sp-ICP-MS를 위한 전처리 방법의 최적화 및 평가를 통해 체내 은 나노입자 분포를 밝혀냄
초록
공학 나노 입자(ENP)의 일반적인 사용은 이러한 입자에 대한 노출을 증가시켰습니다. 현재 사용 가능한 분석 기술은 생물학적 조직에서 ENP의 물리적 특성을 동시에 정량화하고 분석하지 못합니다. 따라서 ENP에 대한 노출 조건을 평가하기 위한 새로운 방법이 필요합니다. 단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분석기(sp-ICP-MS)는 ENP의 정량적 및 정성적 분석을 수행할 수 있는 매력적인 접근 방식입니다. 그러나 생물학적 조직에서 ENP를 효과적으로 회수할 수 있는 전처리 방법이 없기 때문에 생물학적 시료에 대한 이러한 접근 방식의 적용은 제한적입니다. 본 연구에서는 은 나노입자(nAg)를 모델로 하여 생물학적 조직 내 ENP의 sp-ICP-MS 분석을 위한 다양한 전처리 방법을 평가하고 최적의 전처리 조건을 확인하였다. 전처리 용매로 5가지 시약(수산화나트륨, 수산화테트라메틸암모늄, 질산, 염산 및 프로테나제 K)을 스크리닝했습니다. 우리의 결과는 수산화나트륨 처리가 마우스 간에서 nAg를 검출하는 데 최적임을 보여주었습니다. 또한, 이 전처리 방법은 심장, 폐, 비장, 신장과 같은 다른 장기에도 적용될 수 있습니다. 마지막으로 nAg 또는 은 이온을 정맥주사한 후 쥐의 혈액과 간에서 은의 양과 물성을 분석하여 이 방법의 적용 가능성을 평가하였다. 우리의 sp-ICP-MS 방법은 혈액에 투여된 nAg가 부분적으로 이온화되어 간에서 입자 형태(약 80%)로, 혈액에서 이온 형태(약 95%)로 분포하는 경향이 있음을 보여주었습니다. 결론적으로 생물학적 조직에서 ENP의 sp-ICP-MS 평가를 위한 전처리 전략을 최적화하고 간 및 혈액에서 nAg의 물리적 특성 변화를 평가하여 적용 가능성을 입증했습니다. 우리는 또한 nAg의 입자 형태에서 이온 형태로의 부분적 변화가 마우스에 투여되었을 때 nAg의 동역학 및 분포에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다.
소개
최근 나노기술의 발전으로 100 nm보다 작은 공학 나노입자(ENP)의 개발이 가속화되었습니다. ENP는 다른 초소형 또는 대형 물질에 비해 조직 투과성 및 표면 반응이 우수하여 화장품, 식품, 의약품 등 다양한 제품에 널리 사용되고 있다[1, 2]. 예를 들어, 가장 일반적인 ENP 중 하나인 은 나노입자(nAg)는 Ag
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의 꾸준한 방출 때문에 항생제에 사용됩니다. . 또한 인쇄 전자 기술에서 전도성 재료로 활용됩니다[3]. 대조적으로, nAg의 작은 입자 크기와 관련된 독특한 물리화학적 특성은 위험할 수 있습니다. 이러한 입자는 혈뇌장벽을 파괴하고 염증을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다[4]. 일상적인 사용 제품에서 ENP의 사용이 증가함에 따라 인간은 다양한 유형의 ENP에 노출되었습니다. 지속적인 사용은 안전성을 결정하기 위해 평가되어야 합니다[2, 3].
안전성을 확보하기 위해서는 ENP의 "위험성"에 대한 이해가 필수불가결한 것으로 "위험성"(잠재적 독성)과 "노출 조건"의 통합 개념입니다. ENP의 위험성은 전 세계적으로 분석되었지만 ENP에 대한 노출 상황을 조사한 연구는 거의 없습니다[5]. 또한, 최근에 배양된 세포에 혼입된 nAg의 세포내 분포가 Ag
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의 세포내 분포와 다르다는 보고가 있었습니다. [6] 그리고 그 Ag
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마우스 조직의 미립자 [7]. 따라서 입자 크기와 같은 물리적 특성을 평가하고 체내에서 입자와 이온을 구별할 필요가 있다[3, 6,7,8].
현재 사용 가능한 분석 기술을 사용하여 체내 ENP의 물리적 특성을 정량적으로 분석하는 것은 어렵습니다. ICP-MS(Inductively coupled plasma-mass spectrometry)는 정량 분석에는 적합하지만 이온 및 입자와 같은 모든 대상을 정량화하는 동안 구별할 수 없기 때문에 물리적 특성 분석에는 적합하지 않습니다. 대조적으로 투과전자현미경(TEM)은 조직의 일부만 관찰되기 때문에 물리적 특성을 분석하는 데 적합하지만 ENP를 정량화하는 데에는 적합하지 않습니다. 따라서 ENP의 생체 변형 연구를 위한 ENP의 동시 물성 분석과 정량 분석을 위한 새로운 방법이 필요합니다.
