유전자 요법은 siRNA(작은 간섭 RNA)를 비롯한 난소암 치료에 유효한 방법으로 부상하고 있습니다. 그것은 매우 강력하지만 효율적인 유전자 전달 시스템을 표적으로하는 것은 거의 유전자 요법의 개발을 심각하게 방해했습니다. 이 연구에서 우리는 엽산(FA)이 난소암에서 과발현되는 엽산 수용체(FR)에 특이적으로 결합할 수 있는 기능화된 산화 그래핀(GO)에 의해 새로운 유전자 벡터 PEG-GO-PEI-FA를 합성했습니다. 나노복합체의 특성은 동적 광산란(DLS), 원자력 현미경(AFM) 및 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)에 의해 평가되었습니다. siRNA 축합 능력 및 안정성은 아가로스 겔 전기영동으로 평가하였다. 난소암 세포의 세포 흡수 효율과 리소좀 탈출능을 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 조사했습니다. 또한, CCK-8 assay로 시스템의 세포 생체 안전성과 siRNA 내성 억제를 평가하였다. PEG-GO-PEI-FA 나노복합체의 크기는 216.1 ± 2.457 nm로 난소암 세포에서 약한 세포독성을 보였다. 높은 흡수 효율로 PEG-GO-PEI-FA는 리소좀에서 빠르게 빠져나와 유전자를 방출할 수 있습니다. 또한, PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 난소암 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있습니다. 대체로 PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 FR 양성 난소암 또는 유사한 종양의 치료에서 siRNA 전달을 위한 유망한 전략을 제공할 수 있습니다.
난소암은 세계적으로 가장 흔한 부인과 사망 원인이며 조기 진단 및 치료의 어려움으로 인해 일반적으로 좋지 않은 임상 결과와 관련이 있습니다[1,2,3]. 불행히도 기존의 화학요법제는 비특이적 분포, 낮은 생체이용률, 빠른 혈액 제거, 생리학적 환경에서의 낮은 용해도와 같은 고유한 한계를 나타냅니다[4]. 지난 수십 년 동안 유전자 요법은 암을 포함한 다양한 유전 질환의 치료를 위한 잠재적인 접근 방식으로 조사되었습니다[5,6,7,8]. 그러나 안전하고 매우 효율적이며 선택적인 유전자 전달 운반체의 부족으로 인해 임상 유틸리티로의 발전이 저해되었습니다. 현재, 유전자 벡터에는 바이러스 및 비바이러스 벡터의 두 가지 범주가 있습니다. 바이러스 벡터는 높은 형질감염 효율을 나타내었지만 심각한 면역 염증 반응과 야생형 바이러스와의 재조합 위험과 같은 몇 가지 단점이 임상 적용을 제한합니다[9, 10]. 대조적으로, 비바이러스 벡터는 광범위한 전달 능력, 낮은 면역원성 및 구조적 유연성을 갖고 있어 바이러스 벡터에 대한 탁월한 대안이 된다[11,12,13]. 나노 기술의 급속한 발전으로 많은 나노 입자가 유전자 전달 운반체로 잠재적으로 사용되기 위해 탐색되었습니다 [14, 15]. 여기에서 이 작업은 종양 조직에 효율적으로 전달할 수 있는 새로운 비바이러스 벡터 PEG-GO-PEI-FA를 설계했습니다.
그래핀 옥사이드(GO)는 흑연의 다단계 산화, 초음파 및 정제에 의해 생성되는 흑연의 유도체이다[16]. GO 표면은 에폭시, 히드록실 및 카르복실기를 포함합니다[17]. 표면의 산소 작용기는 GO에 우수한 생체 적합성을 제공하여 물 및 유기 용매에서 안정적인 현탁액을 형성하여 화학적 변형 및 기능화를 촉진합니다[18, 19]. 따라서 GO는 광열 암 치료, 약물 및 유전자 전달, 바이오 센서에 널리 사용되었습니다[20,21,22]. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 안전하고 무독성이며 생분해성 물질입니다. 친수성 약물 운반체로 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인되었습니다[23]. PEG를 사용한 GO 기능화는 생리학적 조건에서 안정성을 개선하고 체내에서 GO 나노물질의 사이클 시간을 연장하며 더 나은 종양 표적화를 위해 GO 나노물질 약동학을 개선할 수 있습니다[24, 25]. 폴리에틸렌이민(PEI)은 다양한 세포주에서 높은 형질감염 효율로 인해 비바이러스 벡터의 황금 표준이 되었습니다[26]. 그러나 PEI는 심각한 세포독성과 낮은 생체적합성을 보여 임상 적용에 한계가 있다. 이 연구에서 우리는 PEI가 GO의 표면에 이식되었을 때 세포독성의 현저한 감소를 관찰했습니다. 엽산 수용체는 다양한 암세포 표면, 특히 화학 요법 전후의 난소암 세포에서 과발현됩니다[27]. 표적 유전자 전달을 위해 엽산 분자는 GO와 공유 결합되어 엽산 수용체를 표적으로 삼았습니다.
