PSA의 초고감도 전기화학적 감지를 위해 스크린 인쇄 전극에 직접 제작된 미세 유체 장치

초록

바이오마커 검출을 위한 저비용 미세유체 장치를 제작하는 방법은 큰 요구 사항을 가지고 있습니다. 여기에서, 전립선 특이 항원(PSA)의 전기화학적 감지를 위해 코팅 유리 용액으로 스크린 인쇄된 전극의 기판에 폴리디메틸실록산 미세유체 채널을 결합하는 새로운 미세유체 소자가 제작되었음을 처음으로 보고했습니다. 기존의 미세 가공 공정에 비해 이 방법은 간단하고 빠르며 저렴하며 대량 생산에도 적합합니다. 제조된 스크린 인쇄 전극 기반 미세유체 소자(CASPE-MFD)를 사용하여 인간 혈청에서 PSA를 검출하였다. 제조된 CASPE-MFD는 0.84 pg/mL(25.8fM)의 검출한계와 0.001~10 ng/mL 범위의 PSA 농도로 우수한 선형성을 나타내어 소형화, 저비용 전기화학적 개발에 대한 큰 가능성을 보여주었다. 인체 건강, 환경 모니터링 및 기타 응용 분야에 사용하기 위한 미세 유체 장치입니다.

<섹션 데이터-제목="배경">

배경

미세유체 시스템은 작은 부피(10⁻⁹ ~ 10⁻¹⁸ L) 수십에서 수백 마이크로미터의 치수를 가진 채널 내 [1]. 이 기술은 생물 의학, 환경 모니터링 및 식품 안전 분석에서 큰 잠재력을 보여주었습니다. 특히, 미세유체 장치(MFD)는 일반적으로 작은 풋프린트, 시약 소비 감소, 병렬 다중 시료 검출, 향상된 신뢰성, 감도, 높고 대규모 통합을 포함하여 다음과 같은 이점을 나타냅니다[2,3,4].

전기화학 센서는 샘플링, 유체 처리, 분리 및 기타 엔지니어링 감지 시나리오와 광범위하게 통합되고 하이픈으로 연결되었습니다[5]. 전기화학 센서는 높은 감도와 선택성, 신뢰할 수 있는 재현성, 지속적인 현장 분석을 위한 간단한 사용, 최소한의 샘플 준비, 비교적 저렴한 비용 및 짧은 시간 응답과 같은 수많은 이점을 나타내기 때문에 생체 분자 검출을 위한 전기화학 센서의 적용은 유망합니다. 전기화학 시스템은 미세유체 시스템에 쉽게 통합될 수 있으며[6, 7], 이는 시료 준비의 용이성, 우수한 감도 및 다용성, 부피가 큰 제거와 같은 기존 분석 플랫폼[8,9,10]에 비해 이점을 제공합니다. 광학 부품 [11, 12].

이 연구에서는 현장 진단을 위해 시판되는 스크린 인쇄 전극을 사용하여 전기화학적 감지 MFD를 제조하기 위해 간단하고 저렴하며 다양한 전략을 사용했습니다. 개발된 장치는 CASPE-MFD(시판되는 스크린 인쇄 전극 기반 미세유체 장치)로 정의되었습니다. PDMS(폴리디메틸실록산) 미세 유체 채널은 먼저 표준 포토리소그래피를 사용하여 패턴화되었으며 CASPE-MFD는 상업적으로 이용 가능한 스크린 인쇄 전극에 PDMS 미세 유체 채널을 직접 결합하여 제작되었습니다(그림 1). 스크린 인쇄된 전극은 졸-겔 방식을 사용하여 유리의 얇은 층으로 직접 사용 및 코팅되었습니다[13]. 그 후, PDMS 미세유체 채널은 표면의 플라즈마 처리 후 전극에 결합되었습니다. CASPE-MFD는 인산염 완충 용액(PBS) 및 혈청 샘플과 같은 생물학적 유체에서 다양한 분석물의 농도를 정량화할 수 있습니다. CASPE-MFD는 크로노암페로메트리(CA) 및 구형파 전압전류법(SWV)을 사용하여 PBS 완충액 및 인간 혈청 샘플에서 전립선 특이적 항원(PSA) 바이오마커의 검출 및 정량화를 입증하는 데 사용되었습니다. 이 기기에서 검출된 PSA는 높은 감도를 보였고 PSA의 검출한계(LOD)는 0.84 pg/mL(25.8fM)입니다. LOD는 상업용 분석에 대한 0.1 ng/mL 임상 검출 한계보다 100배 이상 더 민감하고[14], 다른 기기보다 더 우수합니다[3, 15, 16]. CASPE-MFD는 휴대가 간편하고 사용이 간편하며 시료 준비 및 분리 시스템과 같은 다른 구성 요소를 통합할 수 있는 가능성이 있습니다.