ICP-MS를 기반으로 하는 단일 입자-ICP-MS(sp-ICP-MS)는 체류 시간당 하나의 입자를 분석기에 도입하거나 전혀 도입하지 않으며 분석을 통해 피크 강도 및 입자 농도를 분석하여 입자 크기를 결정하는 매력적인 방법입니다. 최고 요금. 입자와 이온은 피크 신호와 배경 신호를 분석하여 구별할 수 있습니다[9]. 몇몇 이전 연구에서는 ENP의 정량화 및 물리적 특성 분석을 위해 sp-ICP-MS를 사용했다고 보고했습니다[10, 11].
그러나 이들 연구는 대부분 sp-ICP-MS를 사용하여 환경수 또는 ENP를 포함하는 상용 제품을 분석하고[10, 11], 일부 연구에서는 생물학적 조직에 sp-ICP-MS를 채택했습니다. 또한, 이러한 연구는 단백질 분해효소 K 소화 또는 TMAH(테트라메틸 암모늄 하이드록사이드)로 조직을 전처리하여 단백질 및 지질 매트릭스를 가용화했습니다. 시약마다 가용화 특성이 다르기 때문에 전처리 방법의 차이가 조직에 분포된 ENP의 회수율에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 전처리 방법은 ENP의 크기나 이온 특성에 영향을 미치지 않고 조직에 분포된 ENP를 효율적으로 복구하는 것이 중요합니다.
이 연구에서 우리는 nAg를 모델 ENP로 사용하여 체내 ENP의 양과 물리적 특성을 결정하기 위해 생물학적 시료에서 sp-ICP-MS에 대한 다양한 전처리 방법을 평가하고 최적화했습니다.
자료 및 방법
ENP
30, 70 및 100 nm "Biopure" nAg(nAg30, nAg70 및 nAg100)는 nanoComposix(San Diego, CA, USA)에서 구입했습니다. RM8013은 운송 효율성을 계산하기 위한 표준으로 사용되었으며 National Institute of Standards and Technology(Gaithersburg, MD, USA)에서 얻었습니다. 각 유형의 ENP는 사용하기 전에 10 분 동안 초음파 처리되었습니다.
BALB/c 마우스(암컷, 6 주)는 Japan SLC(Shizuoka, Japan)에서 구입했습니다. 마우스를 12시간의 명암 주기(8:00에 켜고 20:00에 소등)가 있는 방에 수용했습니다. 음식과 물은 임의로 제공되었습니다. 실험 프로토콜은 일본 오사카 대학의 윤리 지침을 준수했습니다.
동적 광산란으로 입자 크기 분포 측정
nAg를 10 μg/mL의 최종 은(Ag) 농도로 밀리Q 물에 희석했습니다. 다음으로, 크기 및 제타 모세관 셀(Malvern Instruments, Malvern, UK)에 1 mL의 용액을 채워 Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments)로 입자 분포 및 평균 직경을 측정했습니다.
은의 총 질량 측정
샘플의 총 Ag 농도를 측정하기 위해 Agilent 7700x(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)가 사용되었습니다. 분석 조건은 RF power 1550 W, Carrier gas 1.05 L/min Ar, 그리고 Dwell time 100 ms였다. 측정은 MS 모드에서 3회 반복되었습니다. 내부표준법을 사용하였으며, Ag의 내부표준물질은 로듐을 사용하였다. ICP-MS 분석의 대상 요소는
103
이었습니다. Rh 및
107
Ag. Ag 및 로듐 표준 용액은 Wako(일본 오사카)에서 입수했습니다.
sp-ICP-MS 분석 및 계산
sp-ICP-MS 분석을 위해 총 Ag 분석과 유사한 Agilent 7700x(Agilent Technologies; Santa Clara, CA, USA)를 사용했습니다. 분석 조건은 RF 전력 1550 W, 캐리어 가스 1.05 L/min Ar, 체류 시간 10 ms, 분석 시간 30 s였다. 입자 크기를 계산하기 위해 RIKILT에서 발행한 단일 입자 계산 도구가 사용되었습니다[12].
sp-ICP-MS용 중요 입자 농도
스톡 nAg 용액 농도는 1.0 mg/mL였으며, 이는 2000, 800, 700 및 600 pg/mL 용액을 준비하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 이들 용액 각각을 10배 연속 희석하여 40개의 다른 nAg 용액을 얻었다. 이 40개 샘플의 입자 농도를 sp-ICP-MS로 측정했습니다.