전반적으로, 본 연구의 주요 목표는 난소암에 대한 siRNA 기반 유전자 요법의 유용성을 증가시키기 위해 새로운 표적화 GO 기반 유전자 전달 시스템을 탐색하는 것이 었습니다. 수득된 양으로 하전된 PEG-GO-PEI-FA는 유전자 전달을 위해 siRNA로 로딩될 수 있다. 성공적인 합성, 특성화, 효과적인 세포 내재화 및 시험관 내 항암 효과를 다양한 기술을 사용하여 분석했습니다. 또한, 이 시스템의 안전성도 시험관 내에서 평가되었습니다.
산화 그래핀은 Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd.(중국 쑤저우)에서 입수했습니다. 엽산(FA), N -히드록시숙신이미드(NHS) 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)는 Sigma Aldrich Trading Co. Ltd.(중국 상하이)에서 구입했습니다. 분지형 PEI 25K, PEG(MW =2000), 아가로스 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸 카르보디이미드 염산염(EDC·HCL)은 Adama Reagent Co. Ltd.(중국 상하이)에서 구입했습니다. 인산염 완충 용액(PBS), Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 및 기타 모든 화학 물질은 Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.(중국 상하이)에서 구입했습니다. 다른 모든 화학 물질은 시약 등급이었습니다. RPMI-1640 배지(Gibco), 태아 소 혈청(FBS)(Gibco), 트립신(Gibco) 및 20x TAE 완충액은 Thermo Fisher Scientific Co. Ltd.(중국)에서 구입했습니다. 세포 계수 키트8(CCK-8)은 Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd.(Shanghai, China)에서 구입했습니다. LysoTrackerRed, 4% 파라포름알데히드, 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 및 Lipofectamine 2000 형질감염 시약은 Invitrogen Co. Ltd.(중국)에서 구입했습니다. Dil 형광 프로브(Cat number:C1036)는 Beyotime Co. Ltd.에서 구입했습니다. Anti-PLK1(PLK1-homo-581) 짧은 간섭 RNA(siRNA)는 Shanghai GenePharma Co. Ltd.(Shanghai, China)에서 합성했습니다.
PEG-GO-PEI-FA의 합성은 그림 S2(A)에 표시된 전략에 따릅니다. 먼저, 10 mL GO 수성 현탁액(1000 μg/mL)을 2 시간 동안 50 W에서 연속적으로 배쓰 초음파 처리했습니다. 그런 다음, 1 mL EDC·HCL(5000 μg/mL) 및 NHC(5000 μg/mL)를 첨가하고 100 W에서 30분 동안 간헐적으로 초음파 처리한 다음, 30분 동안 자기 처리한 PEG(10 mg)를 첨가하고 가온에서 교반 0 °C에서 6 h 동안 교반기. 미반응 시약을 제거하고 GO-PEG 용액을 얻기 위해 혼합물을 투석막(MWCO, 3500 Da)이 있는 증류수에서 24시간 동안 투석하였다. 그 다음, GO-PEG 용액을 30분 동안 초음파 처리하고, 1 mL EDC·HCL(5000 μg/mL) 및 NHC(5000 μg/mL)를 첨가하고 다시 30분 동안 초음파 처리한 다음, PEI 25K(5000 μg)를 첨가하였다. ) 2 mL. 혼합물을 30분 동안 초음파 처리하고 0℃에서 6시간 동안 교반하였다. 이어서, PEG-GO-PEI를 얻기 위해 다시 투석막(MWCO, 3500 Da)이 있는 증류수에서 혼합물을 24시간 동안 투석하였다. PEG-GO-PEI 용액을 60분 동안 초음파 처리하고, 1 mL EDC·HCL(5000 μg/mL) 및 NHC(5000 μg/mL)를 첨가하고 다시 30분 동안 초음파 처리한 다음, 용액에 10 mg FA를 첨가하였다. . 용액을 30분 동안 초음파 처리하고 0℃에서 12시간 동안 교반하고 48시간 동안 투석하여 위에서 언급한 절차에 따라 PEG-GO-PEI-FA를 얻었다. 나노복합체 용액을 진공동결건조기(Biosafer-10D)로 건조시켰다.
