엽산 기능화 그래핀 옥사이드/PEI 나노복합체를 이용한 난소암 표적 siRNA 전달

요약

유전자 치료는 소간섭 RNA(siRNA)를 포함해 난소암 치료의 유효한 방법으로 부상하고 있습니다. 그러나 효율적인 표적 유전자 전달 시스템의 부재가 유전자 치료 발전을 심각하게 저해하고 있습니다. 본 연구에서는 그래핀 옥사이드(GO)를 기능화해 새로운 유전자 벡터 PEG-GO-PEI-FA를 합성했습니다. 여기에 엽산(FA)을 도입해 난소암에서 과발현되는 엽산 수용체(FR)에 특이적으로 결합하도록 했습니다. 나노복합체는 동적 광산란(DLS), 원자현미경(AFM), 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)으로 특성 분석했습니다. siRNA 응축 능력과 안정성은 아가로스 겔 전기영동으로 평가했습니다. 난소암 세포에서의 세포 흡수 효율과 라이소좀 탈출 능력은 공초점 레이저 현미경으로 조사했습니다. 시스템의 세포 생체안전성과 siRNA 내성은 CCK-8 분석으로 평가했습니다. PEG-GO-PEI-FA 나노복합체 크기는 216.1±2.457 nm로 난소암 세포에서 경미한 세포독성을 보였습니다. 높은 흡수 효율로 라이소좀에서 빠르게 탈출해 유전자를 방출했습니다. 또한 PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 난소암 세포 성장을 효과적으로 억제했습니다. 전반적으로 PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 FR 양성 난소암종 또는 유사 종양 치료에서 siRNA 전달을 위한 유망한 전략을 제시할 수 있습니다.

서론

난소암은 전 세계적으로 산부인과 암 사망의 주요 원인이며, 조기 진단과 치료의 어려움으로 예후가 불량합니다[1-3]. 기존 화학요법제는 비특이적 분포, 낮은 생체이용률, 빠른 혈중 청소율, 생리 환경에서의 낮은 용해도 등 고유한 한계가 있습니다[4]. 지난 수십 년간 유전자 치료는 암을 포함한 다양한 유전 질환 치료의 잠재적 접근법으로 연구돼 왔습니다[5-8]. 그러나 안전하고 고효율적이며 선택적인 유전자 전달 캐리어의 부재가 임상 적용을 가로막고 있습니다. 현재 유전자 벡터는 바이러스 벡터와 비바이러스 벡터 두 종류로 나뉩니다. 바이러스 벡터는 높은 형질도입 효율을 보이지만 심각한 면역 염증 반응, 야생형 바이러스와의 재조합 위험 등 단점이 임상 적용을 제한합니다[9, 10]. 반면 비바이러스 벡터는 광범위한 전달 용량, 낮은 면역원성, 구조적 유연성으로 바이러스 벡터의 훌륭한 대안입니다[11-13]. 나노기술의 급속한 발전으로 많은 나노입자가 유전자 전달 캐리어로 탐구돼 왔습니다[14, 15]. 본 연구에서는 종양 조직에 효율적으로 전달될 수 있는 새로운 비바이러스 벡터 PEG-GO-PEI-FA를 설계했습니다.

