현재까지 금속 나노입자가 생체 내에서 제거되는 방식은 아직 잘 밝혀지지 않았다. 여기에서 우리는 금속 나노 입자를 제거하기 위해 새로운 장 잔 세포 매개 생체내 청소 경로를 보고합니다. 삼각형의 은나노플레이트, 자성나노입자, 금나노막대, 금나노클러스터 등의 대표적인 금속나노입자를 대표적인 예로 선정하였다. 이러한 금속 나노입자를 제조하고 특성화하고 꼬리 정맥을 통해 CBD(총담관) 결찰이 있는 마우스 모델에 주입했습니다. 대변과 소변을 7일 동안 수집한 후 마우스를 희생시키고 추가 분석을 위해 장 및 위 조직을 수집했습니다. 그 결과, 선택된 4개의 금속 나노입자 모두가 장 전체 조직의 GC(goblet cell) 내부에 위치하여 장 GC의 분비를 통해 내장 내강으로 배설됨을 보여주었다. 또한, 삼각형 은 나노플레이트와 금 나노막대가 위벽 세포(PC) 내부에 위치하였다. 중요하게도, 나노입자는 장 조직에서 명백한 병리학적 변화를 일으키지 않았습니다. 이 연구에서 우리는 혈액 소체가 GC 분비 경로에 관여한다는 것을 확인했습니다. 또한, 우리는 장내 GC 및 PC에서 나노 입자의 분비가 한약을 통해 유도된 설사에 의해 촉진된다는 것을 발견했습니다. 결론적으로, 삼각형 은나노플레이트, 자성 나노입자, 금 나노막대 및 금 나노클러스터와 같은 금속 나노입자는 장내 GC 및 PC에 의해 세척될 수 있다. 금속 나노 입자의 생체 내 제거의 이 새로운 경로는 신약 설계 및 개발, 나노 입자 기반 라벨링 및 생체 내 추적, 생체 내 나노 입자의 생물학적 안전성 평가와 같은 미래 응용 분야에 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
나노기술과 그 응용의 급속한 발전으로 인해 다양한 공학 나노구조 재료가 현재 제약, 생물의학 제품 및 기타 산업에서 사용됩니다. 새로운 나노기술 제품은 미래의 경제 성장과 발전을 위한 엄청난 잠재력을 가지고 있지만 환경과 인간 건강에 대한 나노기술의 위험은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 나노 입자가 인체에 미치는 영향, 생물학적 시스템과의 상호 작용 및 잠재적 위험 평가를 조사하기 위해 나노독성학은 하나의 새로운 종합 주제로 간주되어 정부와 과학자의 관심을 높이고 나노 물질의 생물학적 안전성을 핵심으로 설정했습니다. 과학적 문제. 현재까지 많은 보고서가 나노 입자와 인간 세포 간의 상호 작용과 밀접하게 관련되어 있습니다. 예를 들어, 산화 그래핀, 금 나노클러스터 및 탄소 점과 같은 일부 나노 입자는 세포질 또는 세포 핵으로 들어가 세포 주기 정지 또는 세포 사멸, 폐 육아종 형성을 유도하고 일부 사이토카인의 면역학적 세포 분비를 자극할 수 있습니다[1,2, 3].
새로운 분자 영상 기술의 발달로 금 나노 입자, 은 나노 입자, 자기 나노 입자 및 양자점과 같은 금속 나노 입자는 다기능 치료 시약으로 활발히 연구되고 있으며 생체 내 표적 영상, 자기 유도 가열, 광열 또는 광역학 요법, 또는 고효율 약물 전달 시스템 등. 이러한 금속 나노입자 기반 다기능 나노프로브는 종양 부위에 위치하며 그 일부는 간 및 비장 조직에도 위치하며 신장, 폐 및 뇌 조직 전체에 분포할 수 있음이 관찰되었습니다[4,5,6, 7,8,9,10]. 신장은 직경이 5 nm 미만인 나노입자만 제거하기 때문에 대부분의 나노입자는 이러한 방식으로 제거하기가 매우 어렵습니다[11, 12]. 따라서 생체 내 금속 나노 입자를 세척하는 방법은 하나의 도전적인 핵심 과학적 문제가 되었습니다. 그러나 현재까지 인체에서 금속 나노 입자를 제거하는 확실한 대체 경로와 자세한 메커니즘이 없습니다. 따라서 생체 내에서 금속 나노 입자를 세척하는 방법이 우리의 관심사가 되었습니다.