수용액에서 나노복합체의 표면 제타 전위 및 평균 입자 크기는 동적 광산란(DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, UK)에 의해 측정되었습니다. 나노복합체의 형태는 원자간력현미경(AFM, MuLtimode Nanoscope IIIa, Germany)을 이용하여 대기 중에서 관찰하였다. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 스펙트럼은 400–4000 cm −1 범위에서 KBr 펠릿을 사용하여 Thermo Nicolet 6700 FTIR 분광기에 의해 획득되었습니다. . 나노복합체의 UV-Vis 흡수 스펙트럼은 UV-Vis 분광광도계(UV, EV300, USA)로 측정하였다. 나노복합체의 라만은 여기 파장이 532 nm인 분산 라만 현미경(Senterra R200-L, Germany)으로 측정되었습니다.
SKOV3(인간 난소암 세포)는 Keygen(중국)에서 구입했습니다. 세포를 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 g/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지하고 37 °C에서 5% CO2를 포함하는 가습 분위기에서 배양했습니다. . 본 연구에서는 SKOV3 세포에서 물질의 세포독성을 CCK-8 assay로 분석하였다. 간단히 말해서, 세포를 96웰 플레이트에 6 × 10 3 의 밀도로 시딩했습니다. 10% FBS를 포함하는 100 μL 1640 배지에 세포/웰을 넣은 다음 5% CO2를 포함하는 습한 분위기에서 37 °C에서 12시간 동안 배양 . 그런 다음, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI 및 PEG-GO-PEI-FA를 10 내지 1000μg/mL 범위의 최종 농도로 첨가하고 추가 12시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 또 다른, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI 및 PEG-GO-PEI-FA는 농도 100μg/mL에서 4시간에서 24시간까지 다른 시간으로 인큐베이션되었습니다. 이어서, 10 μL의 CCK-8을 각 웰에 첨가하고 37 °C에서 추가로 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더에서 측정하였다. 각 그룹 실험은 세 번 반복되었습니다. 배지에서 배양된 대조군 세포와 관련된 상대적 세포 생존율(%)은 (샘플의 흡광도 - 블랭크의 흡광도)/(대조군의 흡광도 - 블랭크의 흡광도) × 100%로 계산되었습니다.
20x TAE 완충용액을 DEPC 처리된 물로 희석하여 1% 아가로스 용액을 만들었다. 그런 다음, 용액을 전자레인지로 5분 동안 가열하여 아가로스를 완전히 용해시켰다. 아가로스 용액의 온도가 55 °C로 떨어지면 10,000:1 부피비의 ethidium bromide(EB, 0.5 μg/mL) 용액을 첨가하고 균일하게 혼합한 후 냉각하여 아가로스 용액을 냉각시켜 아가로스 겔을 형성하였다. . 다른 중량비의 PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA 및 siRNA 혼합물을 구멍에 첨가하였다. 겔을 110 V, 40 mA에서 약 60분 동안 작동시킨 다음 자외선 이미저로 관찰 및 분석했습니다.
세포 흡수를 조사하기 위해 나노복합체를 약간 수정하여 이전에 설명한 방법에 따라 FITC로 표지했습니다[28]. 요약하면, 나노복합체 용액(약 1 mg/mL, 2.0 mL)을 DMSO에 용해된 0.2 mL FITC(26 mM)와 혼합한 다음 실온에서 밤새 교반했습니다. 생성된 혼합물을 5000 MWCO 막을 통해 투석하여 표지되지 않은 FITC를 제거한 다음 동결건조시켰다. 세포를 2 × 10 5 밀도로 6웰 플레이트(커버슬립 포함)에 접종했습니다. 10% FBS를 포함하는 2 mL 1640 배지에 세포/웰을 넣은 다음 세포 배양 인큐베이터에서 37 °C에서 12시간 동안 배양합니다. 그 다음, 각 웰의 배지를 무혈청 1640 배지로 교체하였다. 이어서, 세포를 상이한 나노복합체/FITC로 처리하였다. 나노복합체를 처리하지 않은 세포가 대조군이고 PEI 25 K를 처리한 세포가 병렬 대조군이다. 5% CO2를 포함하는 가습 대기에서 37 °C에서 4 시간 동안 배양 후 , 배양 플레이트의 액체를 제거하고 세포를 차가운 DPBS(pH =7.4)로 두 번 세척한 다음 20 μL DAPI와 5 μL Dil(세포막 염료)을 각 웰에 첨가하고 37 °C에서 20분 인큐베이션했습니다. 어두운. 이어서, 배양액의 DAPI와 Dil을 제거하고 차가운 DPBS(pH =7.4)로 2회 세척한 후 세포의 커버슬립을 꺼내 Permount TM Mounting Medium으로 유리 슬라이드에 고정하였다. 그 후, 세포 슬라이드의 형광 신호를 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)으로 관찰하여 나노복합체의 세포 흡수를 분석했습니다.