그래핀 옥사이드(GO)는 흑연을 다단계 산화, 초음파 처리, 정제해 생산한 흑연 유도체입니다[16]. GO 표면에는 에폭시, 수산기, 카복실기가 존재합니다[17]. 표면의 산소 작용기는 GO에 우수한 생체적합성을 부여해 물과 유기 용매에서 안정한 현탁액을 형성하게 하며, 화학적 변형과 기능화를 용이하게 합니다[18, 19]. 따라서 GO는 광열 암 치료, 약물 및 유전자 전달, 바이오센서 등에 널리 활용돼 왔습니다[20-22]. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 안전하고 무독성이며 생분해되는 소재로, 미국 FDA에서 친수성 약물 캐리어로 승인받았습니다[23]. GO에 PEG를 기능화하면 생리 조건에서 안정성을 높이고, 체내 순환 시간을 연장하며, 약물동태학을 개선해 종양 표적화를 향상시킵니다[24, 25]. 폴리에틸렌이민(PEI)은 다양한 세포주에서 높은 형질도입 효율로 비바이러스 벡터의 골드 스탠다드가 됐습니다[26]. 그러나 PEI는 심각한 세포독성과 낮은 생체적합성으로 임상 적용이 제한됩니다. 본 연구에서는 PEI를 GO 표면에 접목했을 때 세포독성이 유의하게 감소함을 관찰했습니다. 엽산 수용체는 다양한 암세포 표면에서 과발현되며, 특히 화학요법 전후 난소암 세포에서 두드러집니다[27]. 표적 유전자 전달을 위해 엽산 분자를 GO에 공유결합시켜 엽산 수용체를 표적화했습니다.

전반적으로 본 연구의 주된 목적은 siRNA 기반 유전자 치료의 난소암 적용성을 높이기 위한 새로운 표적 GO 기반 유전자 전달 시스템을 탐구하는 것입니다. 양전하를 띤 PEG-GO-PEI-FA는 siRNA를 탑재해 유전자 전달에 활용할 수 있습니다. 성공적인 합성, 특성 분석, 효과적인 세포 내재화, 체외 항암 효과를 다양한 기법으로 분석했습니다. 또한 이 시스템의 안전성도 체외에서 평가했습니다.

재료 및 방법

재료

그래핀 옥사이드는 Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd.(중국 쑤저우)에서 구매했습니다. 엽산(FA), N-하이드록시석시니미드(NHS), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)는 Sigma Aldrich Trading Co. Ltd.(중국 상하이)에서 구매했습니다. 분지형 PEI 25K, PEG(분자량 2000), 아가로스, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸 카보디이미드 염산염(EDC·HCl)은 Adama Reagent Co. Ltd.(중국 상하이)에서 구매했습니다. 인산완충액(PBS), 둘베코 인산완충염수(DPBS) 및 기타 모든 시약은 Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.(중국 상하이)에서 구매했습니다. 모든 시약은 시약 등급입니다. RPMI-1640 배지(Gibco), 태아소혈청(FBS)(Gibco), 트립신(Gibco), 20× TAE 완충액은 Thermo Fisher Scientific Co. Ltd.(중국)에서 구매했습니다. Cell counting kit-8(CCK-8)은 Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd.(중국 상하이)에서 구매했습니다. LysoTracker Red, 4% 파라포름알데히드, 4′-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI), Lipofectamine 2000 형질도입 시약은 Invitrogen Co. Ltd.(중국)에서 구매했습니다. Dil 형광 프로브(Cat No. C1036)는 Beyotime Co. Ltd.에서 구매했습니다. Anti-PLK1(PLK1-homo-581) siRNA는 Shanghai GenePharma Co. Ltd.(중국 상하이)에서 합성했습니다.