현재까지 금속 나노입자는 주로 정맥, 경구, 복강의 3가지 경로를 통해 체내에 도입되는데, 그 중 정맥 주사가 전신에 빠르게 분포하기 때문에 가장 보편적인 방법이다[4, 13, 14]. . 그러나 유기체에 의한 이러한 유형의 나노입자의 금속 코어의 분해는 가능하다면 극도로 어려우며, 이는 잔류 나노입자의 축적의 영향인 주요 문제로 이어집니다. 생체 내 금속 나노입자의 품질은 나노입자 유도 생체활성과 원치 않는 독성 간의 균형에 의해 결정된다는 점에 유의해야 합니다. 독성학적 관점에서 볼 때 표적 부위에 충분한 양의 나노입자가 위치할 경우에만 독성 효과가 유발되며, 세포 및 조직에 존재하는 과도한 양의 나노입자의 영향을 중단시키는 가장 좋은 방법은 유기체로부터의 배설이다. 따라서 제거 경로에 대한 적절한 이해는 모든 의학적 적용 및 포괄적인 위험 평가에 매우 중요합니다.
신장, 간 및 폐와 같은 생체 내 조직 또는 기관에서 나노 입자의 제거와 관련된 일부 연구가 있습니다[15,16,17]. 그러나 이러한 실험은 전신이 아닌 단일 기관에서 입자를 제거하는 제거 메커니즘에 대한 정보를 제공할 뿐입니다[18]. 전신적인 생체내 청소율과 관련하여 정맥 주사된 나노입자의 두 가지 주요 배설 경로, 즉 일부 유형의 자성 나노입자와 같이 유기체에 의해 생분해될 수 없는 더 큰 나노구조를 위한 간담도계(hepato-biliary system, HBS)-대변 경로가 보고되었습니다. [19, 20], 그리고 양자점, 풀러렌, 금 나노클러스터 및 직경이 5 nm 미만인 기타 유형의 금 나노입자와 같은 작은 크기의 나노입자에 대한 신장-소변 경로 [16, 21, 22]. 그러나 이 두 경로는 생체 내 금속 나노입자에 대해 제한된 제거율을 보여줍니다.
Souris et al. 실리카 나노입자가 장벽에 고농도로 축적되고, 간에 위치한 50-100 nm 실리카 나노입자의 정맥주입 농도가 장벽 및 대변의 농도보다 훨씬 낮다는 것이 입증되었다[20]. 또 다른 연구에서는 변형에 관계없이 500 nm 크기의 나노입자를 어체에서 제거할 수 있으며 더 큰 나노입자는 능력을 훨씬 뛰어넘음에도 불구하고 500 nm 입자의 제거 속도가 50 nm 입자보다 빠르고 효율적임을 보여주었습니다. HBS [23]. 이러한 데이터는 HBS 경로가 생체 내 나노입자의 주요 배설 경로가 아닐 수 있으며 생체 내 나노입자에 대한 다른 배설 경로가 존재할 수 있음을 보여줍니다.
장 잔 세포(GC)는 장관 전체에 존재하는 고도로 극성화된 배설 세포입니다. 이러한 특수화된 상피 세포는 여러 매개체를 합성하고 분비함으로써 장에서 중요한 보호 역할을 하는 것으로 생각됩니다[24,25,26]. Wang et al. 잔 세포(GC)가 나노입자를 흡수할 수 있다고 보고했으며[27], Sun et al. 정맥 주사된 나노입자가 장내 GC에 분포한다는 것을 발견했습니다[28]. 그럼에도 불구하고, 현재까지 나노입자와 장내 GC 사이의 상호작용은 아직 자세히 조사되지 않았다. 특히, 이러한 나노 입자가 어떻게 GC 세포에 들어갈 수 있는지, 그리고 이러한 나노 입자가 전체 장 조직의 GC에 분포하는지 여부를 완전히 설명하는 보고서는 없습니다. 금속 나노입자가 장 조직으로 배설되는 경로를 명확히 하기 위해서는 나노입자의 새로운 배설 경로에서 장내 GC가 어떤 역할을 하는지 규명하는 것이 중요하다. 금속 나노입자는 HBS를 통해 배설되어 장으로 들어갈 수 있기 때문에 HBS가 매개하는 배설과 장내 GC에 의해 매개되는 배설을 구별하는 데 중점을 두었습니다(Scheme 1).
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나노입자의 장내 GC 배설경로
본 연구에서는 자성나노입자, 은삼각나노입자, 금나노클러스터, 금나노막대 등 일반적인 금속나노입자 4종을 연구대상으로 선정하였다. 금 나노막대의 광학적 특성 덕분에 2광자 여기를 통해 나노입자의 장내 분포를 관찰할 수 있는 도구 역할을 했으며, 나머지 세 가지 유형의 입자는 다양한 기타 금속 나노물질의 대표적인 예가 되었다. HBS와 장관 사이의 연결을 방지하기 위해 총담관을 결찰하여 마우스 모델을 준비했습니다. 꼬리 정맥을 통해 마우스에 금속 나노입자를 주입한 후, 누드 마우스를 사육하여 7일 동안 대변을 수집하고, 최종적으로 동물을 희생시키고, 장관 조직 및 위 조직을 수집하여 슬라이스로 제조하여 최종 분석하였다. 고해상도 투과 전자 현미경과 ICP-MS를 사용하여 장 조직에서 금속 나노 입자의 분포를 조사합니다. 또한, CBD 결찰 마우스의 대변에서 금속 나노입자의 존재를 측정하였다. 또한, 본 연구에서는 GC 및 PC의 나노입자 분비 기전을 더 밝히기 위해 최근 개발된 한약재를 통해 유도된 마우스 설사 모델을 사용했습니다.