마우스 간 전처리 방법 최적화
마우스에서 수집한 간을 인산완충식염수(PBS)와 혼합했습니다(w /v 1:10의 비율) 그런 다음 균질화합니다. 균질물을 100 ng/mL nAg 용액과 혼합하였다. 그런 다음 혼합물을 v에서 다음 시약 중 하나로 처리했습니다. /v 1:1-0.1 mol/L NaOH 용액, 25% TMAH, 30% HCl 또는 proteinase K 용액(10 U/mL proteinase K, 0.01 M Tris-HCl, 0.01 M EDTA 및 0.5% SDS)의 비율. 샘플을 37 °C에서 3 시간 동안 인큐베이션하고 잔류물을 수집하고 무게를 쟀습니다. 상층액을 500배 희석하고 sp-ICP-MS로 분석했습니다.
다양한 기관에서 NaOH 전처리의 다양성 평가
마우스에서 수집한 심장, 폐, 비장 및 신장을 PBS(w /v 1:10의 비율), 균질화 및 100 nm/mL nAg와 혼합. 다음으로, v에서 1 mol/L NaOH 용액 /v 1:1의 비율로 첨가하고 37 °C에서 3 시간 동안 인큐베이션했습니다. 인큐베이션 후, 잔류물을 수집하고 무게를 잰다. 상층액을 500배 희석하여 sp-ICP-MS로 분석하였다.
nAg100 및 Ag의 수량 및 물리적 특성 평가
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단일 정맥 투여 후 마우스에서
정맥내 투여의 경우, nAg100 및 AgNO3 0.25 mg/mL로 희석했습니다(Ag
+
). ) 5% 포도당 용액. BALB/c 마우스에 nAg100(1.5 또는 0.75 mg/kg), AgNO3를 정맥내 투여했습니다. (Ag
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로 1.5 또는 0.75 mg/kg ), 또는 5% 포도당 용액(대조군). 24시간 후, 희생된 마우스의 혈액과 간을 수집하였다. 간은 PBS(w /v 1:10의 비율) 및 균질화. 혈액 및 간 균질물을 TMAH 용액과 혼합했습니다(v /v 1:1의 비율) 및 NaOH 용액(v /v 1:1의 비율), 각각. 이 샘플을 ICP-MS로 분석하여 Ag 농도를 측정하고 sp-ICP-MS로 분석하여 입자 크기 및 입자와 이온 간의 구별과 같은 물리적 특성을 평가했습니다.
결과 및 토론
sp-ICP-MS에 의한 입자 검출 최적화
sp-ICP-MS 분석에서는 체류 시간당 하나의 입자를 검출기에 도입하거나 전혀 도입하지 않는 것이 중요합니다. 체류 시간 동안 여러 입자가 검출기에 도입되면 여러 입자의 총 질량은 단일 입자의 질량으로 간주됩니다[13]. 따라서 sp-ICP-MS 분석을 위해서는 샘플을 충분히 희석해야 합니다. 대조적으로, ENP 농도가 매우 낮은 샘플의 sp-ICP-MS 분석은 부정확한 입자 분포 및 크기 데이터로 이어집니다.
nAg100의 농도와 검출된 입자 수 사이의 관계를 결정하기 위해 sp-ICP-MS로 평가하기 위해 nAg100 스톡 용액을 연속적으로 희석했습니다. 그 결과 상대적으로 낮은 Ag 농도 영역에서 검출된 입자의 수가 이론적으로 선형적으로 증가함을 보여주었다. 대조적으로 상대적으로 더 높은 Ag 농도에서 검출된 입자의 수는 이론값보다 적었습니다(그림 1a). 이 데이터는 더 높은 Ag 농도에서 여러 입자가 각 체류 시간 동안 검출기에 도입되는 경향이 있어 입자 크기가 과대평가됨을 나타냅니다. 따라서 입자크기를 정확하게 평가하기 위해서는 이론값과 다르지 않은 검출 입자의 최대 개수를 결정하는 것이 필요하다. 다음으로 이론값에서 검출된 입자의 수를 빼고 그 차이를 세로축으로 표시했습니다. 그 결과, 검출된 입자의 수가> 500개일 때 크기 추정의 불일치가 발생함을 나타내었고, 이는 분석 시간 동안 ≤ 500개 입자를 검출할 필요가 있음을 시사한다(그림 1b). 이러한 데이터는 단일 시도에서 얻었지만 실험을 반복해도 동일한 결과를 나타냈습니다(데이터는 표시되지 않음).