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아 SU-8 포토리소그래피에 의해 패턴화된 PDMS 미세유체 채널의 제조 공정. ㄴ 상업적으로 이용 가능한 스크린 인쇄 전극 기반 미세유체 소자의 제조 공정. CASPE-MFD는 PDMS 미세 유체 채널, 작업 및 상대 전극으로 인쇄된 2개의 금 전극, 의사 기준 전극으로 인쇄된 은 전극으로 구성됩니다. ㄷ 상업적으로 이용 가능한 스크린 인쇄 전극 기반 미세 유체 장치

자료 및 방법

화학 시약 및 재료

전립선 특이적 항원(PSA) 및 다중 클론 항-PSA 항체 양고추냉이 과산화효소(HRP)는 Petsec Energy Ltd.에서 구입했습니다. Biotinylated 항-PSA 항체, 스트렙타비딘 자기 비드, 소 혈청 알부민 및 하이드로퀴논은 Fisher Scientific에서 구입했습니다. 트윈-20, 과산화수소(H₂ O₂; 30%), 페로센카르복실산은 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. SU-8 2075는 MicroChem Corp.에서 구입했습니다. PDMS(폴리디메틸실록산) 예비 중합체 및 경화제는 Dow Corning에서 구입했습니다. 모든 면역시약은 KD Medical Solutions의 1x pH .4 PBS 완충액에 용해되었습니다. 모든 화학 시약은 Millipore Milli-Q 정수 시스템의 초순수로 준비되었습니다.

악기

형광 현미경은 Olympus U-CMAD3(Olympus, Japan)에서 수행되었습니다. μCSPE 장치는 플라즈마 클리너 PDC-32G(Harrick Plasma, USA)로 제작되었습니다. 모든 전기화학적 측정은 각각 작업 전극과 상대 전극으로 인쇄된 2개의 금 전극과 의사 기준 전극으로 인쇄된 은 전극으로 구성된 기존의 3전극 시스템을 사용하여 CHI 760B(CHI, 중국)에 의해 수행되었습니다(그림 1 ).

미세 유체 칩 제작

PDMS 미세 유체 채널은 표준 포토리소그래피를 사용하여 패턴화되었습니다. 간단히 말해서, 혼합 용액(H₂ SO₄ /H₂ O₂ =7/3)에 이어 초순수로 세척한 후 SU-8 2075 포토레지스트로 코팅했습니다. 그런 다음 웨이퍼를 65°C에서 7분 동안 베이킹한 다음 95°C에서 40분 동안 베이킹하여 용매를 제거하고 포토마스크를 통해 15초 동안 UV 광에 광노출시켰다. 전체 시스템은 중합을 안정화하기 위해 65 °C에서 5분 동안 구운 다음 95 °C에서 15분 동안 구워졌습니다. 중합되지 않은 포토레지스트는 실리콘 웨이퍼를 SU-8 현상액에 담그고 이소프로판올과 탈이온수로 세척하여 제거했습니다. PDMS 프리폴리머 용액과 경화제(10,1)의 혼합물을 앞에서 설명한 실리콘 웨이퍼 위에 주조하고 65°C에서 2시간 동안 경화시킨 다음 벗겨냈습니다[17].