PEG-GO-PEI-FA 제조

PEG-GO-PEI-FA 합성은 그림 S2(A)의 전략에 따릅니다. 먼저 10 mL GO 수용액(1000 μg/mL)을 50 W에서 2시간 연속 욕조 초음파 처리했습니다. 이어서 1 mL EDC·HCl(5000 μg/mL)과 NHS(5000 μg/mL)를 첨가하고 100 W에서 30분 간헐적 초음파 처리한 뒤, PEG(10 mg)를 첨가해 30분 초음파 처리하고 0°C에서 6시간 자기교반했습니다. 미반응 시약을 제거하고 GO-PEG 용액을 얻기 위해 투석막(MWCO 3500 Da)을 사용해 증류수에서 24시간 투석했습니다. GO-PEG 용액을 30분 초음파 처리한 뒤 다시 1 mL EDC·HCl(5000 μg/mL)과 NHS(5000 μg/mL)를 첨가해 30분 초음파 처리하고, PEI 25K(5000 μg/mL) 2 mL를 첨가했습니다. 30분 초음파 처리 후 0°C에서 6시간 교반했습니다. 이후 투석막(MWCO 3500 Da)으로 증류수에서 24시간 투석해 PEG-GO-PEI를 얻었습니다. PEG-GO-PEI 용액을 60분 초음파 처리하고, 1 mL EDC·HCl(5000 μg/mL)과 NHS(5000 μg/mL)를 첨가해 30분 초음파 처리한 뒤 10 mg FA를 첨가했습니다. 30분 초음파 처리 후 0°C에서 12시간 교반하고 48시간 투석해 앞서와 같은 절차로 PEG-GO-PEI-FA를 얻었습니다. 나노복합체 용액은 진공 동결건조기(Biosafer-10D)로 건조했습니다.

특성 분석

나노복합체의 표면 제타 전위와 평균 입자 크기는 동적 광산란(DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, 영국)으로 측정했습니다. 나노복합체의 형태는 대기 중 원자현미경(AFM, MultiMode Nanoscope IIIa, 독일)으로 관찰했습니다. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 스펙트럼은 Thermo Nicolet 6700 FTIR 분광계로 KBr 펠릿법을 사용해 400-4000 cm⁻¹ 범위에서 측정했습니다. 나노복합체의 UV-Vis 흡수 스펙트럼은 UV-Vis 분광광도계(UV, EV300, 미국)로 측정했습니다. 라만 스펙트럼은 분산 라만 현미경(Senterra R200-L, 독일)으로 532 nm 여기 파장에서 측정했습니다.

체외 생체안전성 분석

SKOV3(인간 난소암 세포)는 Keygen(중국)에서 구매했습니다. 세포는 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 RPMI-1640 배지에서 37°C, 5% CO₂ 습윤 분위기에서 배양했습니다. 본 연구에서는 CCK-8 분석으로 SKOV3 세포에서 물질의 세포독성을 분석했습니다. 간단히, 세포를 96웰 플레이트에 6×10³ cells/well 밀도로 100 μL 10% FBS 함유 1640 배지에 파종하고 37°C에서 12시간 배양했습니다. 이후 GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA를 최종 농도 10-1000 μg/mL 범위에서 첨가하고 추가 12시간 배양했습니다. 또 다른 실험에서는 100 μg/mL 농도에서 4-24시간 배양했습니다. 이후 각 웰에 10 μL CCK-8을 첨가하고 37°C에서 3시간 배양했습니다. 마이크로플레이트 리더로 450 nm에서 흡광도를 측정했습니다. 각 실험은 3회 반복했습니다. 상대 세포 생존율(%)은 (시료 흡광도 - 블랭크 흡광도)/(대조군 흡광도 - 블랭크 흡광도) × 100%로 계산했습니다.

아가로스 겔 지연 분석

20× TAE 완충액을 DEPC 처리수로 희석해 1% 아가로스 용액을 만들었습니다. 전자레인지로 5분 가열해 아가로스를 완전히 녹였습니다. 아가로스 용액 온도가 55°C로 내려가면 에티디움 브로마이드(EB, 0.5 μg/mL) 용액을 10,000:1 부피비로 첨가해 균일하게 혼합한 뒤 냉각해 아가로스 겔을 형성했습니다. PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA, siRNA 혼합물을 서로 다른 중량비로 웰에 넣었습니다. 겔을 110 V, 40 mA에서 약 60분간 전기영동한 후 자외선 이미저로 관찰·분석했습니다.