삼각형 은 나노플레이트는 이전에 Mirkin[29]과 동료들이 설명한 절차를 통해 몇 가지 수정[30]을 통해 합성되었습니다. 공기가 있는 실온에서의 일반적인 실험에서 AgNO3 (0.1 mM, 100 mL), 구연산삼나트륨(30 mM, 6 mL), PVP(30 kDa 분자량, 0.7 mM, 6 mL) 및 240 μL H2 O2 (30 wt%)를 250 mL 플라스크에 순서대로 첨가하였다. 플라스크의 합한 용액을 세게 흔든 후 새로 준비한 0.1 M NaBH4 용액 0.8 mL 빠르게 주입되었습니다. 몇 초 안에 용액의 색상이 은 나노구의 생성을 나타내는 노란색으로 변했습니다. 다음 몇 시간 동안 용액이 더 이상 색상 변화 없이(최대 5 h) 파란색으로 변할 때까지 플라스크를 햇빛이나 형광등 아래에 두었습니다. 그리고 최종 용액은 추가 사용을 위해 4°C 냉장고에 보관했습니다.
제조된 용액의 흡광도 스펙트럼은 1cm 광로 큐벳을 이용하여 UV-vis-NIR 분광기(UV-3600, Shimadzu, Japan)로 측정하였다. 스펙트럼은 2 nm 슬릿을 사용하여 200~950 nm 범위 내에서 수집되었습니다. 투과 전자 현미경에 의한 분석은 탄소 코팅된 구리 TEM 그리드를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 총 10mL의 용액을 원심분리한 후 1mL 탈이온수에 있는 수집 나노 입자에 침지하여 JEM-200CX(JEOL, 일본)에서 작동했습니다. 25 °C에서 30 분 동안 6000 rpm에서. 가장자리 크기 분포를 통계적으로 계산하기 위해 TEM 이미지에서 총 200개의 삼각형 은 나노플레이트를 선택했습니다.
초상자성 자철광(Fe3 O4 ) 나노입자, 금 나노클러스터 및 금 나노막대는 우리의 이전 보고서[31,32,33]에 따라 합성 및 특성화되었으며 실온에서 보관되었습니다.
건강한 암컷 Wistar 쥐(180–220 g)와 암컷 무례한 쥐(20–22 g)를 Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd.(중국 상하이)에서 입수했습니다. 모든 동물 실험은 관련 법률 및 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 실험은 Shanghai Jiao Tong University의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(NO.SYXK2007-0025)의 승인을 받았습니다. 총담관은 원래 Lee가 기술한 방법에 따라 약간의 수정을 가하여 결찰되었습니다[34]. 간단히 말해서, 이 마우스를 펜토바르비탈(25 mg/kg)로 마취하고 나무 수술 시트에 고정했습니다. 중복부 절개를 하고 복부 조직을 조심스럽게 분리하여 CBD를 명확하게 노출시켰다. 직경 0.2 mm인 2개의 멸균 나일론 의료 외과용 봉합사(Shanghai Jinhuan Industry CO., Ltd., Shanghai, China)를 CBD 아래에 삽입하고 CBD 세그먼트의 양쪽 끝에 3개의 노드를 만들었습니다(그림 1a). 1b, c). 마지막으로 CBD를 두 끝 사이에서 절단한 다음 복부를 최종 폐쇄했습니다. 총담관 결찰 후 14일째에 각 마우스에서 혈액 샘플을 채취하여 주요 간 기능을 테스트했습니다.
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삼각형 은 나노플레이트의 특성. 아 준비된 용액의 UV-vis 스펙트럼. ㄴ 원심분리 후 수집된 은 나노입자의 TEM 이미지. ㄷ 선택된 삼각형 은 나노플레이트의 크기 분포(TEM 이미지에서 200개의 나노입자)
CBD 결찰을 마친 12마리의 마우스를 무작위로 대조군 1, 은나노판 시험군, 자성 나노입자 시험군, 금 나노클러스터 시험군의 4개 군으로 나누었다. 추가 대조군은 CBD 결찰이 없는 5마리의 마우스로 구성되었습니다. 대조군의 마우스에는 0.9% NaCl 수용액을 정맥 주사한 반면, 시험군에는 삼각형의 은나노플레이트, 자성나노입자, 금나노막대, 금나노클러스터와 같은 나노입자 현탁액을 150μL( 550 μg/mL). 4개의 나노 입자 현탁액 모두 사용 전에 1분 동안 초음파 처리에 의해 새로 분산되었습니다. 마우스를 근육긴장도가 이완될 때까지 5% isoflurane을 흡입하여 마취한 후 1 mL 주사기를 사용하여 4가지 종류의 나노입자 현탁액을 각각 정맥 주사하였다.