세포 분포, 엔도솜 탈출 및 나노복합체의 침투를 시각화하기 위해 SKOV3 세포를 1 × 10 5 밀도로 12웰 플레이트(커버슬립 포함)에 접종했습니다. 10% FBS를 함유한 2 mL 1640 배지에 세포/웰을 넣은 다음 12시간 동안 배양(37 °C, 5% CO2 ). 그런 다음 각 웰의 배지를 1 mL/well 무혈청 1640 배지로 교체했습니다. 이어서, FITC로 표지된 상이한 나노복합체(100 μg/mL)를 1 mL/웰에 대해 12-웰 플레이트에 첨가하였다. 6시간 후, 액체를 제거하고, 세포를 차가운 DPBS(pH =7.4)로 두 번 세척하고, 12웰 플레이트에 50μL/웰에 대해 LysoTracker Red(5μg/mL)를 첨가했습니다. 5% CO2를 포함하는 습한 분위기에서 37 °C에서 15분 동안 배양 후 , 12-웰 플레이트의 액체를 제거하고 세포를 차가운 DPBS(pH =7.4)로 두 번 세척한 다음 각 웰에 20 μL의 DAPI를 첨가하고 암소에서 4 °C에서 20분 동안 인큐베이션했습니다. 다음으로, DAPI 액체를 제거하고 차가운 DPBS(PH =7.4)로 2회 세척하였다. 그 후, 4% 파라포름알데히드로 실온에서 15분 고정하고, 커버슬립을 꺼내서 Permount TM Mounting Medium으로 유리 슬라이드에 고정하였다. 슬라이드의 형광 신호는 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 관찰하고 리소좀 탈출과 나노복합체의 핵으로의 침투를 분석했습니다[29].
CCK-8 assay를 이용하여 PEG-GO-PEI/siRNA와 PEG-GO-PEI-FA/siRNA의 세포 억제 효과를 분석하였다. 곧, 세포를 6 × 10 3 밀도로 96웰 플레이트에 접종했습니다. 10% FBS를 포함하는 100 μL 1640 배지에 세포/웰을 넣은 다음 5% CO2를 포함하는 습한 분위기에서 37 °C에서 12시간 동안 배양 . 그런 다음, PEG-GO-PEI 및 PEG-GO-PEI-FA를 10 ~ 500 μg/mL 범위의 최종 농도로 첨가하고 추가 12시간 및 24시간 동안 세포와 함께 인큐베이션했습니다. 그런 다음, PEG-GO-PEI/siRNA 및 PEG-GO-PEI-FA/siRNA를 100μg/mL 농도에서 4시간에서 48시간 동안 세포와 함께 배양하였다. siRNA를 Lipofectamine 2000으로 형질감염시키고 대조군으로 무처리하였다. 이어서, 10 μL의 CCK-8을 각 웰에 첨가하고 37 °C에서 추가로 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 흡광도는 450 nm에서 측정되었습니다. 각 그룹 실험은 세 번 반복되었습니다. 저해율(%)은 1 - (샘플 흡광도 - 블랭크 흡광도)/(대조군 흡광도 - 블랭크 흡광도) × 100%로 계산하였다.
각 실험 테스트는 3회 반복되었으며 데이터는 SPSS 17.0 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 다중 그룹 분석 및 짝을 이루지 않은 학생의 t에 대한 일원 분산 분석 테스트 비교를 위해 두 그룹 분석에 대한 테스트를 사용했습니다. 데이터는 평균과 표준편차(SD)로 표현하였으며, 통계적 유의성은 p로 설정하였다. <0.05.
FR의 발현은 먼저 Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE; http://portals.broadinstitute.org/ccle) 데이터베이스[30]를 기반으로 하는 서로 다른 암세포주와 Gene Expression Profiling Interactive를 기반으로 하는 서로 다른 난소 조직에서 분석되었습니다. 분석(GEPIA2; http://gepia2.cancer-pku.cn) 데이터베이스 [31]. 결과는 이전 연구와 일치했습니다(그림 S1). 따라서 우리는 유전자 전달을 위한 표적 리간드로 FA를 선택했습니다.
그래핀 옥사이드는 산화 공정에 의해 생성된 기저면의 가장자리, 하이드록실 및 에폭시 그룹을 포함한 많은 산소 함유 그룹을 확실히 가지고 있습니다[32]. 나노 규모의 GO(NGO)를 얻기 위해 GO를 50 W에서 2시간 동안 목욕 초음파 처리에 의해 연속적으로 분해한 다음 그림 S2(A)에 표시된 대로 EDC/NHS 화학을 사용하여 PEG/PEI/FA를 GO에 공유 연결했습니다. 그림 S2(B)는 PEG-GO-PEI-FA/siRNA의 처리 경로를 보여줍니다. 화학적 결합의 분석은 스펙트럼 흡수 피크를 얻기 위해 FTIR 미분 스펙트럼 기술에 의해 수행되었습니다[33]. 그림 1a와 같이 OH(3425 cm -1 ), C=O(1719 cm −1 ) 및 C=H(1350 cm −1 ) ) 작용기는 GO에서 발견되었으며 GO 표면에 수산기와 카르복실기가 존재함을 나타냅니다. CH(2885 cm −1 ) PEG가 안정적인 공유 결합을 통해 GO와 반응할 때 신축 진동 밴드가 발견될 수 있습니다. 이것은 PEG가 GO에 접목되었고 PEG 접합 효율이 약 6%임을 나타냅니다. PEI 및 FA가 GO와 반응한 후, NH(1590 cm -1 ), C–N(1420 cm −1 ) 신축 진동 밴드가 관찰되었으며, 이는 PEI 및 FA가 에스테르화에 의해 GO에 그래프트되었음을 나타냅니다. 이러한 결과는 접합 PEG-GO-PEI-FA가 성공적으로 합성되었음을 보여줍니다.