상업적으로 이용 가능한 인쇄 전극은 졸-겔 접근법을 사용하여 유리 층으로 코팅되었습니다. 간단히 말해서, 테트라 에톡시 실란(TEOS), MTES, 에탄올 및 물을 1:1:1:1의 비율로 완전히 혼합하고 5분 동안 초음파 처리했습니다. 혼합물을 65 ℃의 오븐에 밤새 두었다. 전극을 유리 코팅 전에 80°C에서 5분 동안 핫 플레이트에 놓은 다음 전극 표면으로 혼합물이 침입하는 것을 방지하기 위해 브러시를 사용하여 전구체 혼합물을 도포했습니다. 전극은 도말 후 상온에서 건조되었다. PDMS 칩과 유리로 덮인 전극은 O₂로 처리되었습니다. 플라즈마를 30 동안 유지하고 서로 접착합니다.

크로노암페로즈미터 실험

Chronoamperometric 실험은 4.5 mM 하이드로퀴논과 0.1 mM 과산화수소 용액을 포함하는 1x pH .4 PBS에서 - 2.0 mV 단계 전위(은 유사 기준 전극 대비)에서 수행되었으며 0에서 PSA 농도에 대한 보정 곡선을 생성했습니다. ~ 10 ng mL⁻¹ . 간단히 말해서, 우리는 0.2 mg mL⁻¹ 의 50 μL를 주입했습니다. 50 μL min⁻¹ 속도로 μCSPE 장치에 대한 자기 비드 접합 항-PSA 항체 , 50 μL min⁻¹ 의 속도로 100 μL pH 7.4 PBS를 사용하여 철저히 세척 . 게다가, 50 μL의 블로킹 버퍼(0.05%(v /v ) 트윈 20 및 2%(w /v ) PBS 중 소 혈청 알부민(BSA))을 10 μL min^-1 의 속도로 주입했습니다. 37 °C 조건에서 30분 동안 배양하고 50 μL min^-1 의 속도로 100 μL pH 7.4 PBS를 사용하여 철저히 세척 . 그런 다음 50 μL의 서로 다른 농도의 PSA를 10 μL min^-1 의 속도로 주입했습니다. 37 °C에서 30분 동안 배양하고 50 μL min⁻¹ 의 속도로 100 μL pH 7.4 PBS를 사용하여 철저히 세척 . 또한, 50 μL의 HRP 결합 항-PSA 항체(1:1000 희석)를 10 μL min^-1 의 속도로 주입했습니다. , 37 °C에서 30분 동안 배양하고 50 μL min⁻¹ 의 속도로 100 μL pH 7.4 PBS를 사용하여 철저히 세척 . 마지막으로 4.5 mM 하이드로퀴논과 0.1 mM 과산화수소 용액이 포함된 1× pH 7.4 PBS 50 μL를 50 μL min⁻¹ 의 속도로 주입했습니다. . 피크 전류가 안정되면 세 번의 전류 측정값을 평균화하고 해당 표준 편차를 계산했습니다. 마지막으로 각 그룹에 대해 8회 반복하여 4mV의 일정한 전위에서 크로노암페로메트리를 구현했습니다. CASPE-MFD가 전기화학 실험 동안 항상 최상의 상태를 유지하도록 하기 위해, CASPE-MFD의 전극은 새로 준비된 0.5 MH_{2 SO₄ 순환 전압전류법을 사용한 솔루션. 깨끗한 다결정 금의 전형적인 볼타모그램 특성을 나타내었다. 그런 다음 CASPE-MFD를 초순수와 PBS 용액으로 세척했습니다.}

결과 및 토론

CASPE-MFD 준비

CASPE-MFD의 유용성을 조사하기 위해 균질 분포가 사용되었습니다. CASPE-MFD의 채널에 5μL/min의 유속으로 형광성 마이크로비드 용액을 주입한 결과, CASPE-MFD의 구석구석이 형광성 마이크로비드 용액으로 채워져 기포가 형성되지 않음을 알 수 있었다. (그림 2). CASPE-MFD의 견고성을 입증하기 위해 유속을 100 μL/min으로 증가시켰으며, 이는 이 장치가 분석물 검출에 적합함을 보여주었습니다.