금속나노입자 현탁액을 주입한 지 7일째 되는 날 마우스를 마취하고 장 조직을 적출하여 10% 포름알데히드에 24시간 고정한 후 파라핀을 봉입하였다. Leica RM2135 회전식 마이크로톰을 사용하여 고정 샘플의 5μm 두께 섹션을 준비했습니다. 마지막으로 절편을 알코올로 탈수하고 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 샘플의 단면은 위상차 현미경(Olympus, RX-71, Japan)으로 관찰되었습니다.
금속 나노입자 현탁액을 주입한 지 7일째 되는 날 쥐를 도려낸 직후 장 조직과 위 조직을 채취하여 2.5% 글루타르알데히드 용액에 고정하였다. 고정된 샘플을 에탄올에서 연속적으로 탈수소화하고 에폭시 수지로 매립했습니다. 이후 고해상도 TEM(FEI, Tecnai G2 Spirit Biotwin, USA)으로 초박형 장 표본을 만들어 관찰하였다.
같은 날 희생 직후 장 조직을 채취하여 냉각 CCD(전하 결합 소자) 카메라와 적색 형광 단백질을 결합한 생체 내 영상 시스템(IVIS-100 영상 시스템, Caliper)을 사용하여 영상을 촬영했습니다. (DsRed) 필터(Caliper Life Sciences). 형광 신호의 이미지와 측정값은 Living Image 3.2 소프트웨어(Caliper Life Sciences)로 수집 및 분석되었습니다.
또한, 주사 후 7 일 이내에 모든 마우스 분변을 수집하고, 분변의 무게를 재고 왕수로 가열하에 소화시켰다. 마지막으로 ICP-MS(Agilent 7500a, USA)를 사용하여 용액의 금속 정신 함량을 측정했습니다.
세나 잎 10 g, 대황 2 g, 대마초 추출물 1 g을 물 100 mL에 첨가하고 100 °C로 10분 동안 가열한 다음 두 겹의 거즈로 여과합니다[35]. 마지막으로, 여액을 수집하고 감압 하에 0.3 g/mL로 농축하였다. 센나잎 추출물은 아래와 같이 제조하여 4 °C에서 보관한 후 시험을 수행하였다.
첫째, 6마리의 수컷 Kunming 마우스를 대조군과 설사 그룹의 두 그룹으로 무작위로 분리했습니다. 둘 다 경구 위관 영양법(0.1 mL)을 통해 7일 동안 매일 식염수와 한약 추출물로 처리되었습니다. 위관영양 투여 후 7일째에, 마우스를 희생시키고, 장 조직을 수집하고, 장 및 위 조직을 Tissue Tek OCT에서 동결하고 Leica CM 1510 S 저온 유지 장치(Sakura Funetek, USA)에서 절단하였다. 8 μm 섹션을 5분 동안 Alcian Blue(1% Alcain Blue 8GX in 3% glacial acetic acid)로 염색하고 마지막으로 증류수로 헹구었습니다. 이 샘플을 세척하기 전에 1% 과요오드산에서 산화시킨 다음 Schiff's 시약에서 15분 동안 처리했습니다. 조직 섹션의 이미지는 도립 현미경을 사용하여 기록되었습니다. 위 조직은 2광자 발광 이미징을 위해 양전하를 띤 슬라이드에서 수집되었습니다.
간단히 말해서, 9마리의 수컷 Kunming 마우스를 다른 처리에 따라 대조군, 결찰군 및 결찰+ 설사군의 세 그룹으로 각각 나누었습니다. 그런 다음, 이 마우스에 100 μL GNR(1 mg/mL)을 정맥 주사했습니다. 꼬리 정맥 주사 2일 후, 대조군과 결찰군은 식염수로 처리하였고 결찰+ 설사 군은 한약 추출물로 처리하였다. 치료의 용량은 일정하게 유지되었고 경구 위관 영양법(0.1 mL)을 통해 다음 7 일 동안 매일 전달되었습니다. 7일째에 마우스를 희생시키고 장 조직을 Tissue Tek OCT에서 동결시키고 Leica CM 1510 S cryostat(Sakura Funetek, USA)에서 절편화하였다. 섹션(8 μm)은 2광자 발광 이미징을 위해 양으로 하전된 슬라이드에서 수집되었습니다. 모든 마우스 대변은 주사 후 수집되었습니다. 대변의 무게를 측정하고 가열하에서 왕수로 소화시켰다. 마지막으로 ICP-MS(Agilent 7500a, USA)를 사용하여 용액의 금 성분 함량을 측정했습니다.