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푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 및 UV-Vis 분광 광도계를 사용한 PEG-GO-PEI-FA의 성공적인 합성 분석. 아 GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI 및 PEG-GO-PEI-FA의 FTIR 스펙트럼. ㄴ GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI 및 PEG-GO-PEI-FA의 UV-Vis 흡수 스펙트럼
그림 1b는 GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI 및 PEG-GO-PEI-FA의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 보여줍니다. GO는 223 nm의 흡수 피크를 가졌다. FA는 275 nm의 흡수 피크를 가졌다. GO-PEG는 부드러운 곡선을 보여 PEG가 GO와 결합하여 GO의 산을 더 매끄럽게 만들었음을 나타냅니다. PEG-GO-PEI는 219 nm에서 흡수 피크를 나타내어 PEI가 GO-PEG 표면에 그래프트되었음을 나타냅니다. PEG-GO-PEI-FA는 219 nm 및 275 nm에서 흡수 피크를 나타내어 FA가 PEG-GO-PEI에 접목되었음을 나타냅니다. 이 모든 결과는 PEG-GO-PEI-FA의 성공적인 합성을 더욱 입증했습니다.
표 1에 주어진 데이터는 나노복합체의 입자 크기와 제타 전위를 보여주었다. 나노복합체의 입자 크기는 점차적으로 218.4 nm로 증가하는 반면, PEG, PEI 및 FA는 GO의 표면에 점진적으로 그래프트된다. 제타 전위는 PEI가 GO에 연결되었을 때 -16.5에서 +17.5mv로 변경되었으며, 이는 정전기 상호작용 및 세포 흡수를 통해 음전하를 띤 DNA 또는 RNA를 흡착하는 능력을 촉진했습니다. PEG-GO-PEI-FA 및 PEG-GO-PEI-FA/siRNA의 제타 전위는 각각 + 14.7 mv 및 + 14.5 mv였습니다. 제타 전위는 PEG-GO-PEI-FA 또는 PEG-GO-PEI-FA/siRNA가 FA 및 siRNA의 음전하 때문에 PEG-GO-PEI보다 작음을 나타내었다. 이는 PEG-GO-PEI-FA/siRNA가 전하 상호작용에 의해 세포 표면에 흡착될 수 있고 세포막에 대한 수용체 매개 세포내이입에 의해 사용될 수 있음을 나타냅니다[34].
나노캐리어의 표면 형태와 입자 크기도 AFM과 DLS로 측정했다. 도 2a에 도시된 바와 같이, GO는 192.1 nm의 입자 크기를 갖는 매끄러운 표면 및 시트 구조를 나타내었다. GO 표면에 PEG, PEI, FA를 접목한 후, PEG-GO-PEI-FA의 입자크기는 216.1 nm로 증가하였고, PEG-GO-PEI-FA 표면에 많은 돌기가 관찰되었다(Fig. 2b). ), 많은 수의 장식이 GO 시트에 고정되었음을 시사합니다. 동시에 PEG-GO-PEI-FA의 높이는 GO보다 높았는데, 이는 주로 GO 시트의 양면에 PEG, PEI 및 FA가 부착되었기 때문입니다.
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나노 스케일 전달 시스템의 특성. AFM(Atomic Force Microscopy) 및 DLS(Dynamic Light Scattering)는 형태 및 크기 분포를 특성화하는 데 사용되었습니다. a 이동 및 b PEG-GO-PEI-FA. GO, GO-PEG 및 PEG-GO-PEI의 생성된 산화 그래핀 표면 분석을 위한 라만 스펙트럼 c
라만 분광법은 나노카본 재료의 특성 및 구조적 특성을 측정하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다[35]. 그림 2c와 같이 GO의 라만 스펙트럼은 1600 cm -1 에서 진동대를 나타냈다. (G 밴드) 및 1354 cm −1 (D 밴드), ID/IG의 면적비는 1.0385로 SP 2 부분을 나타냅니다. GO의 혼성화가 끊어져 히드록실과 카르복실이 형성되었습니다. GO-PEG 및 PEG-GO-PEI는 1595 cm −1 에서 진동 대역을 나타냈습니다. (G 밴드) 및 1352 cm −1 (D 밴드), ID/IG의 면적비는 0.7737 및 0.5238이었다. GO와의 PEG 및 PEI 반응에 따라 ID/IG의 면적 비율이 점차 감소했습니다. 이것은 PEG와 PEI가 GO 표면에 접목되었음을 나타냅니다.