PEG-GO-PEI-FA 세포 흡수 연구

세포 흡수를 조사하기 위해 나노복합체를 선행 방법[28]에 따라 약간 수정해 FITC로 표지했습니다. 간단히, 나노복합체 용액(약 1 mg/mL, 2.0 mL)을 DMSO에 녹인 0.2 mL FITC(26 mM)와 혼합하고 실온에서 하룻밤 교반했습니다. 혼합물을 5000 MWCO 투석막으로 투석해 표지되지 않은 FITC를 제거하고 동결건조했습니다. 세포를 6웰 플레이트(커버슬립 포함)에 2×10⁵ cells/well 밀도로 2 mL 10% FBS 함유 1640 배지에 파종하고 37°C에서 12시간 배양했습니다. 각 웰의 배지를 무혈청 1640 배지로 교체했습니다. 이후 세포를 다양한 나노복합체/FITC로 처리했습니다. 나노복합체 없이 처리한 세포를 대조군, PEI 25K로 처리한 세포를 평행 대조군으로 했습니다. 37°C, 5% CO₂ 습윤 분위기에서 4시간 배양 후 배양액을 제거하고 차가운 DPBS(pH 7.4)로 2회 세척했습니다. 각 웰에 20 μL DAPI와 5 μL Dil(세포막 염료)을 첨가하고 37°C 암소에서 20분 배양했습니다. 이후 DAPI와 Dil을 제거하고 차가운 DPBS(pH 7.4)로 2회 세척한 뒤 커버슬립을 꺼내 Permount™ 마운팅 미디엄으로 유리 슬라이드에 고정했습니다. 공초점 레이저 현미경(CLSM)으로 세포 슬라이드의 형광 신호를 관찰하고 나노복합체의 세포 흡수를 분석했습니다.

엔도좀 탈출 및 핵 침투

세포 내 분포, 엔도좀 탈출, 나노복합체 핵 침투를 시각화하기 위해 SKOV3 세포를 12웰 플레이트(커버슬립 포함)에 1×10⁵ cells/well 밀도로 2 mL 10% FBS 함유 1640 배지에 파종하고 12시간 배양했습니다(37°C, 5% CO₂). 각 웰의 배지를 1 mL/well 무혈청 1640 배지로 교체했습니다. 이후 다양한 나노복합체(100 μg/mL)를 FITC 표지해 1 mL/well씩 12웰 플레이트에 첨가했습니다. 6시간 후 배양액을 제거하고 차가운 DPBS(pH 7.4)로 2회 세척한 뒤 12웰 플레이트에 LysoTracker Red(5 μg/mL) 50 μL/well을 첨가했습니다. 37°C, 5% CO₂ 습윤 분위기에서 15분 배양 후 배양액을 제거하고 차가운 DPBS(pH 7.4)로 2회 세척했습니다. 각 웰에 20 μL DAPI를 첨가하고 4°C 암소에서 20분 배양했습니다. 이후 DAPI를 제거하고 차가운 DPBS(pH 7.4)로 2회 세척한 뒤 4% 파라포름알데히드로 실온에서 15분 고정했습니다. 커버슬립을 꺼내 Permount™ 마운팅 미디엄으로 유리 슬라이드에 고정했습니다. 공초점 레이저 현미경으로 형광 신호를 관찰하고 나노복합체의 라이소좀 탈출과 핵 침투를 분석했습니다[29].

세포 억제 분석

CCK-8 분석으로 PEG-GO-PEI/siRNA와 PEG-GO-PEI-FA/siRNA의 세포 억제 효과를 분석했습니다. 간단히, 세포를 96웰 플레이트에 6×10³ cells/well 밀도로 100 μL 10% FBS 함유 1640 배지에 파종하고 37°C에서 12시간 배양했습니다. 이후 PEG-GO-PEI와 PEG-GO-PEI-FA를 최종 농도 10-500 μg/mL 범위에서 첨가하고 추가 12, 24시간 배양했습니다. 이어서 PEG-GO-PEI/siRNA와 PEG-GO-PEI-FA/siRNA를 100 μg/mL 농도에서 4-48시간 배양했습니다. siRNA를 Lipofectamine 2000으로 형질도입한 그룹과 무처리 그룹을 대조군으로 했습니다. 이후 각 웰에 10 μL CCK-8을 첨가하고 37°C에서 3시간 배양했습니다. 450 nm에서 흡광도를 측정했습니다. 각 실험은 3회 반복했습니다. 억제율(%)은 1 - (시료 흡광도 - 블랭크 흡광도)/(대조군 흡광도 - 블랭크 흡광도) × 100%로 계산했습니다.