각 실험은 2회씩 3회 반복되었습니다. 결과는 평균 ± SD로 표시되었습니다. 통계적 차이는 t를 사용하여 평가되었습니다. P에서 테스트 및 고려 <0.05.
삼각형의 은나노플레이트는 빠른 열합성법으로 합성되어 우수한 수용성을 보였다. 더 중요한 것은 이러한 나노 입자의 특정 삼각형 모양으로 인해 전자 현미경으로 쉽게 식별할 수 있다는 것입니다. 도 1에 도시된 바와 같이, UV-vis 스펙트럼에서 제조된 은 나노입자는 648.5nm에서 in-plane 쌍극자 표면 플라즈몬 밴드에 해당하는 강한 피크를 보였고 더 낮은 파장에서 두 개의 완만한 피크를 보였다. nm) 및 평면외(333 nm) 사중극자 공명, 삼각형 구조의 형성을 나타내는 [36], 이는 원심분리 후 수집된 은 나노입자의 TEM 이미지에 의해 추가로 확인됩니다. TEM 이미지(그림 1b)는 준비된 배치에 은 나노구의 부분집단이 포함되어 있음을 보여주었고, 이는 아마도 389 nm에서 SPR 피크에 기여할 수 있었습니다[36]. 수집된 삼각형 은 나노플레이트의 가장자리 길이는 44.3 nm였으며 단분산 분포가 양호했습니다.
직경이 20 nm인 자성 나노입자와 직경이 5 nm인 Au 나노클러스터가 준비되었으며 이들의 특성은 각각 추가 파일 1:그림 S1 및 S2에 나와 있습니다. Au 나노로드의 TEM 이미지 및 UV/vis 스펙트럼은 추가 파일 1:그림 S3에 나와 있습니다.
CBD(Common Bile duct) 결찰은 간 담즙정체 섬유증을 유도하는 데 사용되는 잘 알려진 실험 모델입니다[37, 38]. 여기에서 우리는 HBS와 장관 사이의 연결을 완전히 차단하기 위해 CBD ligation으로 마우스에서 실험을 수행했으며(그림 2a, b), 금속 나노 플레이트가 정맥 주사 후 혈류에 의해서만 장 조직으로 전달되는지 확인했습니다. 정상 대조군과 비교하여 처리군은 담즙 정체로 인해 CBD 결찰 후 14 일에 총담관 벽의 직경과 두께가 크게 증가했습니다(그림 2d). 또한, 그림 2e와 같이 결찰군에서 TBIL과 AST의 수치가 대조군보다 유의하게 높았다. 이러한 결과는 CBD 결찰 마우스 모델을 성공적으로 구축한 후 총담관이 완전히 차단되었고 HBS와 장관 사이의 연결이 완전히 차단되어 담즙정체 및 간 담즙정체 섬유증을 유발함을 시사합니다[39].
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아 HBS와 장관의 관계에 대한 개략도. b, c CBD의 결찰(흰색 화살표). d CBD 결찰 후 14일째의 CBD 팽윤(흰색 화살표). 이 주요 간 기능 검사. *피 <0.05
일반적으로 장 상피는 다양한 크기와 특성을 가진 소량의 분자가 능동 및 수동 메커니즘 모두에 의해 손상되지 않은 상피를 통과할 수 있도록 하는 반투과성 장벽을 제공합니다. 일반적으로 분자가 클수록 이 장벽을 통과할 가능성이 줄어듭니다. 그러나 일단 장 내벽에 염증이 생기거나 손상되면 세포 사이의 공간이 열리면서 장 상피가 외부 및 큰 입자를 차단하기가 더 어려워집니다[40, 41]. 나노입자가 장 조직의 병리학적 변화와 이에 따른 장벽 투과성 증가의 원인이 될 수 있다는 점을 고려하여 나노입자가 장벽을 통과하도록 유도하는 장내 조직에 노출된 후 장 조직의 조직병리학적 검사를 수행하였다. 네 가지 다른 유형의 나노 입자:자성 나노 입자, 은 삼각형 나노 입자, 금 나노 막대 및 금 나노 클러스터. 그림 3에서 보는 바와 같이 대조군과 시험군 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았으며, 염증성 침윤과 같은 다른 조직학적 변화도 없었다[42]. 결과는 이러한 금속 나노 입자가 장 조직의 병리학 적 변화를 일으키지 않아 세포 사이의 공간에서 나노 입자가 누출 될 가능성을 제거한다는 것을 보여줍니다.
