sp-ICP-MS 전처리 최적화: 생체 조직 내 은 나노입자 분포 규명

요약

인공 나노입자(ENP)의 급속한 보급으로 인체 노출이 증가하고 있으나, 기존 분석 도구로는 생체 기질 내 ENP의 정량화와 특성 분석을 동시에 수행하기 어렵습니다. 단일입자 유도결합플라즈마 질량분석법(sp-ICP-MS)은 동시 정량화와 물리적 특성 평가가 가능하지만, 입자 무결성을 해치거나 회수율을 낮추는 부적절한 전처리 프로토콜로 인해 조직 적용이 제한적이었습니다. 본 연구에서는 은 나노입자(nAg)를 모델 시스템으로 수산화나트륨(NaOH), 테트라메틸암모늄 하이드록사이드(TMAH), 질산(HNO₃), 염산(HCl), 프로테이나제 K 등 5가지 용해제를 체계적으로 평가했습니다. NaOH 처리가 90% 이상의 조직 용해도를 달성하면서 입자 크기를 보존하고 이온화를 최소화해 다른 시약보다 우수한 성능을 보였습니다. NaOH 프로토콜을 심장, 폐, 비장, 신장 호모게네이트로 확장해 광범위한 적용성을 확인했습니다. 마지막으로 최적화된 전처리를 적용해 정맥 투여된 nAg와 Ag⁺의 생쥐 혈액 및 간 내 거동을 평가했습니다. sp-ICP-MS 결과 nAg는 간에서 약 80%가 입자 상태로 잔류했으나 혈액에서는 약 95%가 이온화되었으며, Ag⁺는 두 구획 모두에서 이온 상태로 유지되었습니다. 이러한 발견은 NaOH 전처리가 생체 내 ENP의 정확한 sp-ICP-MS 분석을 가능하게 하며, 입자-이온 전환이 생체 분포와 동역학을 결정하는 데 중요함을 보여줍니다.

서론

나노기술 발전으로 100 nm 이하의 인공 나노입자(ENP) 생산이 가속화되었으며, 조직 침투력 향상과 반응성 표면 등 독특한 장점을 제공합니다. 은 나노입자(nAg)는 지속적인 Ag⁺ 방출과 전도성으로 소비재와 의약품에 널리 사용됩니다. 그러나 기능성을 부여하는 나노스케일 특성이 혈액-뇌 장벽 파괴, 염증 반응 등 건강 위험을 초래할 수도 있습니다. ENP의 보편성을 고려할 때, 위해성과 노출을 아우르는 엄격한 위험 평가가 필수적입니다.

ENP 독성 연구는 광범위하지만 실제 노출 시나리오를 정량화한 연구는 적습니다. 최근 연구에서 배양 세포 내 nAg와 Ag⁺의 세포 내 분포가 다름을 보여 조직 내 입자와 이온 구분의 필요성을 강조했습니다. 기존 ICP-MS는 총 금속 함량만 정량화할 뿐 입자와 이온 종을 구분할 수 없고, TEM은 크기 정보는 제공하지만 정량성이 부족합니다. 따라서 정밀한 정량화와 물리적 특성 분석을 결합한 방법이 ENP 생체 내 변환을 규명하는 데 중요합니다.

단일입자 ICP-MS(sp-ICP-MS)는 개별 입자를 검출해 피크 강도에서 크기를, 피크 빈도에서 농도를 추정하며, 배경 신호 분석으로 이온을 구분합니다. 기존 연구는 환경 및 상업 시료에 sp-ICP-MS를 적용했으나, 입자를 변형하거나 변화시키는 부적절한 전처리로 생체 조직 적용은 제한적이었습니다. 다양한 용해 시약은 조직 용해 능력, ENP 회수율, 입자 무결성 보존 측면에서 차이가 있습니다. 본 연구는 생쥐 조직 내 nAg의 sp-ICP-MS 분석을 위한 전처리 전략을 평가 및 최적화하여, 생체 내 ENP의 동시 정량화와 물리적 특성 평가를 위한 신뢰성 있는 워크플로를 확립하고자 합니다.

