sp-ICP-MS를 위한 전처리 방법의 최적화 및 평가를 통해 체내 은 나노입자 분포를 밝혀냄

결과 및 토론

sp-ICP-MS에 의한 입자 검출 최적화

sp-ICP-MS 분석에서는 체류 시간당 하나의 입자를 검출기에 도입하거나 전혀 도입하지 않는 것이 중요합니다. 체류 시간 동안 여러 입자가 검출기에 도입되면 여러 입자의 총 질량은 단일 입자의 질량으로 간주됩니다[13]. 따라서 sp-ICP-MS 분석을 위해서는 샘플을 충분히 희석해야 합니다. 대조적으로, ENP 농도가 매우 낮은 샘플의 sp-ICP-MS 분석은 부정확한 입자 분포 및 크기 데이터로 이어집니다.

nAg100의 농도와 검출된 입자 수 사이의 관계를 결정하기 위해 sp-ICP-MS로 평가하기 위해 nAg100 스톡 용액을 연속적으로 희석했습니다. 그 결과 상대적으로 낮은 Ag 농도 영역에서 검출된 입자의 수가 이론적으로 선형적으로 증가함을 보여주었다. 대조적으로 상대적으로 더 높은 Ag 농도에서 검출된 입자의 수는 이론값보다 적었습니다(그림 1a). 이 데이터는 더 높은 Ag 농도에서 여러 입자가 각 체류 시간 동안 검출기에 도입되는 경향이 있어 입자 크기가 과대평가됨을 나타냅니다. 따라서 입자크기를 정확하게 평가하기 위해서는 이론값과 다르지 않은 검출 입자의 최대 개수를 결정하는 것이 필요하다. 다음으로 이론값에서 검출된 입자의 수를 빼고 그 차이를 세로축으로 표시했습니다. 그 결과, 검출된 입자의 수가> 500개일 때 크기 추정의 불일치가 발생함을 나타내었고, 이는 분석 시간 동안 ≤ 500개 입자를 검출할 필요가 있음을 시사한다(그림 1b). 이러한 데이터는 단일 시도에서 얻었지만 실험을 반복해도 동일한 결과를 나타냈습니다(데이터는 표시되지 않음).

정확한 sp-ICP-MS 분석을 위한 체류 시간당 최적 입자 수 결정. 일련의 nAg 용액(600 fg/mL ~ 2,500 pg/mL)을 sp-ICP-MS로 분석했습니다. 아 nAg100의 농도와 검출된 입자의 수 ​​사이의 관계를 결정하기 위해 검출된 입자에 대한 곡선(실선) 이론값(점선)을 플로팅했습니다. ㄴ 이론값에서 검출된 입자의 수를 뺀 값을 수직축에 표시하여 최적의 입자 수를 결정했습니다. 각 포인트는 단일 시도의 결과입니다(n =1)

분석 조건을 검증하기 위해 다양한 직경(nAg30, nAg70, nAg100)으로 nAg를 희석하여 분석 시간당 500개 미만의 입자를 검출하고 직경을 평가했습니다. sp-ICP-MS 분석은 nAg30, nAg70, nAg100의 1차 직경이 각각 30.0 ± 1.2, 65.1 ± 0.6, 97.4 ± 0.6임을 나타냈다. 또한, 동적 광산란(DLS)에 의해 결정된 유체역학적 직경은 각각 36.4 ± 1.6, 70.6 ± 1.7 및 101 ± 1.0이며, 이 값은 sp-ICP-MS에 의해 추정된 값과 유사합니다. 이러한 발견은 sp-ICP-MS 조건이 다양한 크기의 나노입자의 직경을 측정하는데 적합함을 시사한다.

마우스 간 조직에서 nAg 검출을 위한 전처리 방법 최적화

체내 ENPs의 물리적 특성을 정량화하고 결정하기 위해서는 조직을 완전히 용해시키는 것이 필요합니다. 또한, 입자에 물리적, 화학적 변화를 일으키지 않고 체내에 분포된 입자와 이온을 효율적으로 회수하는 것이 필수적입니다. NaOH, TMAH, HNO₃의 5가지 가용화 시약을 테스트했습니다. , HCl 또는 proteinase K를 사용하고 sp-ICP-MS로 수량 및 물리적 특성을 분석하여 간을 모델로 사용하여 전처리 전략을 최적화합니다[14,15,16,17,18].