통계 분석

각 실험은 3회 반복했으며, 데이터는 SPSS 17.0 소프트웨어로 분석했습니다. 다군 분석에는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA), 두 군 분석에는 비대응 Student's t-검정을 사용했습니다. 데이터는 평균±표준편차(SD)로 표현했으며, 통계적 유의수준은 p<0.05로 설정했습니다.

결과 및 논의

PEG-GO-PEI-FA 합성

먼저 Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE; https://portals.broadinstitute.org/ccle) 데이터베이스[30]와 Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA2; https://gepia2.cancer-pku.cn) 데이터베이스[31]를 기반으로 다양한 암세포주와 난소 조직에서 FR 발현을 분석했습니다. 결과는 선행 연구와 일치했습니다(그림 S1). 따라서 FA를 유전자 전달용 표적 리간드로 선택했습니다.

그래핀 옥사이드는 산화 공정으로 가장자리에 카복실기, 기저면에 수산기와 에폭시기를 다수 포함합니다[32]. 나노스케일 GO(NGO)를 얻기 위해 GO를 50 W에서 2시간 욕조 초음파 처리해 연속적으로 분해한 뒤, EDC/NHS 화학을 사용해 PEG/PEI/FA를 GO에 공유결합했습니다(그림 S2(A) 참조). 그림 S2(B)는 PEG-GO-PEI-FA/siRNA 처리 경로를 보여줍니다. 화학적 접합 분석은 FTIR 차분 스펙트럼 기술로 수행해 스펙트럼 흡수 피크를 얻었습니다[33]. 그림 1a에서 GO에 OH(3425 cm⁻¹), C=O(1719 cm⁻¹), C-H(1350 cm⁻¹) 작용기가 존재함이 확인돼 GO 표면에 수산기와 카복실기가 있음을 나타냅니다. PEG가 GO와 안정적인 공유결합으로 반응할 때 CH(2885 cm⁻¹) 신축 진동대가 관찰돼 PEG가 GO에 접목됐음을 보여주며, PEG 접합 효율은 약 6%였습니다. PEI와 FA가 GO와 반응한 후 NH(1590 cm⁻¹), C-N(1420 cm⁻¹) 신축 진동대가 관찰돼 PEI와 FA가 에스테르화로 GO에 접목됐음을 나타냅니다. 이 결과들은 PEG-GO-PEI-FA 접합체가 성공적으로 합성됐음을 입증합니다.

그림 1b는 GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 보여줍니다. GO는 223 nm에서 흡수 피크를 가집니다. FA는 275 nm에서 흡수 피크를 가집니다. GO-PEG는 완만한 곡선을 보여 PEG가 GO와 결합해 GO의 피크를 평탄화시켰음을 나타냅니다. PEG-GO-PEI는 219 nm에서 흡수 피크를 보여 PEI가 GO-PEG 표면에 접목됐음을 나타냅니다. PEG-GO-PEI-FA는 219 nm와 275 nm에서 흡수 피크를 보여 FA가 PEG-GO-PEI에 접목됐음을 입증합니다. 이 모든 결과가 PEG-GO-PEI-FA의 성공적 합성을 추가로 뒷받침합니다.