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CBD 결찰이 있는 마우스의 다양한 장 조직 샘플의 조직병리학적 미세절편. 아 대조군:꼬리 정맥을 통한 식염수 주사로 처리된 마우스(상단 패널). ㄴ 테스트 그룹:꼬리 정맥을 통해 주입된 삼각형 은 나노플레이트 현탁액으로 처리된 마우스(하단 패널)
GC는 장관 전체에 존재하는 4가지 주요 세포 유형 중 한 유형이며, 내장 내용물의 제거를 촉진하는 뮤신으로 알려진 고분자량 당단백질을 합성 및 분비함으로써 보호성 점액 담요의 생성 및 보존을 담당합니다. 섭취한 음식, 미생물 및 미생물 제품으로 인한 물리적, 화학적 손상에 대한 첫 번째 방어선을 제공합니다[43, 44]. GC는 점액 함량이 높기 때문에 쉽게 식별할 수 있습니다. 그림 6에서 보는 바와 같이 삼각형의 은나노플레이트는 장관 전체에 걸쳐 장내 위장관내에서 위치하였고, 위장관에서 분비되는 여러 단계를 알 수 있었다. 그림 4d는 일부 삼각형 은 나노플레이트가 GC에 의해 소화관으로 어떻게 분비되었는지 보여줍니다. 그림 4e는 장내 GC의 점액 내용물에 캡슐화된 일부 삼각형 은 나노플레이트가 분비될 준비가 되었음을 보여줍니다. 그림 4f에서는 일부 삼각형 은 나노플레이트가 GC에서 어떻게 배출되고 나머지는 여전히 GC에 있는지 표시됩니다. TEM 이미지에서 우리는 일부 삼각형 은 나노 플레이트가 응집 모드(그림 4(a2, d 및 e), 녹색 화살표)로 표시되는 반면 다른 일부는 분산 모드(그림 4(a1, b1, b2, c1, c2 및 f), 흰색 화살표). 응집은 나노입자의 일반적인 현상으로 일반적으로 세포 내에서 농도가 크게 증가할 때 관찰된다[45]. 반대로 나노입자의 농도가 감소하면 나노입자의 응집이 방지됩니다.
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CBD 결찰이 있는 마우스의 장 GC에서 삼각형 은 나노플레이트의 분포. CBD 결찰 마우스 그룹은 결찰 후 7 일에 꼬리 정맥을 통해 주입된 삼각형 은 나노플레이트를 처리했습니다. 다른 장 조직의 장 GC. A 십이지장, 삼각형 은 나노플레이트는 응집 모드(녹색 화살표)로 표시되는 반면, 일부 삼각형 은색 나노플레이트는 분산 모드(흰색 화살표)에 있습니다. 나 제주넘, 장 GC에 위치한 삼각형 은 나노플레이트(흰색 화살표). ㄷ Ileum과 일부 삼각형 은 나노 플레이트가 외부로 배출되었지만 일부는 여전히 내부에 있었습니다. 디 결장, 일부 삼각형 은 나노플레이트가 밖으로 분비되어 내장으로 들어갔습니다. 이 , F 직장, 일부 삼각형 은 나노플레이트는 배설할 준비가 되어 있는 반면(분산 모드, 흰색 화살표) 다른 것들은 여전히 내부에 있었습니다(응집 모드, 흰색 화살표)
추가 파일 1:그림 S4, S5, S6에서 볼 수 있듯이 금 나노클러스터, 자기 나노입자 및 금 나노막대에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다. 이러한 결과는 이 세 종류의 금속 나노입자가 장관의 GC 내부에 위치한다는 것을 분명히 보여주었고, 이러한 금속 나노입자가 GC 경로에 의해 제거될 수 있음을 간접적으로 뒷받침합니다.
GC는 장관의 전체 라인을 따라 분포되지만 전체 상피 부피에 대한 기여는 동일하지 않습니다. 마우스의 소장에서 GC의 부피 밀도는 십이지장에서 회장으로 점진적으로 증가합니다. 이러한 경향은 결장 상피의 GC 밀도가 결장에서 직장으로 근위부에서 원위부로 증가하면서 대장에서 계속됩니다[43]. 삼각형의 은나노플레이트, 자성나노입자, 금나노클러스터가 장관 전체에 걸쳐 장내 GC에 존재하고, GC가 전체 상피 부피에 기여하는 바가 전혀 다르다는 사실에 기초하여 대장이 주된 역할을 할 수 있다고 생각합니다. 장내 위장관의 배설 경로를 위한 배설 장소입니다.
독특한 모양으로 인해 삼각형 은 나노 플레이트는 GC에 도달하기 위해 제안된 경로에 설명된 위치에서 TEM 이미징으로 쉽게 구별되었습니다. 그러나 이 기술을 사용하여 자성 나노입자 및 금 나노클러스터를 다른 구조와 구별할 수 없었지만 추가 파일 1:그림 S4는 CBD 결찰 그룹의 장관에 여전히 일정량의 금 나노클러스터가 있음을 보여줍니다. 위에서 언급한 GC 배설 메커니즘은 다른 유형의 금속 나노 입자에도 적용된다는 결론입니다.