재료 및 방법

ENPs

30, 70, 100 nm Biopure nAg(nAg30, nAg70, nAg100)는 nanoComposix(미국 샌디에이고)에서 구입했습니다. 수송 효율 보정용 표준물질 RM8013은 NIST(미국 게이더스버그)에서 얻었습니다. 모든 ENP 현탁액은 사용 전 10분간 초음파 처리했습니다.

시약

0.1 mol L⁻¹ NaOH, 25% TMAH, 30% HCl, 프로테이나제 K는 와코(일본 오사카)에서, 70% HNO₃는 간토 화학(일본 도쿄)에서 구입했습니다.

동물

6주령 암컷 BALB/c 마우스는 일본 SLC(일본 시즈오카)에서 분양받았습니다. 12시간 명/암 주기, 자유 취 조건에서 사육했으며, 모든 절차는 오사카 대학 윤리 지침을 준수했습니다.

동적 빛 산란을 이용한 입자 크기 분포 측정

nAg를 MilliQ 물에 10 µg mL⁻¹ Ag 농도로 희석하고, 1 mL를 제타-케필러리 셀(Malvern Instruments)에 넣어 Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments)로 평균 직경과 제타 전위를 측정했습니다.

총 Ag 질량 측정

총 Ag 농도는 Agilent 7700x ICP-MS(Agilent Technologies)로 측정했습니다. 작동 조건: RF 파워 1550 W, Ar 유량 1.05 L min⁻¹, 체류 시간 100 ms. 로듐을 내부 표준으로 사용했으며, 삼중 측정했습니다.

sp-ICP-MS 분석 및 계산

동일 장비로 sp-ICP-MS 분석을 수행했습니다(RF 파워 1550 W, Ar 유량 1.05 L min⁻¹, 체류 시간 10 ms, 총 측정 시간 30 s). 입자 크기 계산에는 RIKILT에서 개발한 단일입자 툴을 사용했습니다.

sp-ICP-MS를 위한 임계 입자 농도

원액 nAg 용액(1.0 mg mL⁻¹)을 연속 희석해 2000, 800, 700, 600 pg mL⁻¹ 용액을 제조하고, 이를 10배 희석해 40가지 농도를 만들어 sp-ICP-MS 평가를 수행했습니다.

생쥐 간 조직 전처리 방법 최적화

간 호모게네이트는 조직과 PBS(w/v=1:10)를 혼합해 균질화했습니다. 각 호모게네이트에 100 ng mL⁻¹ nAg를 스파이크한 후, 1:1 부피비로 0.1 mol L⁻¹ NaOH, 25% TMAH, 30% HCl, 프로테이나제 K(0.01 M Tris-HCl, 0.01 M EDTA, 0.5% SDS 중 10 U mL⁻¹) 중 하나로 처리했습니다. 37°C에서 3시간 반응시킨 후 잔여물을 회수해 무게를 달고, 상등액을 500배 희석해 sp-ICP-MS 분석했습니다.

다양한 장기에서 NaOH 전처리의 범용성 평가

심장, 폐, 비장, 신장 조직을 PBS(w/v=1:10)로 균질화하고 100 ng mL⁻¹ nAg를 스파이크했습니다. 1 mol L⁻¹ NaOH 용액을 1:1 부피비로 첨가해 37°C에서 3시간 반응시켰습니다. 잔여물을 무게 측정하고 상등액을 500배 희석해 sp-ICP-MS 분석했습니다.

단일 정맥 투여 후 생쥐 혈액 및 간 내 nAg₁₀₀과 Ag⁺의 정량 및 물리적 특성 평가

nAg₁₀₀과 AgNO₃를 5% 포도당에 0.25 mg mL⁻¹(Ag⁺)로 희석했습니다. 생쥐에 nAg₁₀₀(1.5 또는 0.75 mg kg⁻¹), AgNO₃(1.5 또는 0.75 mg kg⁻¹ as Ag⁺), 또는 5% 포도당(대조군)을 정맥 주사했습니다. 투여 24시간 후 혈액과 간 시료를 채취했습니다. 간 호모게네이트를 PBS(w/v=1:10)로 제조한 후 TMAH 또는 NaOH(1:1 v/v)로 처리해 ICP-MS와 sp-ICP-MS 분석을 수행했습니다.