PEG-GO-PEI-FA 특성 분석

표 1에 나노복합체의 입자 크기와 제타 전위 데이터가 나와 있습니다. 나노복합체 입자 크기는 PEG, PEI, FA가 GO 표면에 점진적으로 접목되면서 218.4 nm로 증가했습니다. 제타 전위는 PEI가 GO에 연결되면서 -16.5 mV에서 +17.5 mV로 변해, 음전하 DNA나 RNA를 정전기적 상호작용으로 흡착하고 세포 흡수를 촉진하는 능력을 부여했습니다. PEG-GO-PEI-FA와 PEG-GO-PEI-FA/siRNA의 제타 전위는 각각 +14.7 mV, +14.5 mV로, FA와 siRNA의 음전하 때문에 PEG-GO-PEI보다 낮았습니다. 이는 PEG-GO-PEI-FA/siRNA가 전하 상호작용으로 세포 표면에 흡착되고 세포막의 수용체 매개 내포작용으로 이용될 수 있음을 시사합니다[34].

나노캐리어의 표면 형태와 입자 크기는 AFM과 DLS로도 측정했습니다. 그림 2a에서 GO는 입자 크기 192.1 nm의 매끄러운 표면과 시트 구조를 보입니다. PEG, PEI, FA가 GO 표면에 접목된 후 PEG-GO-PEI-FA의 입자 크기는 216.1 nm로 증가했고, 표면에 많은 돌기가 관찰됐습니다(그림 2b). 이는 다수의 장식이 GO 시트에 고정됐음을 시사합니다. 동시에 PEG-GO-PEI-FA의 높이는 GO보다 높은데, 이는 PEG, PEI, FA가 GO 시트 양면에 부착됐기 때문입니다.

라만 분광법은 나노탄소 소재의 특성 및 구조적 특성 분석에 가장 흔히 사용되는 방법 중 하나입니다[35]. 그림 2c에서 GO의 라만 스펙트럼은 1600 cm⁻¹(G 밴드)과 1354 cm⁻¹(D 밴드)에서 진동대를 보이며, ID/IG 면적비는 1.0385로 GO의 일부 sp² 혼성화가 깨지고 수산기와 카복실기가 형성됐음을 나타냅니다. GO-PEG와 PEG-GO-PEI는 1595 cm⁻¹(G 밴드)과 1352 cm⁻¹(D 밴드)에서 진동대를 보이며, ID/IG 면적비는 각각 0.7737, 0.5238입니다. PEG와 PEI가 GO와 반응함에 따라 ID/IG 면적비가 점차 감소해 PEG와 PEI가 GO 표면에 접목됐음을 나타냅니다.

다양한 기능성 NGO의 체외 생체안전성 분석

비바이러스 유전자 벡터의 생체안전성 문제는 임상 적용의 중요한 과제로 남아 있습니다. 높은 양전하는 유전자 응축 및 보호 능력을 부여하지만 동시에 심각한 세포독성을 초래합니다[36, 37]. 자유 siRNA 나노복합체의 세포독성을 테스트하기 위해 SKOV3 세포를 4, 8, 12, 24시간 동안 다양한 농도(10-1000 μg/mL)의 자유 나노복합체와 배양하며 CCK-8 분석을 수행했습니다. 그림 S3에서 볼 수 있듯 나노복합체는 1000 μg/mL, 24시간에서도 난소암 세포에서 높은 세포 생존율을 보였습니다. 모든 나노복합체의 세포독성은 시간 및 농도 의존적으로 나타났습니다(SKOV3 세포 생존율: 모든 나노복합체에서 1000 μg/mL 시 ≥84.38%, 24시간 시 ≥94.21%). 이 결과들은 나노복합체가 무시할 만한 세포독성을 보이며 생체적합성 유전자 벡터로 활용될 수 있음을 시사합니다.