또한 추가 파일 1:그림 S7에서 볼 수 있듯이 ICP-MS 결과는 이러한 나노입자가 결찰 쥐의 몸에서 여전히 분비될 수 있음을 분명히 보여줍니다. 이러한 결과는 장조직의 술잔세포가 나노입자의 배설을 위한 중요한 경로에 관여함을 증명하였다.
위에서 언급한 결과는 이러한 4가지 종류의 금속 나노입자(자성 나노입자, 은삼각형 나노입자, 금 나노막대, 금 나노클러스터)가 장관 전체에 걸쳐 GC에 분포되어 있음을 보여주지만, 나노입자가 GC로 들어가는 방식은 여전히 해명. CBD 결찰이 있는 마우스 모델은 꼬리 정맥 주사를 통해 금속 나노입자 현탁액으로 처리되었기 때문에 이러한 나노입자는 혈류에 의해서만 장 혈관으로 수송될 수 있었습니다. TEM 이미징에 의해 밝혀진 바와 같이, 일부 삼각형 은 나노플레이트는 실제로 혈액 소체에 위치했습니다(그림 5a, 흰색 화살표). 또한, 이전 연구에서는 작은 크기의 나노 입자가 혈액 소체에 의해 순환계 전체에 전달될 수 있음을 밝혀냈습니다[46]. 그림 5b에서 삼각형 은나노플레이트 중 일부는 혈관의 막을 통과하는 반면(녹색 화살표), 일부 삼각형 은 나노플레이트는 혈구(빨간색 화살표)에 위치합니다. 따라서 그림 8에서 알 수 있듯이 삼각형의 은 나노플레이트가 혈액 소체에 의해 운반된 다음 혈장으로 방출된 후 장관 혈관벽의 막을 통과하여 최종적으로 GC에 도달했다고 추론합니다. <그림>
Distribution of triangular silver nanoplates in the intestinal vessels of mice with CBD ligation. 아 Triangular silver nanoplates located in the blood corpuscle (white arrows). ㄴ Triangular silver nanoplates penetrated into the vascular wall (green arrows), while some located in the blood corpuscle (red arrows)
Goblet cells play a key role in the excretion pathway of nanoparticles. In this study, we found that metal nanoparticles can be secreted from these goblet cells. Following this statement, if the secretion process of the goblet cells is accelerated, it would theoretically be possible that the excretion of nanoparticles will also increase. To address this, we established a diarrhea model induced by a Chinese herb used in traditional medicine. In order to explore how diarrheic processes influence the secretion of GCs, a histological analysis of the intestinal GCs was conducted. It must be acknowledged that an increased number of intestinal tissue goblet cells increases the mucin production [47]. As shown in Fig. 6, in the diarrhea groups, the total number of goblet cells in the small intestinal and the large intestinal were significantly higher compared to the controls. In addition, the percentage and number of cavitated goblet cells in the intestinal tissues were significantly higher in the diarrhea groups compared to the controls. These observations let us assert that the amount of intestinal tissue cells increases in response to diarrhea, suggesting an increased excretion by the GCs. These results are consistent with data reported previously [47].
Photomicrographs of intestinal tissue stained with Alcian Blue/Schiff’s reagent to visualize goblet cells. Images are representative of mice treated with saline (Ligation groups) and senna leaf (ligation + diarrhea groups) with arrows indicating non-cavitated goblet cell (green arrow) and cavitated goblet cell (red arrow) secreting mucin. All bars are 100 μm
It has been reported that the two-photon action cross-section (TPACS) of a nanorod can reach 2320 GM, which is much higher than that of organic fluorophores and within the range of that of quantum dots, providing a promising approach to detect the distribution of the gold nanorods in biological tissues using two-photon excitation [48, 49]. In this part of the study, in order to observe the intestinal distribution of nanoparticles in the ligation groups and the ligation + diarrhea groups, two-photon luminescence of the AuNRs core was measured. As shown in Fig. 7, the gold contents of small and large intestinal were significantly higher for the ligation groups compared with those observed in ligation + diarrhea groups. The gold elemental contents in intestinal tissues were quantified by ICP-MS 7 days after tail vein injection. The gold contents of intestinal tissues were significantly higher in the ligation groups compared to that in the ligation + diarrhea groups (P < 0.001) throughout the study (Fig. 7). These results indicate that the level of excreted nanoparticles by the goblet cells of the diarrhea groups is higher than that of any of the other groups.
Two-photon-laser scanning confocal microscopy images of intestinal tissue sections at 7 days after tail vein injection of GNRs (excitation 780 nm, emission 601–657 nm)
In the next experiment, we analyzed the gold contents in the feces of mice. As shown in Fig. 8a, the gold contents of feces were significantly higher in the control group compared to that in the ligation groups or the ligation + diarrhea groups (P <0.001). Moreover, in the ligation + diarrhea groups, the gold contents were significantly higher than in the ligation groups (Fig. 8a). These results suggest that diarrhea accelerates the process of nanoparticles being secreted by the intestinal goblets cells. Combined with quantitative analysis of gold elements in feces, we further proved that the goblet cells of intestinal tissues are involved in an important pathway for the excretion of nanoparticles.