<그림>

아 형광 이미지를 찍는 데 사용되는 스크린 인쇄 광전극. ㄴ CASPE-MFD의 형광 이미지. 우리는 작업 영역이 염료로 가득 차 있고 CASPE-MFD에 기포가 없음을 입증하기 위해 모델 형광 이미지로 광전극을 사용합니다. ㄷ 형광 이미지의 부분 확대도

제조 공정은 또한 그림 3과 같이 순환 전압전류법으로 조사되었습니다. Ferrocenecarboxylic acid는 모델 산화환원 활성 화합물로 사용되었으며 그림 3a는 다양한 전위 스캔 속도에 따른 산화 환원 피크 전류의 관계를 보여줍니다. CV 곡선의 산화환원 피크는 반응 속도가 전극 표면으로의 전기활성 종의 확산에 의해 지배되는 전형적인 가역적 전기화학 반응을 나타냅니다. 피크 음극 전위 사이의 전위 분리(E _PC ) 및 피크 양극 전위(E _아빠 )는 62 mV이며, 이는 페로센 산화환원 쌍에 대한 이론값 59 mV에 가깝습니다. 또한 피크 전위의 위치는 전위 스캔 속도와 양극 피크 전류(i _아빠 )는 음극 피크 전류(i _PC ) 10 ~ 350 mV/s 범위. 가역적 거동은 벌크 용액의 신호(추가 파일 1:그림 S1A)에 해당하며, 이는 부반응이 발생하지 않고 예상대로 전자 전달 동역학이 산화환원 표면 농도를 유지하기에 충분히 빠르다는 것을 나타냅니다. - Nernst 방정식에서 요구하는 값의 활성 종. 그림 3b는 양극 피크 전류(i _아빠 ) 및 음극 피크 전류(i _PC )는 스캔 속도의 제곱근에 비례하여 일반적인 확산 제어 프로세스를 의미합니다[18]. 또한 CASPE-MFD에서 측정된 전류는 대량 솔루션의 전류 값에 상당히 가깝습니다(추가 파일 1:그림 S1B). 이는 장치의 분석이 감도를 희생하지 않는다는 것을 나타냅니다.

<그림>

아 다양한 스캔 속도에서 CASPE-MFD의 0.1 M KCl 수용액(pH 7.0)에서 0.5 mM 페로센 카르복실산의 순환 전압전류도(y를 따라 오름차순) -축):10, 25, 50, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350 mV/s. ㄴ 양극(i _아빠 ) 및 음극 피크 전류(i _PC ) 대 정사각형 스캔 속도. 두 개의 선은 각각 회귀 방정식이 있는 선형 곡선을 나타냅니다. Y (나 _아빠 ) =0.9932X − 0.2563(R ² =0.9996, n =8); 예 (나 _PC ) =− 0.9384X − 0.1774(R ² =0.9996, n =8)

PSA 탐지에 대한 CASPE-MFD의 성능

최근 보고에 따르면 4-10 ng/mL 범위의 전립선특이항원(PSA) 농도는 일반적으로 전립선암의 존재 가능성이 높다는 것을 나타냅니다[19]. 따라서 준비된 CASPE-MFD의 성능을 평가하기 위한 대상으로 PSA를 선정하였다(Fig. 4). 그림 4a는 준비된 CASPE-MFD를 휴대용 전기화학 워크스테이션에 직접 연결할 수 있음을 보여줍니다. 도 4c에 도시된 바와 같이 자석을 이용하여 금전극(작업전극) 표면에 자기비드 결합 항PSA 항체를 고정화하였다. 그런 다음 준비된 CASPE-MFD의 미세유체 채널에 PSA 항원을 주입하고 작업 전극에 고정된 항-PSA 항체와 접합시켰다. 다음으로, HRP-변형된 항-PSA 항체를 PSA 항원과 접합시켰다. 크로노암페로메트리는 하이드로퀴논과 과산화수소가 생성하는 전기화학적 신호를 감지하는 데 사용되었습니다.