siRNA 결합 나노복합체 분석

자유 RNA 분자의 세포 흡수는 상당한 음전하로 인해 일반적으로 어렵습니다[38]. 양이온성 고분자로 음전하 생체분자를 탑재하는 것이 이 문제의 일반적인 해결책입니다[39]. 본 연구에서는 siRNA를 PEG-GO-PEI-FA 벡터에 수용액에서 혼합해 탑재했습니다. 표 1에서 PEG-GO-PEI-FA의 제타 전위는 +14.7 mV로, siRNA가 정전기적 상호작용으로 PEG-GO-PEI-FA 표면에 흡착될 수 있음을 나타냅니다. 본 연구에서는 아가로스 겔 전기영동으로 나노복합체의 유전자 응축 능력을 평가했습니다[40]. 그림 3a에서 PEG-GO-PEI는 중량비 10에서 siRNA에 대한 명백한 응축 능력을 보였습니다. PEG-GO-PEI-FA는 중량비 20에 도달했을 때 siRNA 이동의 완전한 지연이 관찰됐습니다(그림 3b). 따라서 PEG-GO-PEI-FA는 siRNA를 분해로부터 보호할 수 있지만, 동시에 좋은 결합 능력을 보이기 위해 약간 더 많은 나노복합체가 필요합니다. 이는 PEG-GO-PEI-FA의 제타 전위가 그리 높지 않기 때문일 수 있습니다. 이 결과들은 PEG-GO-PEI와 PEG-GO-PEI-FA가 충분한 전달 능력을 가지며, 특히 PEG-GO-PEI-FA가 효율적이고 안전한 유전자 전달을 위한 유효한 벡터로서 잠재력을 추가로 보여줍니다.

세포 흡수 분석

캐리어가 종양을 특이적으로 표적화할 수 있는지는 유전자 전달에 매우 중요합니다. PEG-GO-PEI-FA 캐리어가 세포에 쉽게 들어갈 수 있는지 확인하기 위해 FITC를 형광 프로브로 사용해 세포 내 이미징을 수행했습니다. 동시에 핵은 DAPI로, 세포막은 Dil로 염색했습니다. 그림 4에서 대조군과 PEG-GO-PEI 그룹은 핵과 세포막 주변에 녹색 형광 신호를 보이지 않았습니다. 이는 PEG-GO-PEI가 세포에 들어가지 않았음을 의미합니다. PEI 25K와 PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 핵 주변에 녹색 형광 신호로 나타나 PEG-GO-PEI-FA가 세포막을 관통해 세포 내로 들어갈 수 있음을 명확히 보여줍니다. PEG-GO-PEI-FA 나노복합체가 가장 활발한 세포 흡수를 보였는데, 이는 FA가 SKOV3 세포 표면에서 과발현된 FR에 특이적으로 결합하기 때문일 수 있습니다. 이 결과들은 FA가 PEG-GO-PEI-FA와 PEG-GO-PEI-FA/siRNA 나노복합체의 효율적인 세포 흡수를 매개하는 데 결정적 역할을 함을 시사합니다. 더 중요하게는, FA의 수용체 결합 능력이 공유 아미드 결합에 의해 영향을 받지 않고 수용체 매개 내포작용이 방해받지 않음을 확인했습니다.

