 상처 치유 분석에서 손상된 이동을 보였다. 아 DMSO, b 미톡산트론, c CHP-3, d CHP-2, e CHP-1. 이미지는 서로 다른 시간에 긁힌 영역의 간격을 보여줍니다. A0 , A24 , 및 A48 각각 DMSO 처리 0, 24, 48시간을 나타냅니다.
이 연구의 목적은 적절한 크기의 CHP NP를 약물 운반체로 선별하고 CHP NP의 치료 작용에 대한 실험적 증거를 제공하는 것이었습니다. 우리는 콜레스테롤 치환도가 각각 6.82%, 5.78%, 2.74%, 직경이 86.4, 162.30, 222.28인 세 종류의 스테롤 치환 풀루란 중합체(CHP), CHP-1, CHP-2 및 CHP-3을 합성했습니다. nm. 48시간 동안 세 종류의 미톡산트론-CHP 나노입자의 약물 방출율은 각각 38.73%, 42.35%, 58.89%였습니다. 폴리머의 소수성 치환 정도는 나노입자의 자기조립 과정과 관련되어 크기와 약물 방출 속도에 영향을 미쳤습니다. 산성 방출 매체에서 방출이 상당히 가속화되었습니다. NP가 클수록 약물 방출 속도가 빨라집니다. 24시간에 IC50 값은 0.25M으로, 방광암 세포의 성장에 대한 미톡산트론의 최고의 억제 효과를 나타냅니다. 가장 큰 크기의 약물이 로딩된 CHP-3 나노입자는 방광암 세포에 가장 독성이 있었고 CHP-3 나노입자는 세포의 세포자멸사 촉진에 가장 강력한 영향을 미쳤다. 모든 NP는 MB49 세포의 이동을 억제할 수 있었지만, 큰 크기의 CHP-3 NP가 가장 강력한 억제를 보였습니다.
양친매성 폴리머는 수용액에서 NP로 자가 조립될 수 있습니다. 예를 들면 다당류 풀루란과 키토산이 있는데, 이는 소분자의 소수성 변형에 의해 양친매성 고분자로 변형될 수 있고 소수성 그룹이 핵심이고 친수성 당 사슬 껍질이 있는 수용액에서 구형 NP로 자가 조립될 수 있습니다[43, 44]. 자가 조립 중에 소수성 그룹은 NP 형성의 원동력이며 쉘 및 코어 구조 형성의 핵심입니다. 친수성기의 성질과 분자량 또한 나노입자의 형성과 크기에 중요한 영향을 미친다[45, 46]. 동일한 폴리머가 소수성 그룹의 작은 부분으로 변형되면 소수성 치환 정도가 중간이어야 하며 특정 범위 내에서만 소수성 치환이 NP로 자기 조립될 수 있습니다. 소수성 치환도가 너무 높으면 폴리머의 소수성이 너무 강해 자기 조립에 도움이 되지 않습니다. 소수성 치환이 너무 낮으면 소수성 추진력이 너무 작아서 NP를 형성하지 못한다[47].
이 연구에서 우리는 적절한 공급 비율을 설계하여 콜레스테롤의 다양한 치환도를 가진 세 종류의 CHP 중합체를 성공적으로 합성했으며 모두 특정 크기의 NP로 자기 조립할 수 있었습니다. CHP 폴리머의 자가 조립 중에 미톡산트론과 같은 소수성 약물이 NP의 소수성 중심에 삽입되어 약물이 로딩된 NP를 형성할 수 있습니다(그림 8). 약물이 적재된 NP의 크기는 고분자 CHP의 치환 정도와 관련이 있습니다. 치환도가 높을수록 크기가 작아집니다. 폴리머의 치환 정도는 자가 조립 후 NP에 로딩되는 약물의 양에도 영향을 미칩니다. 약물 대 고분자의 비율이 같을 때 치환도가 높을수록 약물 부하가 커집니다[48]. 또한 약물 대 고분자의 비율은 캡슐화 효율과 약물 로딩에 영향을 미칩니다. 공급 비율이 적절한 범위에 있을 때만 약물 로딩 및 캡슐화 효율이 상대적으로 높을 것입니다[31]. Drug release of NPs directly affects their therapeutic effects, which is closely related to the kinds of nanomaterials, the surface charge and hydrophobic group of NPs, the pH value of releasing media, and the adsorption of the protein human serum albumin (HSA) in vivo [49, 50]. The drug release of mitoxantrone-loaded CHP NPs showed slow release. The drug release of CHP NPs with large size was faster and that of NPs in an acid environment was faster. The drug release rate of larger-sized NPs was more obvious and faster.