Content of GNRs at the intestinal tissues 7 days after injection (a ), and gold element content of feces (b ) based on ICP-MS analysis. ***P < 0.01, showing a significant difference between ligation groups and ligation + diarrhea groups
Parietal cells are mainly distributed in the bottom of the stomach and the gastric body, which secrete hydrochloric acid and internal factor. Furthermore, we found that gold nanoclusters distributed in the gastric tissues of mice with CBD ligation (Additional file 1:Figure S4B). Therefore, we hypothesized that parietal cells may be involved in the excretion of nanoparticles. As expected, from two-photon luminescence images, it was found that gold nanorods are distributed in the gastric tissues (Fig. 9a, b). In addition, as Fig. 9c, d shows, we observed that triangular silver nanoplates are distributed in the parietal cells of gastric tissue. Combined with the previous research results, we speculate that the parietal cells are involved in the secretion of nanoparticles.
Distribution of nanoparticles in the gastric tissue. (아 ) 및 (b ):Two-photo-laser scanning confocal microscopy images of intestinal tissue sections 7 days after tail vein injection of GNRs (Excitation:780 nm, Emission:601-657 nm). (ㄷ ) TEM image of the gastric parietal cells; (d ) Triangular silver nanoplates located in the gastric parietal cells (white arrows)
In summary, we successfully prepared and applied triangular silver nanoplates, magnetic nanoparticles, gold nanorods, and gold nanoclusters as tracking agents. Mice with CBD ligation were treated with the previously prepared nanoparticles via tail vein injection to study the gastric-intestinal tissue distribution and excretion of these nanoparticles. We also analyzed the excretion pathways of gold nanoclusters and magnetic nanoparticles. It must be stated that gold nanoclusters are mainly cleaned away via kidney urinary pathway, whereas magnetic nanoparticles are mainly removed from the organism via HBS pathway. As the excretory capabilities of kidney and HBS for in vivo applications of metal nanoparticles are very limited, the GCs and PCs excretion pathway may provide another important alternative way for the excretion of these nanoparticles. Concerning this issue, we also found that the process of nanoparticles secreted from GCs and PCs is accelerated by diarrhea, further proving that the GCs and PCs represent an important pathway for the excretion of metal nanoparticles. Admittedly, our knowledge is still limited with respect to the in vivo clearance of nanoparticles as, for example, the concrete mechanism underlying the GCs and PCs secretion pathways, and the clearance efficiency of nanoparticles in intestinal GCs, thus further investigations are urgently needed. To sum up, this novel pathway of in vivo clearance of metal nanoparticles has great potential in short-term applications such as new drug design and development, nanoparticle-based labeling and in vivo tracking, and biosafety evaluation of in vivo nanoparticles.
Common bile duct
Charge-coupled device
Goblet cells
Gold nanorods
Hepato-biliary
Parietal cells
Superparamagnetic magnetite
투과전자현미경
Two-photon action cross-section
나노물질
초록 은 나노 입자를 포함한 나노 물질로 코팅된 항균 표면은 항생제 및 화학 약품 대신 사용할 수 있는 효과적인 대체 항균제로 간주됩니다. 그러나 이러한 물질의 잠재적 독성에 대한 보고는 생물의학 응용 분야에서의 사용 안전성에 대한 의문을 제기합니다. 이 연구의 목적은 은 나노 입자와 산화 그래핀을 착화시켜 은 나노 입자로 코팅된 폴리우레탄 호일의 인간 세포 독성을 줄이는 것이었습니다. Salmonella enteritidis로 은나노입자, 산화그래핀 및 은나노입자와 산화그래핀의 복합체로 코팅된 나노플랫폼의 항균활성을 평가했습니다
초록 전기방사된 고분자 나노섬유는 혈관 조직 공학에서 많은 관심을 받아왔다. 그러나, 느린 내피화 및 혈전증의 결핍을 갖는 기존의 나노섬유 재료는 혈관 조직 복구 및 재생 촉진에 효과적이지 않다. 본 연구에서는 다양한 양의 콘드로이틴 설페이트(CS)를 포함하는 생체모방 젤라틴(Gt)/폴리카프로락톤(PCL) 복합 나노섬유를 전기방사 기술을 통해 개발하여 항혈전성 및 내피 세포 친화도에 미치는 영향을 조사했습니다. PG 나노섬유의 다양한 CS 농도는 섬유 형태와 직경에 영향을 미칩니다. CS/Gt/PCL 나노섬유는 적절한 다공성(~