<사진>

아 전체 감지 장치. CASPE-MFD에 용액을 주입하기 위해 주사기 펌프가 사용되었고, 전기화학적 신호를 감지하기 위해 전기화학적 워크스테이션이 사용되었습니다. ㄴ PSA를 감지하는 데 사용되는 CASPE-MFD. Immunomagnetic bead-conjugated anti-PSA 항체에 용액을 주입구를 통해 주입하고 자석을 사용하여 자석 구슬을 포획했습니다. ㄷ PSA 항원 검출에서 CASPE-MFD의 개략도. Immunomagnetic bead-conjugated anti-PSA 항체는 자석을 사용하여 작업 전극에 고정되었습니다. PSA 항원을 CASPE-MFD에 주입하고 항-PSA 항체와 접합시켰다. 그런 다음 HRP-변형된 항-PSA 항체를 PSA 항원과 접합시켰다. 크로노암페로메트리는 하이드로퀴논과 과산화수소가 생성하는 전기화학적 신호를 감지하는 데 사용되었습니다.

Chronoamperometry는 다른 전류 측정 기술과 비교하여 더 나은 신호 대 잡음비를 제공하며[20,21,22,23,24], 전극에 기계적으로 고정된 얇은 유체 슬래브를 사용하면 분석보다 진동에 더 강합니다. 더 많은 양의 솔루션. 패러데이 확산 제한 전류의 경우 전류-시간 응답은 Cottrell 방정식으로 설명됩니다.

$$ i=\frac{nFA{D}^{\frac{1}{2}}C}{{\left(\pi t\right)}^{\frac{1}{2}}} $$

여기서 n 전자의 수, F 패러데이 상수(96,485C/mol), A 전극 면적(cm² ), 디 확산 계수(cm² /s) 및 C 농도(mol/cm³ ).

준비된 CASPE-MFD는 0 ~ 10 ng mL⁻¹ 농도의 일련의 분석 용액에서 PSA를 검출하는 데 사용되었습니다. . CASPE-MFD에서 PSA 감지에 대한 시간 전류 측정 응답은 그림 5a에 나와 있습니다. 피크 전류는 4.5 mM 하이드로퀴논과 0.1 mM 과산화수소를 포함하는 pH 7.4 PBS에서 PSA 농도가 증가함에 따라 증가했습니다. 그림 5b(파란색 선)에서 볼 수 있듯이 피크 전류는 0.001 ~ 10 ng/mL 범위에서 PSA 농도의 대수 값에 비례했으며 선형 회귀 방정식은 I (μA) =14.87 + 3.927 × log C _PSA (ng/mL) (R ² =0.9985, n =8). 낮은 검출 한계(0.84 pg/mL)와 좋은 선형 관계는 제조된 CASPE-MFD가 실제 사용에서 PSA를 검출하는 데 사용할 수 있음을 시사했습니다. 또한 그림 5c에서 구형파 전압전류법(SWV)을 사용하여 CASPE-MFD에서 서로 다른 농도의 PSA를 감지했습니다. SWV 응답은 또한 크로노암페로메트릭 결과와 일치했습니다.

<그림>

아 다양한 농도의 PSA 항원에 대한 시간 전류 측정 곡선(y을 따라 오름차순) 축):0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 ng/mL(4.5 mM 히드로퀴논 및 0.1 mM H₂ 포함) pH 7.4 PBS 완충액 O₂ CASPE-MFD의 − 2.0 mV 대 은 유사 기준 전극의 솔루션. ㄴ pH .4 PBS 완충액(파란색 선)과 인간 혈청(빨간색 선)에서 CASPE-MFD의 피크 전류와 PSA 항원 농도 사이의 선형 관계. 파란색 선의 선형 회귀 방정식은 Y입니다. =14.87 + 3.927 × X (R ² =0.9985, n =8), 빨간색 선의 선형 회귀 방정식은 Y =14.15 + 3.622 × X (R ² =0.9986, n =8). ㄷ 4.5 mM 하이드로퀴논 및 0.1 mM H₂를 포함하는 pH 7.4 PBS 완충액에서 다양한 농도의 PSA 항원에 대한 구형파 전압전류도 O₂ CASPE-MFD의 솔루션(y를 따라 오름차순 -축):각각 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 ng/mL. d 상이한 농도의 PSA 항원의 상응하는 선형 관계. 선형 회귀 방정식은 Y입니다. =34.53 + 9.246 × X (R ² =0.9884, n =8)