결과 및 논의

sp-ICP-MS 입자 검출 최적화

정확한 sp-ICP-MS를 위해서는 각 체류 시간 동안 한 개 이상의 입자가 플라즈마에 진입하지 않아야 합니다. 그렇지 않으면 여러 입자가 단일 이벤트로 합산되어 크기 추정이 부풀려집니다. nAg₁₀₀을 연속 희석해 검출된 입자 수와 이론적 입자 수를 비교했습니다. 저농도에서는 선형 관계를 보였으나 고농도에서는 예상보다 적은 이벤트가 검출되어 다중 입자 간섭이 있음을 나타냈습니다(그림 1a). 검출 수에서 이론치를 빼면 검출 이벤트가 500을 초과할 때 편차가 유의미해져 신뢰성 있는 분석을 위한 실용적 임계값을 설정했습니다(그림 1b).

정확한 sp-ICP-MS 분석을 위한 체류 시간당 최적 입자 수 결정. nAg 용액(600 fg mL⁻¹ ~ 2,500 pg mL⁻¹) 시리즈를 sp-ICP-MS로 분석. a nAg₁₀₀ 농도와 검출 입자 수 관계: 검출 입자(실선), 이론값(점선) 플롯. b 이론값에서 검출 입자 수를 뺀 값을 세로축에 플롯해 최적 입자 수 결정. 각 점은 단일 시험 결과(n=1)

다양한 직경의 nAg로 검증한 결과 sp-ICP-MS 설정이 정확한 크기 추정을 제공했습니다: nAg30, nAg70, nAg100의 측정 직경은 각각 30.0±1.2 nm, 65.1±0.6 nm, 97.4±0.6 nm였습니다. 동적 빛 산란(DLS) 측정값(36.4±1.6 nm, 70.6±1.7 nm, 101±1.0 nm)과 잘 일치해 분석 프로토콜이 검증되었습니다.

생쥐 간 조직 내 nAg 검출을 위한 전처리 방법 최적화

효과적인 전처리는 조직을 용해시키고, ENP의 물리화학적 상태를 변경하지 않으면서 회수하며, 이온화나 응집을 방지해야 합니다. 100 ng mL⁻¹ nAg를 스파이크한 간 호모게네이트에 NaOH, TMAH, HNO₃, HCl, 프로테이나제 K 5가지 용해제를 비교했습니다.

잔여물 분석 결과 NaOH, TMAH, 프로테이나제 K는 간 기질의 90% 이상을 용해시킨 반면, HNO₃와 HCl은 약 75%만 용해시켰습니다(그림 2a). 조직의 약 80%가 물임을 고려하면 산성 시약의 낮은 용해도는 불완전한 기질 제거를 의미합니다.

sp-ICP-MS 회수 데이터에서 산성 처리는 nAg를 완전히 이온화시켰고, 프로테이나제 K는 부분적으로 이온화시켰습니다. 반면 NaOH와 TMAH는 이온 검출이 거의 없이 nAg를 온전한 입자 상태로 보존했습니다(그림 2b). 크기 분포 분석에서 TMAH 처리는 100 nm에서 120 nm로 이동하고 분포가 넓어지는 등 응집을 유발했습니다(그림 2c-d). NaOH 처리는 원래 100 nm 크기를 유지했습니다(그림 2c-d), 이는 NaOH의 적합성을 입증합니다.

생쥐 간에서 nAg₁₀₀ 검출을 위한 최적 전처리법으로서의 NaOH. 5가지 용해 시약(NaOH, TMAH, HNO₃, HCl, 프로테이나제 K)을 전처리 용매로 스크리닝. 간 호모게네이트에 nAg₁₀₀ 용액을 혼합해 최종 Ag 농도 100 ng mL⁻¹로 만들고 각 용해 시약으로 37°C에서 처리. 3시간 후 a 조직 용해도 지표인 각 그룹 잔여율, b 회수율(검정/흰색 막대: 입자/이온으로 검출된 은 비율), c 평균 입자 직경 막대 그래프, d 입자 크기 분포 비스웜 차트. 결과는 평균±SD(n=3)

TMAH는 분해 생성물인 트라이메틸아민과 메탄올로 유전율을 높여 nAg의 제타 전위를 낮추고 응집을 촉진합니다. 그러나 짧은 시간(1분) TMAH 노출은 입자 크기(~100 nm)를 보존해 장시간 처리가 응집의 원인임을 확인했습니다.