간 균질액을 nAg100과 혼합하여 100 ng/mL의 최종 Ag 농도를 얻은 다음 37 °C에서 각 가용화 시약으로 처리했습니다. 먼저 조직 용해도의 지표로 조직 잔류물의 양을 평가했습니다. 조직의 90% 이상이 NaOH, TMAH 및 proteinase K 처리에 의해 용해된 반면 조직의 75%만이 HNO₃에 의해 용해되었습니다. 및 HCl 처리(그림 2a). 조직의 거의 80%가 물로 구성되어 있음을 고려하면[19], HNO₃ , HCl 및 PBS 처리는 불용성 조직 기질을 용해시키는 데 비효율적이었습니다. 대조적으로, NaOH, TMAH 및 proteinase K 처리는 조직의 불용성 기질을 효율적으로 용해시켜 조직에서 nAg를 정확하게 정량화하는 데 적합함을 나타냅니다. 다음으로 각 입자와 이온의 회수율을 분석하여 처리에 따른 물성의 변화를 평가하였다. Sp-ICP-MS 분석은 nAg100이 산성 시약(HNO₃ 및 HCl) 및 proteinase K로 처리될 때 부분적으로 이온화되었다. 이것은 산성 시약과 proteinase K가 입자를 용해시키고 이들을 이온으로 전환시킴을 시사하였다. 대조적으로, 조직이 알칼리성 시약(NaOH 및 TMAH)으로 처리될 때 초기 첨가량에 해당하는 100 ng/mL Ag가 입자로 검출되었다. 알칼리 처리 후에는 이온이 거의 검출되지 않았으며(그림 2b), NaOH와 TMAH가 nAg 물리적 특성을 유지했음을 나타냅니다. 마지막으로 물리적 특성을 자세히 분석하기 위해 서로 다른 시약으로 처리한 조직의 입자 직경 분포를 평가했습니다. 평균 입자 직경은 TMAH 처리 후 100 nm에서 120으로 변경되었습니다(그림 2c). 또한, 입자는 TMAH 처리 후 더 넓어졌으며(그림 2d), 입자 응집을 나타냅니다. 대조적으로, 조직에 NaOH를 처리한 경우, 평균 입자 직경은 초기 입자 크기에 해당하는 100 nm에 가까웠다. 이것은 NaOH 전처리가 마우스 간 조직에서 nAg100을 검출하기 위한 최적의 조건임을 시사합니다.

NaOH 전처리는 마우스 간에서 nAg100을 검출하는 최적의 방법입니다. 5가지 가용화 시약을 조직을 용해하기 위한 전처리 용매로 스크리닝했습니다(NaOH, TMAH, HNO₃ , HCl 및 프로테이나제 K). 간 균질액을 nAg100 용액과 혼합하여 최종 Ag 농도가 100ng/mL이 되도록 하고 37°C에서 각 가용화 시약으로 처리하였다. 3 시간 후 a 조직 용해도의 지표로서 각 그룹의 잔류율, b 회수율(검은색 막대와 흰색 막대는 각각 입자 및 이온으로 검출된 은의 비율을 나타냄), c 막대 차트에 표시된 평균 입자 직경 및 d 꿀벌 벌레 차트에 표시된 입자 크기 분포는 sp-ICP-MS 분석으로 분석되었습니다. 결과는 평균 ± SD(n =3)

TMAH 전처리는 다양한 연구에서 sp-ICP-MS 분석에 널리 사용되었습니다. TMAH는 점도 및 pH와 같은 다양한 물리적 특성에 따라 nAg100의 응집을 유도할 수 있습니다. 또한 유전 상수는 응집과 관련이 있을 수 있습니다. 3 h 동안의 TMAH 처리는 TMAH가 트리메틸아민(TMA)과 메탄올로 분해되어 발생하는 유전 상수를 증가시킬 수 있습니다[20]. 유전율이 증가하면 유전율에 반비례하는 nAg100의 제타 전위가 거의 0이 되어 nAg와 응집 유도 사이의 정전기적 반발력이 손실됩니다. 짧은 시간(1 min) 동안 TMAH로 nAg100을 처리하면 평균 입자 크기가 약 100 nm가 됩니다(데이터는 표시되지 않음).

다양한 기관에서 NaOH 전처리의 다양성 평가

nAg 검출을 위한 NaOH 전처리의 다용성을 평가하기 위해 우리는 다양한 마우스 장기(심장, 폐, 신장, 비장)를 NaOH로 처리하고 입자 검출을 위해 sp-ICP-MS를 수행했습니다. 먼저 조직 용해도의 지표로 조직 잔류물의 양을 평가했습니다. 95% 이상의 조직 가용화는 NaOH 처리에 의해 달성되었습니다(그림 3a). 또한, 첨가량에 해당하는 Ag가 입자로 검출되었다(Fig. 3b). 일부 회복율은 100%를 초과했지만 미국 식품의약국(FDA) 기준에 따르면 회복율은 80~120%이면 충분히 신뢰할 수 있다고 합니다[21]. 따라서 우리의 분석은 신뢰할 수 있습니다. 또한 모든 장기에서 검출된 nAg의 평균 입자 직경은 첨가된 nAg의 입자 크기에 해당하는 100 nm에 가까웠습니다(그림 3c, d). 이러한 연구는 NaOH 전처리가 마우스 간뿐만 아니라 마우스 심장, 폐, 신장 및 비장에서도 nAg를 검출하는 데 이상적임을 시사합니다.