CASPE-MFD를 사용한 PSA의 선택적 감지

실제 샘플에 대한 장치의 가능한 적용을 확인하기 위해 크로노암페로메트리를 사용하여 인간 혈청 샘플에서 다양한 농도의 PSA를 분석했습니다. 추가 파일 1:그림 S2에서 얻은 결과는 4.5 mM 하이드로퀴논과 0.1 mM 과산화수소를 포함하는 인간 혈청에서 PSA 농도가 증가함에 따라 PSA의 피크 전류도 증가함을 보여줍니다. 또한 해당 검량선은 그림 5b(빨간색 선)와 같으며 선형 회귀식은 I (μA) =14.15 + 3.622 × log C _PSA (ng/mL) (R ² =0.9986, n =8). 두 그룹 사이에 통계적 차이가 거의 없었음을 알 수 있으며, 이는 준비된 CASPE-MFD가 실제 샘플에서 작동할 수 있음을 나타냅니다. 또한 CASPE-MFD는 표적 PSA에 대한 선택성이 우수하여 전립선 암 진단을 위한 임상 적용에 사용될 수 있음이 입증되었습니다.

결론

우리는 간단하고 저렴한 휴대용 상업용 스크린 인쇄 전극 기반 미세 유체 전기 화학 감지를 개발했습니다. 또한 PBS 버퍼 및 인간 혈청 샘플에서 PSA의 정량 분석을 위한 CASPE-MFD의 적용을 시연했습니다. 측정은 장치가 상용 스크린 인쇄 전극에 직접 제작되었기 때문에 좋은 감도와 재현성을 보여주었습니다. CASPE-MFD에는 5가지 장점이 있습니다. (i) 가볍고 휴대가 간편하며 다용도로 사용됩니다. (ii) 표준화되어 있습니다. (iii) 높은 감도와 정확도로 재현성이 뛰어납니다. (iv) 사용하기 쉽고 전문 의료진이나 복잡한 도구가 필요하지 않습니다. (v) 고밀도 감지 시스템을 소형 장치에 통합할 수 있습니다. 게다가, 소형화된 포텐시오스타트를 사용하면 CASPE-MFD를 현장 또는 가정 진단이 가능하게 만들 수 있습니다. 또한, 상용 전극과 손쉬운 제작으로 CASPE-MFD의 표준화 및 산업화를 달성할 수 있습니다. 따라서 우리는 이 플랫폼이 소분자(나트륨, 칼륨, 염화물, 포도당), 암 표지자(B형 나트륨 이뇨 펩티드 또는 BNP, 트로포닌 I), 세포(CD<하위>4 ) 및 핵산(DNA, RNA).

약어

MFD:: 미세유체 장치
CASPE-MFD:: 스크린 인쇄 전극 기반 미세 유체 장치
PDMS:: 폴리디메틸실록산
PSA:: 전립선 특이적 항원
캐나다:: 크로노암페로메트리
SWV:: 구형파 전압전류법
LOD:: 감지 한계
HRP:: 양 고추 냉이 과산화 효소
TEOS:: 테트라 에톡시 실란
MTES:: 준안정 전이 방출 분광법
BNP:: B형 나트륨 이뇨 펩티드

극저 압전 노이즈를 가진 초전 센서에 대한 친수성 처리에 의해 촉발된 PVDF 필름의 자기 분극 에너지 변환 및 디스플레이 애플리케이션을 위한 이중 기능 태양 전지의 광자 설계 및 전기적 평가

나노물질