라이소좀 탈출 분석

siRNA 전달 시스템은 엔도좀이나 형성된 라이소좀에서 탈출해야 합니다. 그렇지 않으면 siRNA가 분해되거나 세포 밖으로 배출됩니다[41-43]. 공초점 레이저 현미경을 이용해 나노복합체의 세포 내 국소화를 통해 엔도좀 탈출 능력을 평가했습니다. 많은 보고에서 PEI 25K가 '프로톤 스펀지 효과'로 엔도좀/라이소좀 탈출을 촉진함이 입증돼[44], PEI 25K를 대조군으로 사용했습니다. 본 연구에서는 나노복합체를 FITC로 표지했습니다. 먼저 FITC의 녹색 형광 신호와 LysoTracker Red의 적색 형광 신호가 겹쳐 노란색 신호가 나타나는지 확인해 나노복합체가 라이소좀에 진입했는지 추정했습니다. PEI 25K는 세포와 4시간 배양 후 노란색 신호로 나타났고, 다른 물질들은 2시간 배양 후 노란색 신호로 나타나 물질들이 세포 내로 진입했음을 보여줍니다(그림 5). 나노복합체가 라이소좀에서 탈출했는지는 밝은 청색 신호, 즉 FITC의 녹색 형광과 DAPI의 청색 형광이 결합돼 나타나는지로 판단했습니다. 그림 5a에서 PEI/siRNA는 8시간 배양 후 핵에 녹색 신호가 축적되고 밝은 청색 신호가 나타나 라이소좀에서 탈출했음을 나타냅니다. 그러나 PEG-GO-PEI-FA와 PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 2시간부터 핵에 약한 녹색 신호가 침투했고, 배양 시간이 늘어남에 따라 핵에 더 많은 녹색 신호가 축적됐습니다. 4시간 배양 시 밝은 청색 신호가 나타났습니다(그림 5b, c). 이는 물질들이 매우 일찍 라이소좀에서 탈출했음을 나타냅니다. 요약하면, PEG-GO-PEI-FA와 PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 우수한 엔도좀/라이소좀 탈출 능력을 유지하며 체외에서 라이소좀 탈출과 유전자 형질도입을 효율적으로 촉진할 수 있습니다.

PEG-GO-PEI-FA/siRNA 세포 억제 평가

현재 사례에서 PEG-GO-PEI-FA/siRNA의 치료 효과를 SKOV3 세포에서 CCK-8 분석으로 체외 평가했습니다. 그림 6a에서 PEG-GO-PEI-FA 그룹은 다양한 농도(10-100 μg/mL)와 시간(12, 24시간)에서 종양 세포 생존율에 유의한 영향을 주지 않았습니다. 농도가 100 μg/mL를 넘어도 종양 세포 생존율은 80% 이상이었습니다. 따라서 이후 세포 억제 연구에 100 μg/mL를 선택했습니다. PEG-GO-PEI/siRNA와 Lipo2000/siRNA 그룹은 더 약한 세포독성을 보였습니다(억제율 20% 미만). PEG-GO-PEI/siRNA와 Lipo2000/siRNA에 비해 PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 SKOV3 종양 세포 성장에 유의한 억제 효과를 보였습니다. PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 시간 의존적으로 SKOV3 세포를 억제했습니다(그림 6b). 이 결과들은 PEG-GO-PEI-FA/siRNA가 종양 세포 증식 억제에 최적의 효과를 보이며, PEG-GO-PEI-FA를 이상적인 유전자 전달 나노캐리어로 사용할 수 있음을 시사합니다.

결론

본 연구에서 새로운 유전자 전달 시스템 PEG-GO-PEI-FA를 성공적으로 합성했습니다. 자체적으로 세포독성이 없고 우수한 생체적합성을 가진 PEG-GO-PEI-FA는 안전하고 효과적인 유전자 전달 벡터로서의 전망을 보장합니다. PEG-GO-PEI-FA/siRNA 나노복합체는 유전자 표적 전달을 위한 탁월한 물리화학적 특성을 보였습니다. 또한 PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 SKOV3 난소암 세포에 쉽게 들어가 라이소좀에서 탈출할 수 있습니다. 세포독성 분석에서 PEG-GO-PEI-FA/siRNA는 시간 의존적으로 난소암 세포에 좋은 억제 효과를 보였으며, 다른 그룹에 비해 더 높은 세포독성 효과를 나타냈습니다. 앞서 언급한 결과를 종합할 때, PEG-GO-PEI-FA는 표적 유전자 전달을 위한 유전자 벡터로서, 난소암종 치료에서 더 효과적인 전략으로서 좋은 기대를 제공할 수 있습니다.