비바이러스성 유전자 벡터의 생물학적 보안 문제는 임상 적용에 있어 중요한 과제로 남아 있습니다. 높은 양전하는 유전자를 응축하고 보호하는 능력이 우수할 뿐만 아니라 심각한 세포독성을 초래합니다[36, 37]. 유리 siRNA 나노복합체의 세포독성을 시험하기 위해, 상이한 농도(10 ~ 1000μg/mL)의 유리 나노복합체와 함께 4, 8, 12 및 24시간 동안 배양된 SKOV3 세포를 사용하여 CCK-8 분석을 수행했습니다. 그림 S3에서 볼 수 있듯이, 나노복합체는 1000 μg/mL 및 24 h에서 난소암에서 여전히 높은 세포 생존력을 보였습니다. 모든 나노복합체의 세포독성은 시간 및 농도 의존적 방식을 나타냈습니다(SKOV3 세포의 생존율:1000 μg/mL에서 모든 나노복합체의 경우 84.38% 이상, 24 h에서 모든 나노복합체의 경우 94.21% 이상) SKOV3 세포와 함께). 이러한 결과는 나노복합체가 무시할만한 세포독성을 보여 생체적합성 유전자 벡터로 작용할 수 있음을 시사했다.
유리 RNA 분자의 세포 흡수는 일반적으로 이들이 지니고 있는 상당한 음전하로 인해 까다롭습니다[38]. 양이온성 고분자에 의한 음전하를 띤 생체분자의 로딩은 이 문제를 해결하기 위해 널리 채택되고 있다[39]. 이 논문에서, PEG-GO-PEI-FA 벡터에 siRNA의 로딩은 수용액에서 siRNA와 PEG-GO-PEI-FA를 혼합함으로써 달성되었다. Table 1에서 보는 바와 같이 PEG-GO-PEI-FA의 zeta potential은 +14.7 mV로 정전기적 상호작용에 의해 PEG-GO-PEI-FA 표면에 siRNA가 흡착될 수 있음을 알 수 있다. 이 연구에서 나노복합체의 유전자 축합 능력은 아가로스 겔 전기영동에 의해 평가되었다[40]. 도 3a는 PEG-GO-PEI가 10의 중량비에서 siRNA에 대한 명백한 축합 능력을 갖는 반면, PEG-GO-PEI-FA는 중량비가 20에 도달할 때 siRNA 이동의 완전한 지연이 관찰되었음을 보여주었다(도 3b). 따라서 PEG-GO-PEI-FA는 siRNA가 분해되지 않도록 보호할 수 있지만 동시에 우수한 결합 능력을 나타내기 위해서는 좀 더 많은 나노복합체가 필요합니다. 이것은 그다지 높지 않은 PEG-GO-PEI-FA의 제타 전위와 관련이 있을 수 있습니다. 이러한 결과는 PEG-GO-PEI 및 PEG-GO-PEI-FA가 충분한 전달 능력, 특히 PEG-GO-PEI-FA를 가짐을 나타내었고, 이는 유전자의 효율적이고 안전한 전달을 위한 유효한 벡터로서의 가능성을 더욱 나타냈습니다.
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다양한 중량비에서 siRNA 로딩 기능. siRNA와 나노캐리어 사이의 상호작용을 평가하기 위해 아가로스 겔 지연 분석을 수행했습니다. 아 PEG-GO-PEI 및 b 다양한 중량비의 PEG-GO-PEI-FA(재료/siRNA)
운반체가 유전자 전달을 위해 종양을 특이적으로 표적화할 수 있는지 여부는 매우 중요합니다. PEG-GO-PEI-FA 운반체가 세포에 쉽게 들어갈 수 있는지 확인하기 위해 FITC를 세포내 이미징을 위한 형광 프로브로 사용했습니다. 동시에 핵은 DAPI로 염색하고 세포막은 Dil로 염색하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군과 PEG-GO-PEI 그룹은 핵과 세포막 주변에서 녹색 형광 신호를 나타내지 않았다. 그것은 PEG-GO-PEI가 세포에 들어가지 않았다는 것을 의미했습니다. PEI 25K 및 PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 코어 주위에 녹색 형광 신호로 나타났으며, 이는 PEG-GO-PEI-FA가 세포막을 관통하여 세포로 들어갈 수 있음을 분명히 보여주었습니다. PEG-GO-PEI-FA 나노복합체는 가장 활동적인 세포 흡수를 보여주었고, 아마도 FA에 기인한 것으로 SKOV3 세포의 표면에서 과발현된 FR에 특이적으로 결합할 수 있었습니다. 이러한 결과는 FA가 PEG-GO-PEI-FA 및 PEG-GO-PEI-FA/siRNA 나노복합체의 효율적인 세포 흡수를 매개하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 시사했습니다. 더 중요한 것은 FA가 수용체에 결합하는 능력이 아미드 공유 결합에 의해 영향을 받지 않았고 수용체 매개 엔도사이토시스가 방해받지 않았다는 것입니다.