The self-assembly of mitoxantrone-loaded CHP nanoparticles (NPs)
Cancer chemotherapy is the main way to treat cancer currently, but the chemotherapy drugs are not tissue-specific and are toxic to normal tissues, and some cause great damage to immune cells, which harms the overall treatment effect [51, 52]. Nanomedicine can passively target cancer tissues via the EPR effect, thereby reducing drug deposition in non-target tissues and reducing toxicity and side effects. In this study, we used bladder cancer cells as model cancer cells, and we discuss the effects of NPs and NPs size on bladder cancer. The antitumor effect was stronger for free mitoxantrone than CHP NPs; however, if the whole drug is given, mitoxantrone is not tissue-specific. The deposition and wasting of tissues and the toxicity and side effects caused by these drugs will not be as effective as nano-drug treatments. Therefore, the toxic effects on cancer cells and the inhibition of cell migration was better with the free drug than drug-loaded NPs, which does not indicate that the overall therapeutic effect of CHP nanometers is not as good as that of free mitoxantrone. We point out the effect of hydrophobic degree of substitution on the size of nanoscale drugs and the effect of nano size on drug loading, drug release, cytotoxicity and cancer cell migration. After the NPs are passively targeted to cancer tissue via the EPR effect, the therapeutic effectiveness of drug-loaded NPs is mainly derived from the release of drugs in the tissue and the release of NPs to cells (Fig. 9). The therapeutic effect of CHP NPs is whether its extracellular or intracellular release plays the dominant role. From the cell experiments, the size of CHP NPs has a strong effect:with large size, drugs are released more, but the amount of the drug is the same. Therefore, the therapeutic effect of CHP-NPs may depend mainly on the release in the tissue instead of cell uptake.
The treatment efficacy of mitoxantrone-loaded CHP NPs by mainly location release in tumor tissue
Many classical NPs are used as drug carriers, and the CHP NPs we prepared are superior to others. For example, biogenetic NPs (such as exosome, extracellular vesicles-mimetic, modularized extracellular vesicles) are difficult to prepare [53]. The target distribution of common liposomes is not ideal and its instability is still a problem [54]. Inorganic NPs such as quantum dot NPs are very stable, but as foreign matter, their biocompatibility is poor, which may cause side effects to humans [55]. CHP NPs are easy to prepare and we can control their size by controlling the degree of hydrophobic substitution [48]. Because they can be directly degraded by amylase in vivo, they have good biocompatibility [56]. In addition, CHP NPs have good stability and excellent drug release properties [57].The disadvantage is that they will inevitably be swallowed in part by the mononuclear phagocytic system [58]. More research is needed to reduce the removal by the system and improve the effective blood concentration of NPs.
Conclusion
The size of mitoxantrone-loaded CHP NPs is related to the degree of cholesterol substitution in the polymer. The higher the hydrophobicity substitution degree, the smaller the size, and the greater the drug loading and encapsulation efficiency, and the slower the drug release. Under acidic conditions, the stronger the acidity, the faster the release of CHP NPs. Moreover, the release of NPs with larger size is best and larger-sized NPs can inhibit the growth of bladder cells and their migration better than smaller-sized NPs. CHP NPs kill cancer cells mainly by the release of nanoscale drugs outside the cell.