NaOH 전처리는 다양한 장기에서 nAg100을 검출하는 최적의 방법입니다. 그림 2에서와 같이 심장, 신장, 폐 및 비장의 균질물을 nAg100과 혼합하고 NaOH 용액과 함께 배양했습니다. 3 시간 후 a 잔류율(검은색 막대와 흰색 막대는 각각 NaOH 또는 PBS 처리의 잔류율을 나타냄), b 회수율(검은색 막대와 흰색 막대는 각각 입자 및 이온으로 검출된 Ag의 비율을 나타냄), c 꿀벌 벌레 차트에 표시된 평균 입자 직경 및 d 꿀벌 벌레 차트에 표시된 입자 크기 분포는 각 조직 샘플에서 sp-ICP-MS 분석으로 분석되었습니다. 결과는 평균 ± SD(n =3)

종합하면, 우리의 결과는 NaOH 전처리가 sp-ICP-MS에 의한 동물 조직의 nAg 정량화 및 물리적 특성 분석을 위한 최적의 전처리 전략임을 보여줍니다.

nAg 및 Ag의 정량적 및 물리적 특성 분석을 위한 sp-ICP-MS 평가 ⁺ 생물학적 조직에서

nAg는 체내에서 이온화되거나 Ag ⁺ 이 과정의 세부 사항은 불분명하지만 마우스 조직의 미립자. 따라서 우리는 nAg100 또는 Ag ⁺ 의 단일 정맥 투여 후 마우스 혈액 및 간에서 Ag의 양과 물리적 특성을 모두 분석하여 sp-ICP-MS의 실제 적용을 평가했습니다. . ICP-MS 분석 결과 Ag ⁺ 혈액에서 모두 Ag가 검출되었습니다. - 및 nAg100 처리된 마우스(그림 4a). 또한, Ag는 두 그룹의 간에서 검출되었습니다(그림 4b). 다음으로, 각 샘플에서 Ag의 물리적 특성을 분석했습니다. 두 Ag ⁺ 의 혈액에서 소량의 nAg가 검출되었기 때문에 - 및 nAg100 처리된 마우스에서 가장 많이 검출된 Ag는 이온 형태였다(그림 4c). 간 샘플에서 nAg100 처리 마우스에서 약 80%의 Ag가 입자로 검출된 반면 Ag ⁺ 에서는 소량의 nAg가 검출되었습니다. -처리된 마우스(그림 4d). 마지막으로 sp-ICP-MS에 의해 nAg100 처리된 마우스의 간 입자 크기를 평가한 결과 입자 크기가 약 80 nm인 것으로 나타났습니다(그림 4e). 이 데이터는 Ag ⁺ 혈액에 투여하면 입자로 거의 변하지 않고 Ag ⁺ 의 물리적 성질이 혈액과 간에서 변경되지 않았습니다. 대조적으로, 혈액에 투여된 nAg100은 부분적으로 이온화되었고; 간에서 Ag의 20%와 혈액에서 대부분의 Ag는 이온 형태였습니다. 부분 이온화의 결과, 간 조직에서 nAg의 평균 직경은 초기에 투여된 입자의 평균 직경보다 작았다(80 vs 100 nm). 결과적으로, 우리의 생물학적 샘플 적용 가능한 sp-ICP-MS 전략은 혈액에 투여된 nAg100이 간에서 입자(약 80%)로, 혈액에서 이온(약 95%)으로 분포하는 반면 ICP-MS 방법은 입자의 물리적 또는 화학적 변화가 아닌 Ag 양만 평가합니다.

정맥 투여된 nAg100 및 Ag ⁺ 의 동시 정량화 및 물리적 특성 분석 . nAg100 및 Ag ⁺ 마우스에 정맥내 투여하였다(0.75 또는 1.5 mg/kg). 24 시간 후, 그들의 간과 혈액을 수집하였다. 모든 샘플은 NaOH 용액으로 전처리되었습니다. a의 Ag 농도 혈액 및 b 간은 ICP-MS에 의해 측정되었습니다. c의 nAg 혈액 및 d 간은 sp-ICP-MS에 의해 측정되었습니다. 간에서 검출된 입자의 평균 직경은 e로 표시됩니다. . 결과는 평균 ± SE(n =3)