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다른 나노복합체의 세포 흡수. 4 시간 동안 배양한 후 인간 난소암 SKOV3 세포에서 FITC로 표지된 다른 나노복합체의 세포 흡수에 대한 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 이미지. 파란색, 핵(DAPI 표지됨); 적색, 세포막(Dil-표지); 녹색, 나노복합체(FITC 표지). 눈금 막대는 100 μm를 나타내지만 눈금 막대는 단일 셀에서 10 μm입니다.
siRNA 전달 시스템의 경우 엔도솜 또는 형성된 리소솜에서 탈출해야 합니다. 그러나 그렇지 않으면 siRNA가 분해되거나 세포 밖으로 배출됩니다[41,42,43]. 우리는 CLSM을 사용하여 나노복합체의 세포내 국소화에 의해 엔도솜 탈출 능력을 평가합니다. 많은 보고에서 PEI 25K가 "양성자 스폰지 효과"[44]에 의해 엔도솜 또는 리소솜 탈출에 유리할 수 있다는 것이 입증되었기 때문에 PEI 25K를 대조군으로 사용했습니다. 이 연구에서 나노복합체는 FITC로 표지되었습니다. 첫째, FITC의 녹색 형광 신호가 Lyto Tracker Red의 빨간색 형광 신호와 중첩되는 노란색 신호에 의해 나노복합체가 리소좀으로 들어가는 것으로 추정했습니다. PEI 25K는 세포와 함께 4시간 배양 후 노란색 신호로 나타났고 다른 물질은 세포와 2시간 배양 후 노란색 신호로 나타나 물질이 세포에 들어갔다는 것을 의미합니다(그림 5). 나노복합체가 밝은 청록색 신호에 의해 리소좀에서 탈출하는지 여부에 관계없이 FITC의 녹색 형광 신호는 DAPI의 파란색 형광 신호와 결합합니다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 핵내 축적에서 녹색 신호가 관찰되었고, 세포와 8시간 동안 PEI/siRNA 인큐베이션 후에 밝은 청록색 신호가 있었는데, 이는 PEI/siRNA가 리소좀에서 탈출했음을 나타낸다. 그러나 PEG-GO-PEI-FA 및 PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 2 h 일찍 핵을 침투하는 약한 녹색 신호를 보였고 배양 시간이 증가함에 따라 핵에 녹색 신호가 축적되었습니다. 그리고 PEG-GO-PEI-FA와 PEG-GO-PEI-FA/siRNA를 세포와 함께 4시간 동안 배양했을 때 밝은 청록색 신호가 있었습니다(그림 5b, c). 이는 물질이 너무 일찍 리소좀에서 빠져나갔음을 나타냅니다. 한 마디로, 이러한 결과는 PEG-GO-PEI-FA 및 PEG-GO-PEI-FA/siRNA가 우수한 엔도솜 또는 리소좀 탈출능을 유지하고 시험관 내에서 리소좀 탈출 및 유전자 형질감염을 효율적으로 촉진할 수 있음을 보여주었다.
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CLSM에 의해 관찰된 PEG-GO-PEI-FA의 세포 내재화 및 리소좀 탈출. a와 함께 배양된 SKOV3 난소암 세포 PEI, b PEG-GO-PEI-FA 및 c 0.5, 1, 2, 4 및 8 h에 대한 PEG-GO-PEI-FA. 파란색은 DAPI로 염색된 핵, 녹색은 FITC로 표지된 나노복합체, 빨간색은 LysoTracker red로 염색한 후 엔도솜과 리소좀 형광을 나타냅니다. 눈금 막대는 100 μm를 나타내지만 눈금 막대는 단일 셀에서 10 μm입니다.