다양한 장기에서 NaOH 전처리의 범용성 평가

NaOH의 광범위한 적용성을 확인하기 위해 nAg를 스파이크한 심장, 폐, 비장, 신장 호모게네이트에 프로토콜을 적용했습니다. 잔여물 분석에서 95% 이상 용해됨(그림 3a). sp-ICP-MS에서 모든 조직에서 첨가된 Ag가 입자로 검출되었으며, 회수율은 FDA 기준인 80-120% 범위 내에 들었습니다(그림 3b). 모든 장기에서 입자 직경이 100 nm 근처를 유지했습니다(그림 3c-d), 이는 방법의 일관성을 보여줍니다.

다양한 장기에서 nAg₁₀₀ 검출을 위한 최적 전처리법으로서의 NaOH. 그림 2와 동일하게 심장, 신장, 폐, 비장 호모게네이트에 nAg₁₀₀을 혼합하고 NaOH 용액으로 배양. 3시간 후 a 잔여율(검정/흰색: NaOH/PBS 처리), b 회수율(검정/흰색: 입자/이온 검출 비율), c 평균 입자 직경 비스웜 차트, d 입자 크기 분포 비스웜 차트. 결과는 평균±SD(n=3)

이러한 데이터는 NaOH 전처리가 sp-ICP-MS를 통한 다양한 동물 조직 내 nAg의 정량화와 특성 분석을 위한 견고하고 재현 가능한 플랫폼을 제공함을 종합적으로 확인합니다.

생체 조직 내 nAg와 Ag⁺의 정량적 및 물리적 특성 분석을 위한 sp-ICP-MS 평가

실용적 관련성을 입증하기 위해 정맥 투여된 nAg₁₀₀과 Ag⁺의 생쥐 혈액 및 간 내 거동을 비교했습니다. ICP-MS로 두 처치 모두에서 두 구획에 Ag가 존재함을 확인했습니다(그림 4a,b). 그러나 sp-ICP-MS는 뚜렷한 종 분화를 보여주었습니다: 혈액에서는 투여 형태와 관계없이 Ag가 95% 이상 이온으로 존재했으나, 간에서는 nAg₁₀₀ 유래 Ag의 약 80%가 입자 상태로 잔류했고 Ag⁺ 투여 후에는 입자가 거의 검출되지 않았습니다(그림 4c,d). 간 내 nAg₁₀₀ 입자 크기 분석 결과 평균 직경 ~80 nm로 투여된 100 nm보다 작았으며, 이는 간 조직 내 부분적 이온화와 변환을 반영합니다(그림 4e).

정맥 투여된 nAg₁₀₀과 Ag⁺의 동시 정량 및 물리적 특성 분석. nAg₁₀₀과 Ag⁺를 생쥐에 정맥 투여(0.75 또는 1.5 mg kg⁻¹). 24시간 후 간과 혈액 채취. 모든 시료는 NaOH 용액으로 전처리. a 혈액, b 간의 Ag 농도(ICP-MS). c 혈액, d 간의 nAg(sp-ICP-MS). e 간에서 검출된 입자 평균 직경. 결과는 평균±SE(n=3)

결론

생쥐 조직 내 은 나노입자의 정확한 sp-ICP-MS 분석을 가능하게 하는 최적화된 NaOH 전처리 프로토콜을 확립했습니다. 이 워크플로를 정맥 투여된 nAg₁₀₀과 Ag⁺에 적용한 결과, nAg가 생체 내 부분적으로 이온화되며 간에서는 약 80%가 입자 상태로, 혈액에서는 약 95%가 이온 상태로 존재함을 밝혀냈습니다. 이러한 발견은 ENP 생체 분포와 동역학 평가 시 입자-이온 전환을 고려하는 것의 중요성을 강조합니다. 본 방법은 다양한 조직에 널리 적용 가능하며, 위험 평가 연구에서 ENP 노출 동태와 생물학적 반응을 규명하는 데 활용될 수 있습니다.