현재의 경우, PEG-GO-PEI-FA/siRNA의 치료 효과를 시험관 내 SKOV3 세포에 대한 CCK-8 assay로 조사하였다. 도 6a에 나타난 바와 같이, PEG-GO-PEI-에서 다양한 농도(10–100 μg/mL)와 다른 시점(12 및 24 h)에서 종양 세포의 생존율에 유의한 영향을 발견하지 못했습니다. FA그룹. 100 μg/mL 이상의 농도에도 불구하고 종양 세포의 생존율은 여전히 80% 이상이었습니다. 그래서 우리는 다음 세포 억제 연구를 위해 100 μg/mL를 선택했습니다. PEG-GO-PEI/siRNA군과 Lipo2000/siRNA군에서 세포독성이 약했다(저해율 20% 미만). PEG-GO-PEI/siRNA 및 Lipo2000/siRNA와 비교하여 PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 SKOV3 종양 세포의 성장에 유의한 억제 효과가 있었습니다. PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 시간 의존적으로 SKOV3 세포를 억제했다(그림 6b). 이러한 결과는 PEG-GO-PEI-FA/siRNA가 종양 세포 증가에 대한 최고의 억제 효과를 나타내었고 PEG-GO-PEI-FA를 유전자 전달을 위한 이상적인 나노캐리어로 사용할 수 있음을 나타냅니다.
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In vitro cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA in ovarian cancer SKOV3 cells via CCK-8 assay. 아 SKOV3 cells were treated with PEG-GO-PEI and PEG-GO-PEI-FA at different concentrations (10–500 μg/mL) at 12 and 24 h to get the optimal dose of nanocarrier. ㄴ The cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA, PEG-GO-PEI/siRNA, and Lipo2000/siRNA were measured in different time points (4–48 h) at 100 μg/mL. Error bars represent ± SD; *p <0.05 (Student’s t test)
In this study, we successfully synthesized a novel gene delivery system, PEG-GO-PEI-FA. The not cytotoxic by itself and excellent biological compatibility of PEG-GO-PEI-FA guaranteed its prospects as a safe and effective gene delivery vector. PEG-GO-PEI-FA/siRNA nanocomplexes exhibited outstanding physicochemical properties for gene targeting delivery. Moreover, PEG-GO-PEI-FA/siRNA could readily enter SKOV3 ovarian cancer cells and escape from the lysosomes. Cytotoxicity assay demonstrated that PEG-GO-PEI-FA/siRNA had a good inhibition effect on ovarian cancer cells in a time-dependent manner, and it exhibited a higher cytotoxicity effect compared to other groups. On the basis of aforementioned results, PEG-GO-PEI-FA may provide good anticipation as a gene vector for targeted gene delivery and more effective strategy in ovarian carcinoma treatments.
이 연구 동안 생성되거나 분석된 모든 데이터는 이 출판된 기사와 추가 정보 파일에 포함되어 있습니다.
원자력 현미경
Cell counting kit8
Cancer cell line encyclopedia
Confocal laser scanning microscope
4′-6-Diamidino-2-phenylindole
동적 광산란
디메틸설폭사이드
Dulbecco’s phosphate-buffered saline
Ethidium bromide
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide hydrochloride
엽산
태아 소 혈청
Fluorescein isothiocyanate
푸리에 변환 적외선 분광기
Folate receptor
Gene expression profiling interactive analysis
산화 그래핀
Molecular weight cutoff
Nanoscale graphene oxide
아니 -hydroxysuccinimide
나노입자
Phosphate-buffered solution
다분산 지수
폴리에틸렌 글리콜
Polyethyleneimine
Small interfering RNA
나노물질
초록 빠르고 통제할 수 없는 세포 성장이 합병증과 조직 기능 장애를 일으키는 질병인 암의 유병률 증가는 과학자와 의사의 심각하고 긴장된 우려 중 하나입니다. 오늘날 암 진단과 특히 그 효과적인 치료는 지난 세기 건강과 의학의 가장 큰 과제 중 하나로 여겨져 왔습니다. 약물 발견 및 전달의 상당한 발전에도 불구하고 일반적으로 건강한 조직 및 기관에 손상을 일으키는 많은 부작용과 부적절한 특이성 및 민감도가 약물 사용에 큰 장벽이 되어 왔습니다. 이들 치료제의 투여 기간과 양에 대한 제한도 도전적이다. 반면에, 화학 요법 및 방사선
초록 최근에, 암 약물을 위한 나노캐리어 시스템, 특히 GO 기반 약물 전달 시스템은 암 환자에게 혜택이 되고 있습니다. 이 연구에서 우리는 생체 적합성을 향상시키기 위해 GO 표면을 기능화하기 위해 타우를 선택합니다. 첫째, 변형된 Hummer의 방법과 초음파 스트리핑 방법으로 나노크기의 GO를 합성하였다. 타우린으로 변형된 산화 그래핀 담체(Tau-GO)는 제타 전위가 − .8 mV이고 입자 크기가 242 nm인 물에 대한 분산성과 안정성이 좋은 Tau-GO를 얻기 위해 화학적 방법으로 합성되었습니다. 캡슐화 효율 평가 기준에
